專利名稱：：使用rna干擾控制線蟲的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：線蟲是以超過2，000種行栽作物、蔬菜、水果和觀賞植物的根、葉及莖為食，造成世界范圍估計一千億美元作物損失的擲J見蠕蟲樣動物。一種常見的線蟲類型是根結(jié)線蟲(RKN)，其進(jìn)食在根上造成特征性的蟲癭。其它食用#^的線蟲為更具宿主特異性的胞嚢和損傷型線蟲。線蟲破壞的征兆包括葉的生長遲緩和黃化，以及植物在熱周期中的萎蔫。然而，線蟲(包括SCN)可引起顯著的產(chǎn)量損失而沒有明顯的地上癥狀。另外，被SCN感染的根是短小的或發(fā)育遲緩的。線蟲感染可減少根上固氮根瘤的數(shù)量，并可使得根對其它土壤帶有的植物病原體的攻擊更8加易感。段6線蟲生活周期有三個主要的階段卵、幼蟲(juvenile)和成蟲。生活周期在線蟲物種之間變化。例如，在最適條件下SCN生活周期通?？稍?4到30天內(nèi)完成，而其它物種完成生活周期可耗時長達(dá)一年或更久。在春天溫度和濕度水平變得適宜時，從土壤中的卵孵化出蠕蟲狀的幼蟲。這些幼蟲是唯一能夠感染大豆根的線蟲生命階段。SCN的生活周期曾是許多研究的主題，并因此可被用作理解線蟲生活周期的例子。穿透大豆根后，SCN幼蟲穿過根移動直至它們接觸維管組織，在那里它們停止移行并開始進(jìn)食。線蟲注射分泌物，所述分泌物改變某些根細(xì)胞并將它們轉(zhuǎn)化為專門的進(jìn)食位點(diǎn)。根細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上被轉(zhuǎn)化為大的多核合胞體(或在RKN的情況下為巨大細(xì)胞)，所述多核合胞體被用作線蟲的養(yǎng)分來源。積極進(jìn)食的線蟲進(jìn)而從植物偷取必需的養(yǎng)分，導(dǎo)致產(chǎn)量損失。線蟲進(jìn)食時膨脹，并且最終雌性線蟲變得巨大以至于它們突破根組織并暴露于根的表面。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了新的植物靶基因("50657480，，)，其在SCN對大豆根感染所誘導(dǎo)的合胞體中it^達(dá)。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)當(dāng)大豆才M莫型體系中基因50657480的表達(dá)被阻抑時，線蟲感染這類^l的能力^^降低。本發(fā)明進(jìn)一步涉及雙鏈RNA分子庫，其包括多種RNA分子，每個RNA分子包含長度為約19-24個核苷酸的雙鏈區(qū)，其中所述RNA分子衍生自與50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分基本上相同的多核苷酸。段19在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能夠表達(dá)與50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分基本上相同的雙鏈RNA的轉(zhuǎn)基因線蟲抗性植物。[段20在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供能夠表達(dá)dsRNA分子庫的轉(zhuǎn)基因植物，其中每個dsRNA分子包含長度為約1924個核苷酸的雙鏈區(qū)，其中所述雙鏈RNA分子衍生自與50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分基本上相同的多核苷酸。圖2:RACE序列變體A(SEQIDNO:7)與50657480cDNA序列(SEQIDNO:l)的DNA序列比對段26]圖3:RACE變體A和50657480的重疊群共有序列(SEQIDNO:8)，可讀框用粗體字母描述。[段27圖4:展示SEQIDNO:10所述的50657480全長氨基斷列的代表性同源物的表格。該表格展示^f戈表性同源物SEQIDNO、序列類型、生物和GenBank序列Id。