專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種杉木組織培養(yǎng)生根方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種杉木組織培養(yǎng)生根方法，具體地涉及使用改良MS培養(yǎng)基和激素組成的杉木生根培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)生根的方法。
背景技術(shù)：
：杉木(C〃/Mi77^/7柳iaJ朋ceo/at3(lamb.)Hook)為杉禾斗植物，是一種適應(yīng)性廣、材質(zhì)優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種。由于杉木是異花授粉樹(shù)種，用種子繁殖，個(gè)體分化大，難以保持杉木母體的性狀。而常規(guī)的扦插、壓條或嫁接等無(wú)性繁殖方法，繁育速度緩慢，難以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求。為此，杉木要在短期內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)良無(wú)性系苗木，只有通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)解決問(wèn)題。組織培養(yǎng)方法是一種快速無(wú)性繁殖技術(shù)，選擇杉木優(yōu)良無(wú)性系材料，采用組織培養(yǎng)方法，既可以保持母體的優(yōu)良性狀，又可以有效節(jié)約生產(chǎn)成本?，F(xiàn)有的杉木組織培養(yǎng)商業(yè)產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中，生根緩慢、生根率低、生長(zhǎng)速度慢等問(wèn)題，一直阻礙著杉木產(chǎn)業(yè)化育苗生產(chǎn)進(jìn)程。因此，申請(qǐng)人擬提供一種新型的杉木生根培養(yǎng)基，解決現(xiàn)有杉木培養(yǎng)技術(shù)中杉木生根難、生根率低的問(wèn)題。表1中列出了植物組織培養(yǎng)常用的MS(Murashige&Skoog)培養(yǎng)基成分，包括大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和白糖。其中，大量元素由C、H、0、N、P、S、K、Ca、Cl、Mg組成，它們是植物細(xì)胞中構(gòu)成核酸、蛋白質(zhì)、酶系統(tǒng)、葉綠體以及生物膜所必不可少的元素；微量元素由Fe、Cu、Mo、Zn、Na、Mn、Co、B、I等營(yíng)養(yǎng)元素組成，它們?cè)谥参矬w內(nèi)的含量極低，往往僅占作物體內(nèi)干重的千分之幾到百萬(wàn)分之幾，但其作用極其重要，它們參與了植物體內(nèi)多種生理活動(dòng)，是不可或缺的營(yíng)養(yǎng)元素；鹽酸硫銨素、煙酸、鹽酸吡眵醇、肌醇、抗壞血酸、生物素為有機(jī)物，有機(jī)物是植物健康生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，植物多數(shù)能夠直接吸收，對(duì)植物細(xì)胞分化和再分化起著積極作用；白糖是異養(yǎng)培養(yǎng)植物的碳源，并對(duì)保持培養(yǎng)基滲透壓起主要作用。4表1植物組織培養(yǎng)常用的MS培養(yǎng)基成分<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種杉木優(yōu)良無(wú)性系的組織培養(yǎng)生根方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，用本發(fā)明的組織培養(yǎng)生根法可以縮短生根周期，提高生根率，加快苗木的生長(zhǎng)速度。本發(fā)明的解決方案是一種杉木優(yōu)良無(wú)性系的組織培養(yǎng)生根方法，具體是切取杉木增殖繼代小苗，接種于優(yōu)選出的杉木生根培養(yǎng)基，生根方式為皮部生根型；其中，杉木生根培養(yǎng)基由改良MS(Murashige&Skoog)基本培養(yǎng)基、ABTltt(50%萘乙卩引乙可溶性粉劑)0.40.8mg/L、IBA(卩引哚丁酸)0.10.5mg/L和根太陽(yáng)稀釋液26mL/L組成；所述根太陽(yáng)稀釋液由根太陽(yáng)原液兌水1:100稀釋制成；所述改良MS培養(yǎng)基包含大量元素、有機(jī)物、微量元素、鐵鹽、白糖及活性炭；所述大量元素由680825mg/LNH4N03、633950mg/L跳、5785mg/LKH2P04、200300mg/L無(wú)水CaCl2和185mg/LMgS047H20組成；所述有機(jī)物由5mg/L鹽酸硫銨素、lmg/L煙酸、lmg/L鹽酸吡哆醇、100mg/L肌醇、5mg/L抗壞血酸和0.4mg/L生物素組成；白糖的含量為15g/L;活性炭含量為0.05g/L;所述微量元素和鐵鹽含量與傳統(tǒng)MS培養(yǎng)基中的含量相同，即，F(xiàn)eS047H20含量為27.8mg/L、Na2-EDTA含量為37.3mg/L、KI含量為0,83mg/L、H3B03含量為6.2mg/L、MnS044H20含量為22.3mg/L、ZnS047H20含量為8.6mg/L、歸。