專利名稱：北五味子誘導(dǎo)不定芽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的組織培養(yǎng)方法，具體是一種北五味子誘 導(dǎo)不定芽的方法。
技術(shù)背景組織培養(yǎng)是加速植物繁殖、創(chuàng)造優(yōu)良品種的一種行之有效的方法，為農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)提供許多優(yōu)良的新品種，也為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)工廠化提供了廣闊的前景。MS培養(yǎng)基， 6-BA， NAA， ZT的選用在誘導(dǎo)不定芽萌發(fā)和不定芽增殖中己經(jīng)得到肯定。北五味子這一中國傳統(tǒng)著名的藥材近年來在國外受到相當(dāng)?shù)年P(guān)注，其含有大 量的精油、酸等液體物質(zhì)，具有增強(qiáng)視力和聽力能力，消除眼部疲勞，加強(qiáng)視力 集中，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，提高抵抗力等功能。因此北五味子可以成為一些特殊 職業(yè)的必備良藥，諸如長途駕駛司機(jī)、飛行員、航海員和運(yùn)動員等都可以用它來 緩解工作過程中的巨大壓力。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，陳雅君等在《植物研究》(1999， 7, 19(3): 318-322)上發(fā)表的《藥用植物北五味子的組織培養(yǎng)》該文中提出以帶腋芽的北 五味子嫩莖為外植體，在附加6-BA2.。+ZT。」mg/L的MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)芽的效果最好。 其具體方法為把北五味子嫩莖剪去葉片及葉柄，用自來水沖洗，并加少量市售 洗衣粉加以洗滌，用自來水沖洗4 5小時，然后切成約5cm長的莖段移到超凈工 作臺上，先用70%酒精浸泡30秒，再用0.2%溶液消毒8分鐘，取出后用無菌水沖洗 5次，切成長度約O. 5cm左右的小段，每段至少有一個葉腋，按無菌操作要求， 接種于培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)瓶置于20 26。C，光照強(qiáng)度為2000Lx的培養(yǎng)室，光照時 間每天為12小時。其不足在于升汞溶液有劇毒，對植物材料損傷大，對人體有 危害性，處理不當(dāng)對環(huán)境有污染，不適宜實(shí)際應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種北五味子誘導(dǎo)不定芽的方法，使其提 供北五味子組培快繁的不定芽誘導(dǎo)所需要的最佳培養(yǎng)基和外植體消毒方法，為優(yōu)提供了技術(shù)保證，將對北五味子資源的開發(fā)和利用起到積 極的推動作用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括如下具體步驟① 取北五味子的嫩枝頂部和中部帶腋芽莖段作為組織培養(yǎng)的外植體材料；② 采用間二滅菌法對外植體材料消毒； (D在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得無菌叢生芽；④叢生芽經(jīng)過分株后再接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得大量不定芽。所述采用間二滅菌法對外植體材料消毒，是指用飽和的次氯酸鈉浸泡消毒 后接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，隔一天后再用次氯酸鈉消毒一次。進(jìn)一步的，所述采用間二滅菌法對外植體材料消毒，是指剪取2cm長的帶 腋芽的嫩莖段，自來水水沖洗2小時后用飽和的次氯酸鈉浸泡三分鐘，至兩端發(fā) 白，取出用無菌水沖洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分，通過無菌操作接種 于誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基上，隔一天將外植體從培養(yǎng)瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次， 以獲得高質(zhì)量的無菌北五味子外植體材料。所述在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得無菌叢生芽，其培養(yǎng)室溫度20。C -25°C，光照 12h/d，光照強(qiáng)度800-12001x。經(jīng)過20天-30天的培養(yǎng)，北五味子莖段會生長出腋 芽。所述叢生芽經(jīng)過分株后再接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，是指長出腋芽后繼續(xù)培養(yǎng) 20天左右，待腋芽長到2cm后，將不定芽從外植體上切下，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上 培養(yǎng)。在剪取不定芽時，盡量選擇腋芽莖段，因?yàn)樵摬课辉诶^代培養(yǎng)中是最容易 誘導(dǎo)出更多的不定芽。等待不定芽長成芽叢后，再將不定芽切下分株繼續(xù)擴(kuò)大繁 殖，直至到達(dá)所需數(shù)量。所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其成分為每升液體MS基本培養(yǎng)基中加6-芐氨基嘌呤 2.0mg、 a-萘乙酸0.05mg、玉米素0. 06mg、蔗糖30g、瓊脂8g。