本發(fā)明可以通過參考以下詳細(xì)描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案及本文所包含實(shí)施例而更容易地理解。除非另外說明，本文中所用術(shù)語將根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的習(xí)慣用法加以理解。除了下文提供的術(shù)語定義外，分子生物學(xué)中常用術(shù)語的定義也可以在Rieger等，1991Glossaryofgenetics:classical和molecular,第五版,Berlin:Springer-Verlag;和在CurrentprotocolsinMolecularBiology,RM.Ausubel等編著，CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.與JohnWiley&Sons,Inc.的合資企業(yè)(1998增刊)中找到。應(yīng)當(dāng)理解如本說明書及在權(quán)利要求書中所用，"一種(a)"或"一個(an)"可以意指一個或多個，這取決于該冠詞所用的上下文。因此，對"單數(shù)細(xì)胞"的稱謂可以意指可以使用至少一個細(xì)胞。還應(yīng)當(dāng)理解本文中使用的術(shù)語僅僅旨在描述具體實(shí)施方案而并非意味對其限制性。在本申請通篇范圍內(nèi)，參考了多種專利和文獻(xiàn)出版物。全部這些出版物及這些出版物中引用的那些參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容完整地并入本申請作為參考，旨在更充分地描述本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的現(xiàn)狀。如此處所用，"互補(bǔ)的"多核苷酸是那些能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick互補(bǔ)規(guī)則威基配對的多核苷酸。具體而言，嘌呤會與嘧咬堿基配對形成鳥嘌呤與胞嘧啶配對(G:C)、對于DNA是腺嘌呤與胸腺嘧咬(A:T)、或?qū)τ赗NA是腺嘌呤與尿嘧啶配對(A:U)的組合?？梢岳斫饧词共煌耆パa(bǔ)兩種多核苷酸也可以互相雜交，只要各自具有與對方基本上互補(bǔ)的至少一個區(qū)域。如此處所用，術(shù)語"基本上互補(bǔ)"指兩個核酸序列的核苷酸至少超過80%互補(bǔ)。優(yōu)選這兩個核酸序列至少超過85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多核苷酸互補(bǔ)?；蛘撸?基本上互補(bǔ)，，指兩個核酸序列能夠在高度嚴(yán)緊的條件下雜交。如此處所用，術(shù)語"基本上相同，，或"對應(yīng)于"指兩個核酸序列具有至少80%的序列同一性。優(yōu)選這兩個核酸序列具有至少85%、卯％、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。[段38如此處所用，術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"指線性或分支的、單鏈或雙鏈的RNA或DNA或其雜合體。該術(shù)語還包括RNA/DNA雜合體。當(dāng)合成制備雙鏈RNA時，不常見的堿基(例如肌酐、5-甲基胞嘧咬、6-甲基腺嘌呤、次黃嘌呤及其他)也可用于反義RNA、雙鏈RNA和核酶配對。例如含有尿苷和胞苷的C-5丙炔類似物的多核苷酸已表明能以高親和力結(jié)合RNA并作為基因表達(dá)的有效的反義抑制劑。也可以進(jìn)行其他修飾，例如對磷酸二酯骨架的修飾或?qū)NA的核糖基團(tuán)中的2，-羥基修飾。優(yōu)選下述dsRNA用于抑制，所述dsRNA包含與50657480基因、50657480-樣基因或50657480同源物的一部分相同的核苷^列。如本文所/>開的，RNA和50657480基因、50657480-沖羊基因或50657480同源物之間100%的序列同一性是優(yōu)選的，但不是實(shí)踐本發(fā)明所必需的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白，siRNA可與靶基因具有至少1個、2個或更多個核苷酸的錯配。