042H20含量為0.25mg/L、CoCl26H20含量為0.025mg/L、CuS045H20含量為0.025mg/L。本發(fā)明提供的改良MS培養(yǎng)基之大量元素可優(yōu)選為NH4N03含量為680mg/L、認(rèn)03含量為800mg/L、KH2P04含量為85mg/L、無(wú)水CaCL含量為200mg/L、MgS047H20含量為185mg/L。本發(fā)明提供的杉木生根培養(yǎng)基中的激素配比可優(yōu)選為:ABTltt0.4mg/L、IBA0.lmg/L、根太陽(yáng)稀釋液2mL/L。所述杉木增殖繼代小苗的切取長(zhǎng)度優(yōu)選1.5cm。在上述杉木生根培養(yǎng)基中，ABTltt、IBA、根太陽(yáng)為激素，它們能夠加快并促進(jìn)植物細(xì)胞的有絲分裂，對(duì)植物培養(yǎng)成功與否起著關(guān)鍵性的作用；活性炭在培養(yǎng)基中的加入可促進(jìn)或抑制離體生長(zhǎng)，具有對(duì)生長(zhǎng)抑制物、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其他有機(jī)物等的吸附作用，在生根階段給培養(yǎng)物創(chuàng)造暗環(huán)境，對(duì)生根有促進(jìn)作用。下面將通過(guò)一些具體的試驗(yàn)情況來(lái)說(shuō)明本發(fā)明所述杉木優(yōu)良無(wú)性系組織培養(yǎng)生根方法中改良MS培養(yǎng)基優(yōu)選組分范圍及有效的激素配比。本發(fā)明將增殖繼代培養(yǎng)出的杉木小苗接入杉木生根培養(yǎng)基上，以下各組試驗(yàn)的培養(yǎng)條件為溫度25±2°C、光照強(qiáng)度控制在15003000Lux，自然光照培養(yǎng)，環(huán)境濕度3545%，所有使用藥品試劑均為分析純。一、MS大量元素對(duì)杉木組織培養(yǎng)苗培養(yǎng)的影響取傳統(tǒng)MS培養(yǎng)基中各大量元素的1/4量，鐵鹽、微量元素、有機(jī)物、白糖含量不變(以下簡(jiǎn)稱(chēng)1/4MS培養(yǎng)基，下同)、1/3MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基四組進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，在不添加激素前提下，確定大量元素對(duì)杉木組織培養(yǎng)苗培養(yǎng)的影響。取杉木增殖繼代小苗接種于所述不同濃度梯度培養(yǎng)基。每組試驗(yàn)至少20瓶，每瓶接種20株高1.5cm杉木小苗，三次重復(fù)。表2大量元素對(duì)杉木培養(yǎng)的影響培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況(22天統(tǒng)計(jì))1/4MS大量元素，苗木緩慢生長(zhǎng)，葉色偏黃。1/3MS大量元素，苗木生長(zhǎng)正常，葉色綠色，少部分苗木出現(xiàn)高生長(zhǎng)。1/2MS大量元素，苗木生長(zhǎng)正常，葉色濃綠，多數(shù)苗木出現(xiàn)高生長(zhǎng)。MS苗木生長(zhǎng)速度緩慢，葉色偏黃，莖段變白。上表表明，大量元素使用濃度的高低直接影響著杉木生根培養(yǎng)效6果，在中低鹽分1/3MS1/2MS濃度杉木組織培養(yǎng)苗生長(zhǎng)正常，葉色濃綠，苗木出現(xiàn)高生長(zhǎng)。對(duì)杉木生根培養(yǎng)均能取得較好培養(yǎng)效果。二、NH4N03、KN03、KH2P04、無(wú)水CaC:U對(duì)杉木培養(yǎng)的影響為進(jìn)一步確定NH4N03、認(rèn)03、KH2P04、無(wú)水CaCh大量元素對(duì)杉木培養(yǎng)的影響，我們?cè)诟牧糓S培養(yǎng)基中選擇添加不同濃度的NH4N03、認(rèn)03、KH2P(X及無(wú)水CaCl2，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定改良MS培養(yǎng)基中的最佳NH4N0"KN03、KH2P04及無(wú)水CaCl2濃度配比。改良MS培養(yǎng)基中其余組分如下MgS047H20含量為185mg/L;鹽酸硫銨素含量為5mg/L、煙酸含量為lmg/L、鹽酸吡哆醇含量為lmg/L、肌醇含量為100mg/L、抗壞血酸含量為5mg/L、生物素含量為0.4mg/L;白糖含量為15g/L;活性炭含量為0.05g/L;微量元素、鐵鹽含量與傳統(tǒng)MS培養(yǎng)基中的含量相同。取杉木增殖繼代小苗，接種于9組改良MS培養(yǎng)基進(jìn)行杉木組織培養(yǎng)效果試驗(yàn)。每組試驗(yàn)至少20瓶，每瓶接種20株高1.5cm杉木小苗，三次重復(fù)。表34因素3水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)(mg/L)(22天統(tǒng)計(jì))<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>KH2P04、無(wú)水CaCl2組份含量?jī)?yōu)選為朋4恥3含量為680825mg/L、腦03含量為633950mg/L、KH2P04含量為5785mg/L、無(wú)水CaCl含量為200300mg/L。