本發(fā)明對于外植體的消毒采用了間二滅菌法，原因在于培養(yǎng)的植物材料大都 采集于田間栽培植株，材料上常附有各種微生物， 一旦被帶入培養(yǎng)基，即會迅速 繁殖滋長，造成污染，而接種到培養(yǎng)基上之后兩天是孢子體生命力最弱的階段， 此時將外植體從培養(yǎng)瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次，接種到培養(yǎng)基上后，污 染率小于5%，且外植體腋芽萌發(fā)率高，相對于傳統(tǒng)的一次滅菌方法，能取得更好的滅菌效果，而且次氯酸鈉相對于其他消毒劑更易于去除，不易殘留在外植體 上對其造成損傷。本發(fā)明中培養(yǎng)基附加了低濃度的NAA，其作為一種生長素，主要作用是重新啟動有絲分裂，使已停止分裂的植物細(xì)胞恢復(fù)分裂能力。在北五味子不定芽誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中，低濃度的NAA與6-BA組合，效果比不加NAA要好。不定芽平均增殖系數(shù)達(dá)到3.4，最高4. 1，比前人所作有大幅提高。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下 進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限 于下述的實(shí)施例。本實(shí)施例所使用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，通過以下方法制成每升液體MS基本培養(yǎng)基 中加6-BA(6-節(jié)氨基嘌呤)2. 0mg、 NAA( a-萘乙酸)0. 05mg、 ZT (玉米素)0. 06mg、蔗糖30g， pH值調(diào)為5. 8后每升加入8g瓊脂12rC滅菌30min制成固體培養(yǎng)基。 實(shí)施例1剪取2cm長的帶腋芽的嫩莖段，自來水水沖洗2小時后用飽和的次氯酸鈉浸泡 三分鐘，至兩端發(fā)白，取出用無菌水沖洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分， 通過無菌操作接種于誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基上(每升液體MS基本培養(yǎng)基中附加6-BA(6-芐氨基嘌呤)2.0mg、 NAA(a-萘乙酸)0.05mg、 ZT (玉米素)0. 06mg、蔗糖30g， pH 值調(diào)為5.8后每升加入8g瓊脂12rC滅菌30min制成固體培養(yǎng)基)IOO個，隔一天將 外植體從培養(yǎng)瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次后重新接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在 溫度20"C，光照12h/d，光照強(qiáng)度12001x條件下培養(yǎng)。經(jīng)過20天的培養(yǎng)，北五味 子莖段會生長出腋芽。待腋芽長到2cm后，選取60個腋芽從外植體上切下，接種 到上述培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，30天后統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)量為211個，增殖系數(shù)為3.52。實(shí)施例2剪取2cm長的帶腋芽的嫩莖段，自來水水沖洗2小時后用飽和的次氯酸鈉浸泡 三分鐘，至兩端發(fā)白，取出用無菌水沖洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分， 通過無菌操作接種于誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基上(每升液體MS基本培養(yǎng)基中附加6-BA(6-芐氨基嘌呤)1.5mg、 NAA(a-萘乙酸)0.03mg、 ZT (玉米素)0. 04mg、蔗糖30g， pH 值調(diào)為5.8后每升加入8g瓊脂12rC滅菌30min制成固體培養(yǎng)基)IOO個，隔一天將外植體從培養(yǎng)瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次后重新接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在 溫度25。C，光照12h/d，光照強(qiáng)度8001x條件下培養(yǎng)。經(jīng)過25天的培養(yǎng)，北五味子 莖段會生長出腋芽。待腋芽長到2cm后，選取60個腋芽從外植體上切下，接種到 上述培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，30天后統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)量為166個，增殖系數(shù)為2.76。 實(shí)施例3剪取2cm長的帶腋芽的嫩莖段，自來水水沖洗2小時后用飽和的次氯酸鈉浸泡 三分鐘，至兩端發(fā)白，取出用無菌水沖洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分， 通過無菌操作接種于誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基上(每升液體MS基本培養(yǎng)基中附加6-BA(6-芐氨基嘌呤)2. 5mg、 NAA(a-萘乙酸)0.07mg、 ZT (玉米素)0. 08mg、蔗糖30g， pH 值調(diào)為5.8后每升加入8g瓊脂12rC滅菌30min制成固體培養(yǎng)基)IOO個，隔一天將 外植體從培養(yǎng)瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次后重新接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在 溫度22t，光照12h/d，光照強(qiáng)度10001x條件下培養(yǎng)。經(jīng)過26天的培養(yǎng)，北五味 子莖段會生長出腋芽。待腋芽長到2cm后，選取60個腋芽從外植體上切下，接種 到上述培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，30天后統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)量為175個，增殖系數(shù)為2.92。
