專利名稱：一種新型茅蒼術接種劑生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農業(yè)應用微生物技術領域，具體涉及一種茅蒼術接種劑生產(chǎn)方法，該方 法生產(chǎn)的菌劑能克服或消除茅蒼術連作障礙。
背景技術：
茅蒼術^化acO;/^fes /""cm (Thunb. )DC.是我國民間常用的菊科蒼術屬多年生藥用植 物，始載于《神農本草經(jīng)》，性辛、苦、溫、歸脾、胃、肝經(jīng)。具有燥濕健脾、祛風散 寒、明目作用。茅蒼術為江蘇省著名地道藥材，中醫(yī)臨床使用歷史悠久，其活性成分主 要是J3-桉樹醇、蒼術酮、茅術醇以及聚乙炔類成分蒼術素，主治脘腹脹滿、泄瀉、水腫、 風濕痹痛、風寒感冒等。近年來，隨著國際市場對蒼術的需求量日益增加,茅蒼術被掠奪性 采挖,加之對茅蒼術生態(tài)環(huán)境的人為破壞，造成茅蒼術資源的枯竭,使其瀕臨滅絕。
一些植物，連續(xù)多年在同一田塊上種植，常會出現(xiàn)黃化、僵苗、甚至大片植株死亡，嚴 重地影響產(chǎn)量和品質的提高。這種現(xiàn)象在栽培學上被稱為連作障礙。引起植物連作障礙 的原因主要有土壤養(yǎng)分失衡、土壤微生物群落結構改變、植物毒素物質增加及土壤物理 化學性質改變等。郭蘭萍等通過蒼術根莖及根際土水提物生物活性研究及化感物質的鑒 定，提示自毒作用導致了栽培蒼術連作障礙。同時通過對栽培蒼術根際土壤微生物變化 的研究，認為多年栽培蒼術病蟲害的發(fā)生，可能與其根際區(qū)土壤微生物數(shù)量和群落結構的 改變所引起的連作障礙有關。
而為了挽救這一品種，近年來國家規(guī)劃了大量項目，希望解決這一問題。同時我國 近年來在茅蒼術研究領域取得了許多重要成果。不少地方紛紛開始對蒼術進行引種栽培，
但由于不能解決茅蒼術的連作障礙，茅蒼術資源開發(fā)還是存在很多問題(1)茅蒼術種
子的發(fā)芽率低，不能為大規(guī)模種植提供穩(wěn)定的種源，(2)人工栽培有難度，茅蒼術生長 緩慢，茅蒼術抗逆性差，喜陰涼，不耐熱，不耐澇；(3)茅蒼術栽培種植中病蟲害嚴重， 并隨栽培年限增加，其發(fā)病率和死亡率均升高，王義勛等在中藥材規(guī)范化種植(GAP)重要 基地湖北省孝昌縣和英山縣調査發(fā)現(xiàn)蒼術黑斑病的發(fā)生十分嚴重， 一般田塊減產(chǎn)約 10% 15% ，發(fā)病嚴重的田塊產(chǎn)量損失高達90%以上。這給人工栽培造成了很大的困難。 所以我們認為要解決蒼術資源開發(fā)的問題必須要解決它的連作障礙。
內生菌是指存在于健康植物組織器官中，不形成明顯致病性的一類微生物。目前研 究表明，所有被研究過的植物中都有內生菌的存在。內生菌研究是提高種子發(fā)芽率，加 快藥材生長，提高抗逆性，促進有效物質積累維持藥材品質從而解決連作障礙的一個有 希望的方向。感染內生菌的植物宿主往往具有生長快速、抗逆境、抗病害、抗動物危害 等優(yōu)勢，比未感染內生菌的植株更具生存競爭力。莫文萍等發(fā)現(xiàn)鹽促生菌Rsl524處理棉花 后，發(fā)芽率比對照提高了ll. 8%，葉小梅等發(fā)現(xiàn)經(jīng)102菌稀釋液處理的青菜、番茄種子的 發(fā)芽率及根長顯著提高，高玉葆等研究表明，內生菌可以促進黑麥草抗旱，抗逆境，陳 曉梅等在離體培養(yǎng)條件下，還發(fā)現(xiàn)內生真菌與金釵石斛共生培養(yǎng)能影響金釵石斛的生長 和總生物堿的含量，提高多糖的含量。有些內生真菌對自毒物質有一定的分解能力，因此 利用內生真菌可以解決或緩解自毒作用。
江蘇茅山地區(qū)的蒼術,作為蒼術道地藥材，近年來已無法形成商品收購。而由于連作 障礙導致的種子發(fā)芽率低、生長緩慢、抗逆性、抗病蟲能力差、品質不穩(wěn)定，栽培一直不能獲得成功，無法大規(guī)模生產(chǎn)，而國內一直不能解決。我們實驗表明了接種茅蒼術內 生真菌或者益生菌將是一個有效途徑，用益生菌或者茅蒼術的內生真菌制劑來克服或消 除作障礙目前無人報道，該菌劑生產(chǎn)方法無專利。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種茅蒼術接種劑及制備方法，從而大規(guī)模栽培藥用植物茅蒼 術，挽救這一瀕危藥用植物并使其正常生產(chǎn)。