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，杉木生根培養(yǎng)改良MS培養(yǎng)基中NH4N03、認(rèn)O.,、KH2P04、無(wú)水CaCl2組份含量更優(yōu)選為順4冊(cè):,含量為680mg/L、認(rèn)0:,含量為800mg/L、KH2P04含量為85mg/L、無(wú)水CaCh含量為200mg/L。三、激素配比對(duì)杉木生根率的影響以改良MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，所述改良MS培養(yǎng)基的組成為麗4腦:!含量為680mg/L、固03含量為800mg/L、跟204含量為85mg/L、無(wú)水CaCl2含量為200mg/L和MgS047H20含量為185mg/L;鹽酸硫銨素含量為5mg/L、煙酸含量為lmg/L、鹽酸吡哆醇含量為lmg/L、肌醇含量為100mg/L、抗壞血酸含量為5mg/L、生物素含量為0.4mg/L;白糖含量為15g/L、活性炭含量為0.05g/L;微量元素、鐵鹽含量與傳統(tǒng)MS培養(yǎng)基中的含量相同。在改良MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的ABTltt、IBA和根太陽(yáng)，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定杉木生根配方的最佳激素配比。取杉木增殖繼代小苗接種于杉木生根培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)生根試驗(yàn)。每組試驗(yàn)至少20瓶，每瓶接種20株小苗，三次重復(fù)。表43因素4水平正交設(shè)計(jì)表(22天統(tǒng)計(jì))<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示杉木生根培養(yǎng)階段對(duì)不同激素濃度配比敏感，苗木生長(zhǎng)情況出現(xiàn)了顯著差異，高濃度的ABTlft、IBA和根太陽(yáng)雖然同樣取得了較高生根率，但同時(shí)部分苗木出現(xiàn)燒苗、白苗現(xiàn)象。根據(jù)上述正交試驗(yàn)結(jié)果，杉木生根培養(yǎng)基激素的含量?jī)?yōu)選為ABTltf含量為0.40.8mg/L、IBA含量為0.10.5mg/L、根太陽(yáng)(原液兌水l:100稀釋)含量為26mL/L。杉木生根培養(yǎng)基的激素含量更優(yōu)選為ABTltt含量為0.4mg/L、IBA含量為0.1/L、根太陽(yáng)(原液兌水1:100稀釋)含量為2ml/L。苗木能夠生根形成完整植株，是影響杉木產(chǎn)業(yè)化育苗的一個(gè)關(guān)鍵性技術(shù)難點(diǎn)，提高生根率，縮短生根時(shí)間是本發(fā)明重點(diǎn)解決的問(wèn)題。本發(fā)明揭示的杉木生根培養(yǎng)基，解決了杉木組織培養(yǎng)生根苗生根率低的技術(shù)難題，在采用上述杉木生根培養(yǎng)基后，杉木的生根時(shí)間由原來(lái)普遍的30天縮短至1622天，經(jīng)22天培養(yǎng)后，最高生根率達(dá)到96%,在加快杉木組培苗生根速度、提高苗木生根率的同時(shí)，又提高苗木生長(zhǎng)速度，大大縮短了杉木生根苗的開(kāi)瓶移栽時(shí)間，大幅度降低了杉木苗木的培養(yǎng)成本，滿足杉木產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。具體實(shí)施例方式為更好的說(shuō)明本發(fā)明，我們提供了下述實(shí)施例，以下的實(shí)施只是為了更好地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本發(fā)明切取長(zhǎng)度約1.5cm的杉木增殖繼代小苗，接種于杉木生根培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)生根試驗(yàn)，生根方式為皮部生根型。杉木生根培養(yǎng)基由不同濃度的腿4冊(cè)3、KN03、KH2P04、無(wú)水CaCl"ABT1#、IBA、根太陽(yáng)和185mg/LMgS047H20、5mg/L鹽酸硫銨素、lmg/L煙酸、lmg/L鹽酸吡哆醇、100mg/L肌醇、5mg/L抗壞血酸、0.4mg/L生物素、15g/L白糖、0.05g/L活性炭、微量元素和鐵鹽組成。其中，微量元素、鐵鹽含量與傳統(tǒng)MS培養(yǎng)基中的含量相同。本實(shí)施例在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度控制在15003000Lux，自然光照培養(yǎng)，環(huán)境濕度3545%的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。所有使用藥品試劑均為分析純。