專利名稱：一種玻璃化凍存液的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種組織和器官保存用的玻璃化凍存液。
技術背景低溫保存生物材料，特別是組織和器官，是低溫生物學領域 研究的重要目標之一。目前，細胞和胚胎等簡單組織的低溫保存 已經(jīng)取得了明顯的效果，但是復雜組織和器官的保存還存在一定 程度的局限。原因是當?shù)蜏刈饔糜谏矬w吋，其內部不可避免地 發(fā)生水的結冰，不論是細胞內結冰還是細胞外結冰，都會導致細胞活性和功能的喪失，并且在-15—-5(TC這個溫度區(qū)間內，細胞內 外極易形成大量冰晶從而導致細胞失活。在冷凍和復溫過程中， 細胞必須兩次通過這一危險溫度區(qū)間。因此，有效保護細胞安全 通過這一溫區(qū)，避免冰晶形成造成的損傷，是生物材料成功保存 的關鍵。玻璃化是指液態(tài)轉變?yōu)榉蔷B(tài)的固化過程。玻璃化方法就是 在完全玻璃化狀態(tài)下保存生物材料的一種方法。玻璃態(tài)固體能保 持液態(tài)時正常的分子和離子分布，可以避免因結冰對生物材料造 成的物理性損傷。在可實現(xiàn)的降溫速率下，玻璃化法需使用多種防凍劑配成高濃度的玻璃化溶液，當溫度降低后，整個溶液變得 非常粘稠，最終進入一種玻璃化狀態(tài)。玻璃化方法操作簡單快速， 是一種非常有前景的低溫保存方法。玻璃化方法己經(jīng)成功用于胚 胎等簡單組織的保存，但目前還不能確定能否最終解決組織和器 官的保存。低溫保護劑分為滲透性和非滲透性兩大類。滲透性防凍劑多 是一些低分子量的中性物質，它們能滲入細胞內部，降低冰點、 減少冰晶形成、稀釋溶液中電解質的濃度、減少溶質損傷、平衡 細胞內外滲透壓和減輕細胞縮水程度。常用的滲透性防凍劑主要 有甘油、二甲基亞砜、乙二醇和丙二醇等小分子多羥基醇。非滲 透性防凍劑的分子量較大，不能進入細胞內部，它們通過稀釋細 胞外電解質的濃度減少溶質損傷，通過減少細胞外自由水含量以 達到減少胞外冰晶的損傷。常用的非滲透性防凍劑有蔗糖、葡萄 糖、海藻糖、牛血清蛋白、白蛋白、透明質酸鈉以及羥乙基淀粉 等。單一的防凍劑各有優(yōu)缺點，不能滿足生物材料低溫保存的多 方面要求，通常情況下采用兩種或兩種以上混合使用。滲透性防 凍劑一般具有毒性作用，非滲透性防凍劑會引起細胞過度縮水， 二者混合使用可以彌補上述缺點，提高保存效果，還能促使溶液 某些熱力學參數(shù)的改變，比如玻璃化溫度升高，玻璃化所需濃度降低等。這些改變對于玻璃化保存生物材料是非常有益的。 發(fā)明內容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術存在的缺點，提供一種同時含 滲透性和非滲透性低溫保護劑，能有效形成低溫玻璃化凍存的玻 璃化凍存液。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案-一種玻璃化凍存液，每100毫升溶液中含有 聚乙烯醇0.1 5克 二甲基亞砜 1 30克 1，2-丙二醇 1 30克 余量為水。其優(yōu)選的比例是每100毫升溶液中含有聚乙烯醇 1 5克 二甲基亞砜 10 20克 1，2-丙二醇 10 20克余量為水。本發(fā)明選擇二甲基亞砜(DMSO)和1，2-丙二醇(PE)為滲透性 防凍劑，選擇與防凍蛋白有相似的、能夠阻止冰晶生長并抑止重 結晶特點的聚乙烯醇(PVA)為非滲透性防凍劑，形成一種多組分的玻璃化凍存液。此多組分的玻璃化凍存液體系具有較強的玻璃化 能力，表現(xiàn)在降溫過程中易于進入玻璃化狀態(tài)，并只有很少部分 的水形成晶體。同時還需要保證玻璃化溶液在升溫過程中的穩(wěn)定 性，表現(xiàn)在升溫過程中去玻璃化或重結晶延遲，有明顯的重結晶 抑制特性。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果1 .