我們通過實驗發(fā)現(xiàn)從茅蒼術分離到的內生菌極顯著地提高發(fā)芽率，同時促進茅蒼術 的生長，提高抗逆性，抗病抗蟲能力，刺激活性物質的更多的積累。我們認為從茅蒼術 分離到的內生菌可以通過改善土壤理化狀況、培肥地力、提高土壤養(yǎng)分利用率、分解自 毒物質、從而克服或消除連作障礙，可以有效減少農藥等的使用，從而減少農業(yè)環(huán)境污 染保護生態(tài)的作用，屬于綠色農業(yè)，同時有驅避地下害蟲的作用抵抗病原菌的作用。在 多種植物上使用植物益生菌均表明，連作障礙可以通過其使用得到減輕。
本發(fā)明所說的一種茅蒼術接種劑的制備方法，是將益生菌或茅蒼術內生真菌活化， 在含有茅蒼術浸汁的液體培養(yǎng)基或者含有茅蒼術秸稈的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到接種 劑。
上述方法中，菌種經(jīng)活化、培養(yǎng)后，還可添加增稠劑或者保水劑，制得產(chǎn)品。 利用本發(fā)明方法可得到液體或固體的接種劑，其中液體的接種劑可以用于浸種、灌 根或浸根，固體的接種劑用于移栽時直接添加到根部土壤中。
在接種劑制備過程中，添加有茅蒼術浸汁或秸稈的目的是增加菌種生長速度，提 供菌種生長碳源，誘導菌種適應植物體內環(huán)境，有利于建立共生關系。
本發(fā)明中所說的液體培養(yǎng)基最好是按重量計含有20%馬鈴薯浸汁、茅蒼術浸汁 (1%)、蔗糖(2%)的培養(yǎng)基。
所說的增稠劑可以是按重量計的0.1%瓊脂或者0.1%明膠或者0.1%多糖。
本發(fā)明的一個具體的技術方案是從4'C冰箱取出菌種，轉接到PDA斜面，25'C生長7 天，倒入無菌水，刮取菌絲，轉接入PDA液體培養(yǎng)基，25°C， 150r/min發(fā)酵培養(yǎng)7天。接 入固體發(fā)酵培養(yǎng)基(包含麩皮，茅蒼術秸稈，少量稻殼，少量無機鹽)，25-30'C培養(yǎng)7天。 得到產(chǎn)品。用于直接加到茅蒼術栽培土壤中。
本發(fā)明的另一個具體的技術方案是從4'C冰箱取出菌種，轉接到PDA斜面，25'C生 長7天，倒入無菌水，刮取菌絲，轉接入PDA液體培養(yǎng)基，25°C， 150r/min發(fā)酵培養(yǎng)7天。 作為發(fā)酵種子，接入發(fā)酵罐；5L罐裝入3L發(fā)酵液，接種量20%, 25'C通氣培養(yǎng)3d。用 作茅蒼術種子發(fā)芽時的浸泡接種。
本發(fā)明的另一個具體的技術方案是從4'C冰箱取出菌種，轉接到PDA斜面，25°。生 長7天，倒入無菌水，刮取菌絲，轉接入PDA液體培養(yǎng)基，25°C， 150r/min發(fā)酵培養(yǎng)7天。 作為發(fā)酵種子，接入發(fā)酵罐；5L罐裝入3L發(fā)酵液，接種量20W25'C通氣培養(yǎng)3d。發(fā)酵 結束加0.1%瓊脂或明膠作為增稠劑，攪拌均勻。用于茅蒼術移栽浸根。
所說的益生菌和茅蒼術內生真菌，包括對茅蒼術生長有益的真菌和從健康茅蒼術內 部分離的真菌。如小菌核菌(5Wera"ww sp.)、小克銀漢霉(Cw""/"g/wwe〃a sp.)、孔球孢霉(Gz7wawW/" sp.)等。本發(fā)明推薦以下菌種。
表l部分內生菌目錄
菌種名稱拉丁名菌種來源
剌孢小克銀漢霉中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (ACCC)索取編號31576
孔球孢霉G7/wamW/" sp.中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (CFCC)索取編號80868
擬莖點霉CFCC 81894