另外，這些錯配旨在被本發(fā)明包括。例如，在本發(fā)明中預(yù)期圖8a-8e中例證的21merdsRNA序列可含有1、2或更多個核苷酸的添加、缺失或替換，并且得到的序列仍然干擾50657480基因、50657480-樣基因或50657480同源物的功能。因此，本發(fā)明具有下述優(yōu)點(diǎn)能夠耐受由于基因操作或合成、遺傳突變、菌抹多態(tài)或進(jìn)化趨異而可以預(yù)期的序列變異。本發(fā)明的雙鏈RNA可任選地包括在一端或兩端的單鏈突出。該雙鏈結(jié)構(gòu)可以通過單鏈自身互補(bǔ)RNA鏈形成(即形成發(fā)夾環(huán))或兩個互補(bǔ)的RNA鏈形成。RNA雙鏈體的形成可以在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外起始。當(dāng)本發(fā)明的雙鏈RNA形成發(fā)夾環(huán)時，可任選地包括內(nèi)含子(如US2003/0180945A1中所述)或核苷酸間割區(qū)，該間割區(qū)是在互補(bǔ)的RNA鏈間的序列片段以穩(wěn)定細(xì)胞中的發(fā)夾轉(zhuǎn)基因。制備各種雙鏈RNA分子的方法記栽于例如WO99/53050和美國專利No.6,506,559中。RNA可以允許每個細(xì)胞輸送至少一個拷貝的量引入。更高劑量的雙鏈材料會得到更有效的抑制。植物基因的表達(dá)應(yīng)該有效地連接至適當(dāng)啟動子，該啟動子以時間優(yōu)先、空間優(yōu)先、細(xì)胞類型優(yōu)先和/或組織優(yōu)先方式使該基因表達(dá)。用于本發(fā)明表達(dá)盒的啟動子包括能夠起始存在于植物根部的植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的任何啟動子。這類啟動子包括但不限于，那些能夠從植物、植物病毒和含有在植物中表達(dá)的基因的細(xì)菌(如農(nóng)桿菌和根瘤菌)中得到的啟動子。優(yōu)選本發(fā)明的表達(dá)盒包括才艮特異性啟動子、病原體可誘導(dǎo)的啟動子或線蟲可誘導(dǎo)的啟動子。更優(yōu)選該線蟲可誘導(dǎo)的啟動子是寄生線蟲采食部位特異24性啟動子。寄生線蟲采食部位特異性啟動子可以對合胞體細(xì)胞或巨大細(xì)胞具有特異性或?qū)@兩種細(xì)胞都具有特異性。如果一個啟動子在其誘導(dǎo)狀態(tài)下的活性(通過其控制下產(chǎn)生的RNA量來測定)比未^"導(dǎo)狀態(tài)下的活性高至少30%、40%、50%，優(yōu)選至少60%、70%、80%、90%,更優(yōu)選至少100%、200%、300%,那么這個啟動子是可i秀導(dǎo)的啟動子。如果一個啟動子的活性(通過其控制下產(chǎn)生的RNA量來測定)在特定的細(xì)胞類型、組織或器官中比在同一個植物的其他細(xì)胞類型、組織中要高至少30%、40%、50%,優(yōu)選至少60%、70%、80%、卯％，更優(yōu)選至少100%、200%、300%，那么這種啟動子是細(xì)胞、組織或器官特異性啟動子，優(yōu)選所迷其他的細(xì)胞類型或組織是相同植物器官(例如根)的細(xì)胞類型或組織。在器官特異性啟動子的情況中，啟動子活性應(yīng)該與其他植物器官中的啟動子活性比較，例如葉、莖、花或種子。段59啟動子可以是組成型的、可誘導(dǎo)的、發(fā)育階段優(yōu)先的、細(xì)胞類型優(yōu)先的、組織優(yōu)先的或器官優(yōu)先的。組成型啟動子在大多數(shù)情況下都有活性。