權(quán)利要求
1、一種北五味子誘導(dǎo)不定芽的方法，其特征在于，包括如下具體步驟①取北五味子的嫩枝頂部和中部帶腋芽莖段作為組織培養(yǎng)的外植體材料；②采用間二滅菌法對外植體材料消毒；③在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得無菌叢生芽；④叢生芽經(jīng)過分株后再接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得大量不定芽；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其成分為每升液體MS基本培養(yǎng)基中加6-芐氨基嘌呤2.0mg、α-萘乙酸0.05mg、玉米素0.06mg、蔗糖30g、瓊脂8g。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的北五味子誘導(dǎo)不定芽的方法，其特征是，所述誘 導(dǎo)培養(yǎng)基，其pH值為5.8。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的北五味子誘導(dǎo)不定芽的方法，其特征是，所述采 用間二滅菌法對外植體材料消毒，是指用飽和的次氯酸鈉浸泡消毒后接種于誘 導(dǎo)培養(yǎng)基上，隔一天后再用次氯酸鈉消毒一次。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的北五味子誘導(dǎo)不定芽的方法，其特征是，所述 采用間二滅菌法對外植體材料消毒，是指剪取2cm長的帶腋芽的嫩莖段，自來 水水沖洗2小時后用飽和的次氯酸鈉浸泡三分鐘，至兩端發(fā)白，取出用無菌水沖 洗三次以上，然后用無菌紗布吸干水分，通過無菌操作接種于誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基上， 隔一天將外植體從培養(yǎng)瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次，以獲得高質(zhì)量的無菌 北五味子外植體材料。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的北五味子誘導(dǎo)不定芽的方法，其特征是，所述在誘 導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得無菌叢生芽，其培養(yǎng)室溫度20°(:-25°(:，光照12h/d，光照強(qiáng) 度8001x -12001x，經(jīng)過20天-30天的培養(yǎng)，北五味子莖段會生長出腋芽。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的北五味子誘導(dǎo)不定芽的方法，其特征是，所述叢生 芽經(jīng)過分株后再接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，是指長出腋芽后繼續(xù)培養(yǎng)20天，待腋芽 長到2cm后，將不定芽從外植體上切下，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在剪取不定 芽時，選擇腋芽莖段，等待不定芽長成芽叢后，再將不定芽切下分株繼續(xù)擴(kuò)大繁 殖，直至到達(dá)所需數(shù)量。
全文摘要
本發(fā)明是一種農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的北五味子組培快繁的不定芽誘導(dǎo)方法，取北五味子的嫩枝頂部和中部帶腋芽莖段作為組織培養(yǎng)外植體，采用飽和次氯酸鈉間二滅菌法對外植體消毒，無菌操作接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為每升液體MS基本培養(yǎng)基中加6-芐氨基嘌呤2.0mg、α-萘乙酸0.05mg、玉米素0.06mg、蔗糖30g、瓊脂8g。在溫度20℃-25℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度800-1200lx條件下培養(yǎng)。經(jīng)過20天-30天的培養(yǎng)，北五味子莖段會生長出腋芽，繼續(xù)培養(yǎng)待腋芽長到2cm后，將不定芽從外植體上切下，接種到新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得無菌叢生芽，叢生芽經(jīng)過分株后再接種于培養(yǎng)基上培養(yǎng)可獲得大量不定芽。
文檔編號A01H4/00GK101228847SQ20081003222
公開日2008年7月30日 申請日期2008年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月3日
發(fā)明者劉群錄, 高 王, 申曉輝, 范愷敏, 范現(xiàn)麗 申請人:上海交通大學(xué)