擬莖點霉CFCC 81338
小菌核菌美國模式菌株保藏中心(ATCC)索取 編號15200
孔球孢霉G//mawzW/a sp.南京師范大學從茅蒼術中分離并保藏， 菌株編號AL12 (廣西植物，28 (2) : 252-260; 2008年 3月)
小克銀漢霉Cwwm'wg/iame//a sp.南京師范大學從茅蒼術中分離并保藏， 菌株編號AL4 (廣西植物，28 (2): 252-260; 2008年3月)
小菌核菌5t/era"'謡sp.南京師范大學從茅蒼術中分離并保藏， 菌株編號AL3 (廣西植物，28 (2): 252-260; 2008年3月)
表2部分益生菌目錄菌種名稱拉丁名菌種來源康氏木霉美國模式菌株保藏中心(ATCC)索取編號201709哈茨木霉ATCC 56678綠色木霉7", v/〃cteATCC 20476木素木霉7". //'g/ ony/nATCC 38500鉤木霉ATCC 204435長枝木霉7". /ong/力rac/ /af umATCC 18648多孢木霉T", po/yspo/iumATCC 60004枝頂孢霉ATCC 11550
A coenop/ /'a/"mATCC 62374擬莖點霉尸towo/^ sp.南京師范大學從重陽木內部分離并保藏，菌株號B3 (環(huán)境科學學報，第24巻第1期，2004年1月)所說的連作障礙是指一些植物，連續(xù)多年在同一田塊上種植，常會出現(xiàn)黃化、僵苗、 甚至大片植株死亡，嚴重地影響產(chǎn)量和品質的提高。
所說的固體發(fā)酵培養(yǎng)基包含麩皮(或其它適合作為替代碳源和氮源的農業(yè)廢棄物)， 以及茅蒼術秸稈，稻殼，少量無機鹽。
本發(fā)明的方法采用益生菌或者茅蒼術內生真菌生產(chǎn)茅蒼術接種劑，通過發(fā)酵得到菌液，攪拌均勻得到接種劑，可以用于浸種、灌根或浸根?；虬丫涸诠腆w培養(yǎng)基發(fā)酵直 接添加于土壤。我們的實驗結果表明茅蒼術真菌接種劑可以極顯著地提高茅蒼術種子的 發(fā)芽率，同時促進茅蒼術的生長，提高抗逆性，抗病抗蟲能力，刺激活性物質的更多的 積累。我們認為與茅蒼術共生的真菌接種到根部可以通過改善土壤理化狀況、培肥地力、 提高土壤養(yǎng)分利用率、分解自毒物質、減小病害的作用、從而克服或消除連作障礙。
本接種劑的生產(chǎn)不受環(huán)境影響，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)時間和產(chǎn)量易于 控制，作用明顯。采用浸泡種子，浸泡植物根或澆灌，以及直接添加于土壤的方法使其 作用于植物，方法簡單，易操作，用量少，成本低且均能收到良好效果。益生菌或內生 菌隨凋落物等在植物和土壤中遷移定植， 一段長的時期仍然存在和發(fā)揮作用，因此本接 種劑作用持久，可以有效減少農藥等污染環(huán)境的化學物質的使用，從而減少農業(yè)環(huán)境污 染保護生態(tài)的作用，屬于綠色農業(yè)。


圖l是本發(fā)明的簡單工藝流程圖
具體實施例方式
在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明， 一般具有本領域普通技術人員通常理 解的含義。
下面結合具體的實施例，并按照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解這些實施例 只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。所 用試劑的來源，商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用 相同試劑如無特殊說明，均于首次比標明的內容相同。
以下實施例中的制備過程如圖1所示。 實施例l:
菌種的活化與種子液的制備菌種小菌核菌ATCC15200 (Sc/ero"wm &/;j/n>z")從4 'C冰箱取出，轉接到PDA斜面，25r生長7天，倒入無菌水，刮取菌絲，轉接入添加含1% 重量茅蒼術枝葉提取物的PDA液體培養(yǎng)基，25°C，搖床150r/min發(fā)酵培養(yǎng)7天。作為種子， 利用GBCS-5型全自動發(fā)酵罐發(fā)酵罐發(fā)酵菌絲；5L罐裝入3L發(fā)酵液，接種量20%。培養(yǎng)4 天，獲得發(fā)酵液。
本發(fā)酵液用作種子發(fā)芽接種劑。
實施例2:
菌種擬莖點霉B3菌株(,力咖w'ssp.)從4'C冰箱取出，轉接到PDA斜面，25。C生長7天， 倒入無菌水，刮取菌絲，轉接入PDA液體培養(yǎng)基，25°C，搖床150r/min發(fā)酵培養(yǎng)7天。接 入固體發(fā)酵培養(yǎng)基(麩皮2%，茅蒼術秸稈10%，稻殼47.5%,無機鹽0.5%，水40%)，固體 發(fā)酵10天左右，按干料1%重量的保水劑(高吸水性樹脂)加入料中均勻混合。
本制品作為土壤中接種劑使用。
實施例3:
菌種刺孢小克銀漢霉ACCC31576 (Cw朋/wg/w附e〃a ec///ww/a/aAm:^0從4。C冰箱取出， 轉接到PDA斜面，25。C生長7天，倒入無菌水，刮取菌絲，轉接入添加少量茅蒼術枝葉提 取物的PDA液體培養(yǎng)基，25'C，搖床150r/min發(fā)酵培養(yǎng)7天作為發(fā)酵罐發(fā)酵種子。利用 GBCS-5型全自動發(fā)酵罐；5L罐裝入3L發(fā)酵液，接種量20%。好氧發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)結束后 加1%瓊脂或明膠作為增稠劑，攪拌均勻。本發(fā)酵液用于移栽浸根。 實施例4:
菌種孔球孢霉CFCC80868(fo7忍朋ie77a sp.)從4'C冰箱取出，轉接到PDA斜面，25°C 生長7天，倒入無菌水，刮取菌絲，轉接入添加少量茅蒼術枝葉提取物的PD液體培養(yǎng)基， 25°C，搖床150r/min發(fā)酵培養(yǎng)7天。作為種子，利用GBCS-5型全自動發(fā)酵罐發(fā)酵菌絲；5L 罐裝入3L發(fā)酵液，接種量20%。培養(yǎng)4天，獲得發(fā)酵液。
本發(fā)酵液用作種子發(fā)芽接種劑。 實施例5:
菌種枝頂孢霉ATCC11550 "cremo"^msp.)從4。C冰箱取出，轉接到PDA斜面，25°C 生長7天，倒入無菌水，刮取菌絲，轉接入PDA液體培養(yǎng)基，25°C，搖床150r/min發(fā)酵培 養(yǎng)7天。接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基(麩皮2%，茅蒼術秸稈10%，稻殼47. 5%，無機鹽O. 5%，水40%)， 固體發(fā)酵10天左右，按干料1%的保水劑(高吸水性樹脂)加入料中均勻混合。
本制品作為土壤中接種劑使用。
實施例6:
菌種擬莖點霉CFCC81338 (尸/wwo/7^s/wybwM)從4。C冰箱取出，轉接到PDA斜面，25 。C生長7天，倒入無菌水，刮取菌絲，轉接入添加少量茅蒼術枝葉提取物的PDA液體培養(yǎng) 基，25°C，搖床150r/min發(fā)酵培養(yǎng)7天作為發(fā)酵罐發(fā)酵種子。利用GBCS-5型全自動發(fā)酵罐； 5L罐裝入3L發(fā)酵液，接種量20%。好氧發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)結束后加1%瓊脂或明膠作為增稠 劑，攪拌均勻。
本發(fā)酵液用于移栽浸根。
實施例7:
菌種哈茨木霉ATCC56678 (7Wc/w血mw/^z!'anwm)從4。C冰箱取出，轉接到PDA斜面， 25'C生長7天，倒入無菌水，刮取菌絲，轉接入添加少量茅蒼術枝葉提取物的PDA液體培 養(yǎng)基，25°C，搖床150r/min發(fā)酵培養(yǎng)7天作為發(fā)酵罐發(fā)酵種子。利用GBCS-5型全自動發(fā)酵 罐；5L罐裝入3L發(fā)酵液，接種量20%。好氧發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)結束后加P/。瓊脂或明膠作為 增稠劑，攪拌均勻。