組成型啟動子的非限制實(shí)例包括CaMV19S和35S啟動子(Ode11等人，1985,Nature313:810-812)、sXCaMV35S啟動子(Kay等人，1987，Science236:1299-1302)、Sepl啟動子、稻肌動蛋白啟動子(McElroy等人，1990，PlantCell2:163-171)、擬南芥肌動蛋白啟動子、泛素啟動子(Christensen等人，1989，PlantMolec.Biol.18:675-689)、pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81:581-588)、玄參花斑病病毒35S啟動子、Smas啟動子(Velten等人，1984，EMBOJ.3:2723-2730)、GRP1-8啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子(美國專利5,683,439)、來自農(nóng)桿菌屬T-DNA的啟動子，例如甘露堿合成酶、胭脂堿合成酶和章魚堿合成酶、核酮糖磷酸氫鹽羧化酶(ssuRUBISCO)啟動子的小亞基等。優(yōu)選在接觸寄生線蟲的細(xì)胞中表達(dá)雙鏈RNA的啟動子?；蛘?，所述啟動子可以驅(qū)動雙鏈RNA在遠(yuǎn)離接觸線蟲的部位的植物組織中表達(dá)，然后該雙鏈RNA可以由植物轉(zhuǎn)運(yùn)至接觸在特定細(xì)胞中的寄生線蟲的細(xì)胞中，或接近采食部位，例如合胞體細(xì)胞或巨大細(xì)胞。[段60可誘導(dǎo)的啟動子在特定環(huán)境條件下是有活性的，例如存在或缺乏營養(yǎng)素或代謝產(chǎn)物、熱或冷、光照、病原體攻擊、缺氧條件等。例如，已經(jīng)表明啟動子TobRB7、AtRPE、AtPyklO、Geminil9和AtHMGl可以由線蟲誘導(dǎo)(對于線蟲可誘導(dǎo)的啟動子的綜述，請參見Ann.Rev.Phytopathol.(2002)40:191國219;還參見U.S.Pat.No.6,593,513)。分離可以由線蟲誘導(dǎo)的其他啟動子的方法在美國專利5,589,622和5,824,876中列出。其他可以誘導(dǎo)的啟動子包括蕓苔屬的hsp80啟動子，其可由熱休克誘導(dǎo)；PPDK啟動子，其由光誘導(dǎo)；煙草、擬南芥和玉蜀黍的PR-1啟動子，其可以由病原體感染誘導(dǎo)；和Adhl啟動子，其由缺氧和冷脅迫誘導(dǎo)。植物基因表達(dá)也可由可誘導(dǎo)的啟動子促進(jìn)(關(guān)于綜述參見Gatz，1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48:89-108)。如果需要時間特異性基因表達(dá)，可化學(xué)誘導(dǎo)的啟動子特別適用。這種啟動子的非限制性實(shí)例是可7jC楊酸誘導(dǎo)的啟動子(PCT申請No.WO95/19443)、可四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動子(Gatz等人，1992，PlantJ.2:397-404)和可乙醇誘導(dǎo)的啟動子(PCT申請No.WO93/21334).用于本發(fā)明的表達(dá)盒的其他啟動子包括但不限于，主要葉綠素a/b結(jié)合蛋白啟動子、組蛋白啟動子、Ap3啟動子、p-conglycin啟動子、油菜籽蛋白啟動子、大豆凝集素啟動子、玉蜀黍15kD玉米醇溶蛋白啟動子、22kD玉米醇溶蛋白啟動子、27kD玉米醇溶蛋白啟動子、g-玉米醇溶蛋白啟動子、蠟質(zhì)基因(waxy)啟動子、超甜基因(shrunken)1啟動子、超甜基因2啟動子和bronze基因啟動子、Zml3啟動子、(美國專利號5，086，169)、玉蜀黍多聚半乳糖醛酸酶啟動子(PG)(美國專利號5，412，085和5，545，546)和SGB6啟動子(美國專利號5,470,359)，以及合成的或其他天然啟動子。[段641根據(jù)本發(fā)明，所述表達(dá)盒包括與核苷酸序列有效連接的表達(dá)控制序列，該核苷酸序列是所述雙鏈RNA的一條或兩#^的模板。該雙鏈RNA模板包括(a)第一鏈，具有與SEQIDNO:l、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的大約19~約500個或至多全長的連續(xù)核苷酸基本上相同的序列；和(b)第二鏈，具有與第一鏈基本上互補(bǔ)的序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，啟動子位于所述才莫板核苷酸序列任一端的側(cè)翼，其中所述啟動子驅(qū)動各個單獨(dú)的DNA鏈的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生兩條互補(bǔ)的RNA，這兩條互補(bǔ)的RNA能夠雜交并形成所述雙鏈RNA。