每組試驗(yàn)至少20瓶，每瓶接種20株高1.5cm杉木小苗，三次重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。表5表明用本發(fā)明的生根培養(yǎng)基進(jìn)行杉木優(yōu)良無(wú)性系的組織培養(yǎng)生根，杉木的生根時(shí)間縮短至1622天，最高生根率達(dá)到96%，提高苗木生長(zhǎng)速度，可大幅度降低杉木苗木的培養(yǎng)成本。9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1、一種杉木組織培養(yǎng)生根方法，其特征在于切取杉木增殖繼代小苗，接種于杉木生根培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)生根所述杉木生根培養(yǎng)基由改良MS培養(yǎng)基、ABT1#0.4～0.8mg/L、IBA0.1～0.5mg/L和根太陽(yáng)稀釋液2～6mL/L組成；所述根太陽(yáng)稀釋液由根太陽(yáng)原液兌水1∶100稀釋制成；所述改良MS培養(yǎng)基包含大量元素、有機(jī)物、微量元素、鐵鹽、白糖及活性炭所述大量元素由680～825mg/LNH4NO3、633～950mg/LKNO3、57～85mg/LKH2PO4、200～300mg/L無(wú)水CaCl2和185mg/LMgSO4·7H2O組成；所述有機(jī)物由5mg/L鹽酸硫銨素、1mg/L煙酸、1mg/L鹽酸吡哆醇、100mg/L肌醇、5mg/L抗壞血酸和0.4mg/L生物素組成；白糖的含量為15g/L；活性炭含量為0.05g/L；所述微量元素、鐵鹽含量與傳統(tǒng)MS培養(yǎng)基中微量元素、鐵鹽含量相同。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的杉木組織培養(yǎng)生根方法，其特征在于NFiN03含量為680mg/L、KN03含量為800mg/L、KH2P04含量為85mg/L、無(wú)水CaCl2含量為200mg/L。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的杉木組織培養(yǎng)生根方法，其特征在于ABT1#0.4mg/L、IBA0.lmg/L、根太陽(yáng)稀釋液2mL/L。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的杉木組織培養(yǎng)生根方法，其特征在于NH4N03含量為680mg/L、KN03含量為800mg/L、KH2P04含量為85mg/L、無(wú)水CaCl2含量為200mg/L，ABT1#0.4mg/L、IBA0.lmg/L、根太陽(yáng)稀釋液2mL/L。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的杉木組織培養(yǎng)生根方法，其特征在于所述微量元素和鐵鹽是FeS047仏0含量為27.8mg/L、Na2-EDTA含量為37.3mg/L、KI含量為0.83mg/L、H3B03含量為6.2mg/L、MnS04*4H20含量為22.3mg/L、ZnS047H20含量為8.6mg/L、Na2Mo042H20含量為0.25mg/L、CoCl26H20含量為0.025mg/L、CuS045H20含量為0.025mg/L。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的杉木組織培養(yǎng)生根方法，其特征在于:生根方式為皮部生根型。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的杉木組織培養(yǎng)生根方法，其特征在于:所述杉木增殖繼代小苗的切取長(zhǎng)度為1.5cm。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的杉木組織培養(yǎng)生根方法，其特征在于:所述組織培養(yǎng)生根是在溫度25±2°C、光照強(qiáng)度控制在15003000Lux、環(huán)境濕度3545%的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明提供了一種杉木組織培養(yǎng)生根方法，切取杉木增殖繼代小苗，接種于杉木生根培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)生根，杉木生根培養(yǎng)基由改良MS培養(yǎng)基、ABT1#0.4～0.8mg/L、IBA0.1～0.5mg/L和根太陽(yáng)稀釋液2～6mL/L組成。采用上述杉木生根培養(yǎng)基后，杉木的生根時(shí)間縮短至16～22天，經(jīng)22天培養(yǎng)后，最高生根率達(dá)到96％，苗木生長(zhǎng)速度快，使得杉木的育苗成本降低，實(shí)現(xiàn)杉木產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號(hào)A01H4/00GK101480166SQ20081007045公開(kāi)日2009年7月15日申請(qǐng)日期2008年1月8日優(yōu)先權(quán)日2008年1月8日發(fā)明者何輝東,朱文輝,賴(lài)春陽(yáng),賴(lài)曉昱,賴(lài)桂星,鄭仁華,郭逸成申請(qǐng)人:廈門(mén)涌泉科技有限公司