與巳公開的多組分凍存液相比，本發(fā)明的凍存液同時含滲透 性和非滲透性低溫保護劑，尤其采用聚乙烯醇為非滲透性防凍劑 組分，具有明顯的阻止冰晶生長及抑止重結晶作用，可以有效形 成低溫玻璃化凍存效果。2. 本發(fā)明的多組分玻璃化凍存液體系同時考慮了保護劑的毒 性、滲透性、玻璃化能力、玻璃化穩(wěn)定性以及升溫降溫速率等因 素。所以不只在降溫過程中易于進入玻璃化狀態(tài)，而且還能保證 玻璃化溶液在升溫過程中的穩(wěn)定性。而現(xiàn)有凍存技術中玻璃化溶 液從低溫保存狀態(tài)平穩(wěn)復溫到常溫狀態(tài)是較難實現(xiàn)的。3. 本發(fā)明的多組分凍存液具有簡單而且通用的效果，適于各種 細胞、組織及器官的玻璃化凍存。
具體實施方式
實施例1將預先制備好的聚乙烯醇O.lg作為非滲透性防凍劑，將1,2-丙二醇30g和二甲基亞砜30g作為滲透性防凍劑，三個組分混合 即成PVA/DMSO/PE體系，加入水到該體系配成100ml溶液，即 為玻璃化凍存液。實施例2將預先制備好的聚乙烯醇lg作為非滲透性防凍劑，將1，2-丙 二醇20g和二甲基亞砜20g作為滲透性防凍劑，三個組分混合即 成PVA/DMSO/PE體系，加入水到該體系配成100ml溶液，即為 玻璃化凍存液。實施例3將預先制備好的聚乙烯醇2g作為非滲透性防凍劑，將l，2-丙 二醇10g和二甲基亞砜10g作為滲透性防凍劑，三個組分混合即 成PVA/DMSO/PE體系，加入水到該體系配成100ml溶液，即為 玻璃化凍存液。實施例4將預先制備好的聚乙烯醇2g作為非滲透性防凍劑，將1，2-丙 二醇5g和二甲基亞砜25g作為滲透性防凍劑，三個組分混合即成PVA/DMSO/PE體系，加入水到該體系配成100ml溶液，即為玻璃 化凍存液。 實施例5將預先制備好的聚乙烯醇3g作為非滲透性防凍劑，將1，2-丙 二醇25g和二甲基亞砜5g作為滲透性防凍劑，三個組分混合即成 PVA/DMSO/PE體系，加入水到該體系配成100ml溶液，即為玻璃 化凍存液。將預先制備好的聚乙烯醇4g作為非滲透性防凍劑，將1，2-丙 二醇5g和二甲基亞砜5g作為滲透性防凍劑，三個組分混合即成 PVA/DMSO/PE體系，加入水到該體系配成100ml溶液，即為玻璃 化凍存液。實施例7將預先制備好的聚乙烯醇5g作為非滲透性防凍劑，將1，2-丙 二醇lg和二甲基亞砜lg作為滲透性防凍劑，三個組分混合即成 PVA/DMSO/PE體系，加入水到該體系配成100ml溶液，即為玻璃 化凍存液。將預先制備好的聚乙烯醇5g作為非滲透性防凍劑，將1，2-丙二醇30g和二甲基亞砜10g作為滲透性防凍劑，三個組分混合即成PVA/DMSO/PE體系，加入水到該體系配成100ml溶液，即為 玻璃化凍存液。
權利要求
1.一種玻璃化凍存液，其特征在于每100毫升溶液中含有聚乙烯醇 0.1～5克二甲基亞砜 1～30克1，2-丙二醇 1～30克余量為水。
2. 如權利要求1所述的玻璃化凍存液，其特征在于每100毫升溶液中含有:聚乙烯醇 1 5克二甲基亞砜 10 20克1，2-丙二醇 10 20克余量為水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種玻璃化凍存液，其每100毫升溶液中含有聚乙烯醇0.1～5克，二甲基亞砜1～30克，1，2-丙二醇1～30克，余量為水。本發(fā)明的凍存液同時含滲透性和非滲透性低溫保護劑，尤其采用聚乙烯醇為非滲透性防凍劑組分，具有明顯的阻止冰晶生長及抑止重結晶作用，可以有效形成低溫玻璃化凍存效果。本發(fā)明的凍存液考慮了保護劑的毒性、滲透性、玻璃化能力、玻璃化穩(wěn)定性以及升溫降溫速率等因素。所以不只在降溫過程中易于進入玻璃化狀態(tài)，而且還能保證玻璃化溶液在升溫過程中的穩(wěn)定性。本發(fā)明的凍存液具有簡單而且通用的效果，適于各種細胞、組織及器官的玻璃化凍存。
文檔編號A01N1/02GK101253856SQ20081002735
公開日2008年9月3日 申請日期2008年4月11日 優(yōu)先權日2008年4月11日
發(fā)明者呂樹申, 王海燕 申請人:中山大學