在備選的實(shí)施方案中，核苷酸序列在一個轉(zhuǎn)錄單元上被轉(zhuǎn)錄成雙鏈RNA的兩條鏈，其中，正義鏈從轉(zhuǎn)錄單元的5，端轉(zhuǎn)錄，而反義鏈從3，端轉(zhuǎn)錄，其中這兩條鏈隔開約3到約500個堿基對，并且轉(zhuǎn)錄之后，該RNA轉(zhuǎn)錄物自身折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。[段65在另一個實(shí)施方案中，所述栽體含有雙向啟動子，驅(qū)動兩個核酸分子的表達(dá)，由此一個核酸分子編碼與50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分基本上相同的序列，而另一個核酸分子編碼與第一鏈基本上互補(bǔ)的第二序列，并且當(dāng)兩個序列都轉(zhuǎn)錄時能夠形成雙鏈RNA。雙向啟動子是能夠在兩個方向介導(dǎo)表達(dá)的啟動子。[段66在另一個實(shí)施方案中，所述載體含有兩種啟動子，一個介導(dǎo)與50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分基本上相同的序列的轉(zhuǎn)錄，另一個啟動子介導(dǎo)與第一鏈基本上互補(bǔ)的第二序列的轉(zhuǎn)錄，并且當(dāng)兩個序列都轉(zhuǎn)錄時能夠形成雙鏈RNA。第二啟動子可以是不同的啟動子。不同啟動子指就細(xì)胞或組織特異性來說具有不同活性，或?qū)χT如病原體、非生物脅迫或化學(xué)品等不同的誘導(dǎo)物呈現(xiàn)表達(dá)的啟動子。例如，一個啟動子可以是組成型的或組織特異性的，而另一個則可能是組織特異性或可,皮病原體誘導(dǎo)的。在一個實(shí)施方案中，一個啟動子介導(dǎo)與過表達(dá)50657480基因相適應(yīng)的核酸分子的轉(zhuǎn)錄，而另一個啟動子介導(dǎo)互補(bǔ)核酸的組織或細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄或病原體誘導(dǎo)的表達(dá)。段67本發(fā)明還涉及能表達(dá)本發(fā)明的雙鏈RNA、進(jìn)而抑制根部、采食部位、合胞體和/或巨大細(xì)胞中的50657480-樣基因或50657480同源物(耙基因)的轉(zhuǎn)基因植物。[段68所述植物或轉(zhuǎn)基因植物可以是諸如但不限于樹、切花(cutflowers)、觀賞植物、蔬菜或農(nóng)作物植物的任何植物。上述植物可來自選自以下的屬苜蓿屬(Medicago)、番茄屬(Lycopersicon)、蕓苔屬(Brassica)、香瓜屬(Cucumis)、癡屬(Solanum)、核杉匕屬(Juglans)、棉屬(Gossypium)、蘋果屬(Malus)、葡萄屬(Vitis)、金魚草屬(Antirrhinum)、楊屬(Populus)、草莓屬(Fragaria)、擬南芥屬(Arabidopsis)、云杉屬(Picea)、辣椒屬(Capsicum)、藜屬(Chenopodi腿)、菊屬(Dendranthema)、牽牛屬(Pharbitis)、松屬(Pinus)、豌豆屬(Pisum)、稻屬(Oryza)、玉蜀黍?qū)?Zea)、小麥屬(Triticum)、黑小麥屬(Triticale)、黑麥屬(Secale)、黑麥草屬(Lolium)、大麥屬(Hordeum)、大豆屬(Glycine)、黃杉屬(Pseudotsuga)、伽藍(lán)菜屬(Kalanchoe)、甜菜屬(Beta)、向日葵屬(Helianthus)、煙草屬(Mcotiana)、南瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、草莓屬(Fragaria)、百樂M艮屬(Lotus)、苜蓿屬、驢食草屬(Onobrychis)、車軸草屬(trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、虹豆屬(Vigna)、橘屬(Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子屬(Hyoscyamus)、煙草屬、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、Majorana、菊苣屬(Ciahorium)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬(Asparagus)、金魚草屬(Antirrhinum)、萱草屬(Heterocallis)、7jC仙屬(Nemesis)、天竺葵屬(Pelargonium)、稷屬(Panicum)、狼尾草屬(Penniset腿)、毛萊屬(Ranunculus)、千里光屬(Senecio)、喇叭舌屬(Salpiglossis)、藍(lán)英花屬(Browaalia)、菜豆屬(Phaseolus)、燕麥屬(Avena)和蔥屬(Allium)，或者所述植物可以選自選自下列屬的屬擬南芥屬、苜蓿屬、番茄屬、蕓苔屬、香瓜屬、茄屬、核桃屬、棉屬、蘋果屬、葡萄屬、金魚草屬、Brachipodium、楊屬、草莓屬、擬南芥屬、云杉屬、辣椒屬、藜屬、菊屬、牽牛屬、松屬、豌豆屬、稻屬、玉蜀黍?qū)佟⑿←湆?、黑小麥屬、黑麥屬、黑麥草屬、大麥屬、大豆屬、黃杉屬、伽藍(lán)菜屬、甜菜屬、向曰葵屬、煙草屬、南瓜屬、薔薇屬、草莓屬、百脈才艮屬、苜蓿屬、驢食草屬、車軸草屬、胡盧巴屬、魟豆屬、橘屬、亞麻屬、老鸛草屬、木薯屬、胡蘿卜屬、蘿卜屬、白芥屬、顛茄屬、曼陀羅屬、天仙子屬、煙草屬、碧冬茄屬、毛地黃屬、Majorana、菊苣屬、萵苣屬、雀麥屬、天門冬屬、金魚草屬、萱草屬、水仙屬、天竺葵屬、稷屬、a^草屬、毛莨屬、千里光屬、喇叭舌屬、藍(lán)英花屬、菜豆屬、燕麥屬和蔥屬。在一個實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。29[段69優(yōu)選地，所述植物是農(nóng)作物植物。農(nóng)作物植物是用于農(nóng)業(yè)的所有植物。因此在一個實(shí)施方案中，所述植物是單子葉植物，優(yōu)選禾本科(Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或鳳梨科(Bromeliaceae)植物，優(yōu)選是禾本科植物。因此，在又一個實(shí)施方案中，所述植物是禾本科玉蜀黍?qū)?、小麥屬、稻屬、大麥屬、黑麥屬、燕麥屬、甘蔗?Saccharum)、高粱屬(Sorghum)、狼尾草屬、狗尾草屬(Setaria)、稷屬、糝屬(Eleusine)、芒屬(Miscanthus)、短柄草屬(Brachypodium)、羊茅屬(Festuca)或黑麥草屬植物。當(dāng)植物是玉蜀黍?qū)贂r，優(yōu)選物種是玉米(Zefl附《")。當(dāng)該植物是小麥屬時，優(yōu)選物種是普通小麥(7Wric"wfl"ftVww)、斯佩爾特小麥(7WftVi/附s/7e/似e)或石更粒小麥(7WricM柳i/wr"附)。當(dāng)所述植物是稻屬時，優(yōu)選物種是稻(asrivfl)。當(dāng)所述植物是大麥屬植物時，優(yōu)選物種是大麥(好on/ewwv/gre)。當(dāng)所述植物是黑麥屬植物時，優(yōu)選物種是黑麥0S"fl/e"""/e)。當(dāng)戶斤述植物是燕麥屬植物時,優(yōu)選物種是燕麥(」ve"flsarivfl)。當(dāng)所述植物是甘蔗屬植物時，優(yōu)選物種是甘蔗(51.oj^"Viflr"附)。當(dāng)所述植物是高粱屬植物時，優(yōu)選物種是蜀黍(51.v"/g"—、兩色蜀黍(XWco/w)或蘇丹草(51.s"^me"M)。當(dāng)所述植物是狼尾草屬植物時，優(yōu)選物種是御谷(i^WW&CW附g/flfMC"附)。當(dāng)所述植物是狗尾草屬植物時，優(yōu)選物種是谷子OSe似Wfl;to/,Vfl)。