本發(fā)酵液用于移栽浸根。
實施例8:
將實施例2的擬莖點霉B3菌株(尸力tm Asp.)固體發(fā)酵培養(yǎng)物(200公斤/畝)作 為土壤中接種劑施入有連作障礙的土壤中。三個月后與對照相比，土壤微生物均發(fā)生了 積極變化，土壤中總微生物數(shù)量增加，多樣性增加，細菌數(shù)量顯著增加，霉菌數(shù)量減少， 放線菌基本穩(wěn)定，土壤中細菌數(shù)/真菌數(shù)比增加。反映土壤微生物微生物區(qū)系發(fā)展平衡。 土壤蔗糖酶比對照增加了 50%， 土壤脲酶比對照增加了 38%。實驗效果表明，栽種的茅 蒼術和對照相比長勢良好，從而達到克服連作障礙的效果。
實施例9:
分別將實施例1小菌核菌(Sc/era"wm cfe/; /i!'m'!')和實施例4孔球孢霉(Gilmaniella sp.)發(fā)酵液作為種子發(fā)芽接種劑接種茅蒼術種子，提高了發(fā)芽率，和對照相比分別提高 了 18. 2n/。、8.05。/。。生長四個月后測量生長指標，和對照相比，小菌核菌C5b7er"^/邁sp.)、 孔球孢霉(fo7/ff3m'eWasp.)均促進了生長，鮮重分別提高了 36.6%、 13.3%，須根數(shù)分別提高了 76.0%、 65.9°/。。 實施例10:
分別將實施例3的刺孢小克銀漢霉(Cw"w'"gtowe//flec/2/"MtoflAox^O接種劑、枝頂 孢霉C4cr^nom、m sp.)接種劑等在移栽時浸根。和對照相比，移栽成活率分別比對照 提高了4.4%、 3.2%。生長18個月后測量生長指標，和對照相比，干重分別提高了15.3%、 20.2%，同時和對照相比單位揮發(fā)油含量分別提高了40.8%、 31.3%。
實施例lh
將哈茨木霉(rn'c/70&n^torz/?？)在移栽時施加到根部土壤。生長18個月后測量 生長指標，和對照相比，干重提高了5.6%，茅蒼術灰斑病下降11.5%，根腐病下降9.6%。
權利要求
1、一種茅蒼術接種劑的制備方法，其特征在于，將益生菌或茅蒼術內生真菌活化，在含有茅蒼術浸汁的液體培養(yǎng)基或者含有茅蒼術秸稈的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到接種劑。
2、 根據(jù)權利要求l所說的茅蒼術接種劑的制備方法；其特征在于，菌經(jīng)活化培養(yǎng)后， 添加增稠劑或者保水劑，得到接種劑。
3、 根據(jù)權利要求2所說的茅蒼術接種劑的制備方法；其特征在于，所說的增稠劑是按重量計的O. 1%瓊脂或者0. 1%明膠或者0. 1%多糖。
4、 根據(jù)權利要求1所說的茅蒼術接種劑的制備方法；其特征在于，所說的益生菌 或者從茅蒼術分離的內生真菌是小菌核菌、小克銀漢霉、孔球孢霉、枝頂孢霉、擬莖點霉。
全文摘要
本發(fā)明涉及農業(yè)種子領域，具體涉及一種利用茅蒼術內生真菌或者益生菌生產(chǎn)茅蒼術接種劑的方法。其方法具體是將茅蒼術內生真菌或益生菌活化，在含有馬鈴薯浸汁、茅蒼術浸汁、葡萄糖液體培養(yǎng)基或者含有茅蒼術秸稈的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，添加少量增稠劑或者保水劑，用于茅蒼術種子浸種、移栽浸根或者直接添加到根際土壤中。本接種劑的生產(chǎn)不受環(huán)境影響，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)時間和產(chǎn)量易于控制，作用明顯。采用浸泡種子，浸泡植物根或澆灌，以及直接添加于土壤的方法使其作用于植物，方法簡單，易操作，用量少，成本低且均能收到良好效果。
文檔編號A01N63/04GK101444230SQ20081024323
公開日2009年6月3日 申請日期2008年12月26日 優(yōu)先權日2008年12月26日
發(fā)明者波 張, 戴傳超, 群 鞠 申請人:南京師范大學;句容市九龍藥材有限公司