當(dāng)所述植物是稷屬植物時，優(yōu)選物種是野生稷CP朋&MW附//|7|""附)或杉卩才支稷(尸""1>"附vi7^"似附)。當(dāng)戶斤述植物是糝屬(Eleusine)植物時，優(yōu)選物種是糝子(E/e附/"ecomc""fl)。當(dāng)所述植物是芒屬植物時，優(yōu)選物種是芒(Miscanthussinensis),當(dāng)所述植物是羊茅屬(Festuca)植物時，優(yōu)選物種是苯狀羊茅(f"r""力'"ar/")、紫羊茅(fr^rfl)或草甸草(f/7mfe朋的。當(dāng)所述植物是黑麥草屬植物時，優(yōu)選物種是多年生黑麥草/erewwe)或多花黑麥草(2^/|.附附wtoy7wM附)?；蛘?，所述植物是黑小麥屬(7)7Y,'c仍ecfl/e)。[段70或者在一個實(shí)施方案中，植物是雙子葉植物，優(yōu)選地是豆科(尸"6flcefle)、癡科(iSo/fl""ce"e)、十字花科(jBAms/cflceae)、藜科(Orewo"rf/ffceae)、菊科(Jsterflcefle)、錦葵科(Mfl/v"ce<ie)、亞麻科(￡/ce"e)、大戟科(五"/;/^r6/ace"e)、旋花科(Cowvo/vM/"cefle)、薔薇科(/仍tfce"e)、葫聲科(C"cw6/似"fle)、山茶科(77ie"ce"e)、萏草科(7"6/"ce"e)、梧桐科0Ste/rM/iV/ce^)或柑橘科(O船)的植物。在一個實(shí)施方案中，植物是豆科(FMacefire)、茄科(5W^mflc^e)或十字花科C6mss/c"cefle)的植物。因此，在一個實(shí)施方案中，植物是豆科(/^6""^)，優(yōu)選地是大豆屬(G(vc/"e)、豌豆屬0P&"附)、落花生屬04mc/^)、鷹嘴豆屬(C7cw)、蠶豆屬(Wc/")、菜豆屬(/^oyeo/ws)、羽扇豆屬(丄w尸/"—、苜蓿屬(A/^Z/c"go)或兵豆屬(Lens)。優(yōu)選的豆科(/^i^ice"e)物種是截形苜蓿(Af.^朋cfl/"/")、紫苜蓿(Af.SflftVfl)、大豆(G附ax)、碗豆(/5^/vw附)、花生(j./ry/70gefl)、鷹嘴豆(C肌"/"附)、香豆(K/flAtf)、菜豆(7v"/^lWs1)、白羽扇豆(丄Mj0lVl"51"/6ms1)、黃羽扇豆(丄m//""51/w,ews)、狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius)或兵豆(丄e附c"/,'"fl,/y)。更優(yōu)選的是大豆(G附ox)、花生(A/i"w^i)和紫苜蓿(M.sariv")物種。最優(yōu)選的是大豆(G/wox:)。當(dāng)植物是茄科CSo/"w"ce"e)時，優(yōu)選的屬是茄屬(5W"ww/w)、番癡屬(Z^co/em'co")、煙草屬(A7coftVifm)或辣椒屬(Ca戸'c歸)。優(yōu)選的癡科物種是馬鈴薯(X似Amw"附)、番癡(丄.Mcw/efif畫)、煙草(7V:f由cc謂)或黃燈籠辣椒(Cd/"eww入更優(yōu)選的是馬鈴薯(51.似6emy"/w)。因此，在一個實(shí)施方案中，植物是十字花科(5nm/aicefle),優(yōu)選的是蕓苔屬(5/vmZai)或蘿卜屬(及"/^做"s)。優(yōu)選的十字花科(5mw/c"ce"e)物種是歐洲油菜(Awfl/ms)、甘藍(lán)CB.o/emce)、芥菜CB./7ificefl)或充青(jB.ni/7fl)物種。更優(yōu)選的是歐洲油菜CB./mpMS)物種。當(dāng)植物是藜科(C&朋/wflf/"""e)時，優(yōu)選的屬是甜菜屬(5eto)，優(yōu)選的物種是甜菜(及v"/ga吻)。當(dāng)植物是菊科04Wmic^e)時，優(yōu)選的屬是向日葵屬(/^/iVm幼附)，優(yōu)選的物種是向日葵(TZ.fl朋"附)。當(dāng)植物是錦葵科(Mfl/VflCMe)時，優(yōu)選的屬是棉屬(G仍5^/WW)或秋葵屬(^Ae/附仍c^附)。當(dāng)屬是棉屬(G仍s);/7/w附)時，優(yōu)選的物種是陸地棉(GA/rs"似附)或海島棉(G6"/^w/e附e)，最優(yōu)選的物種是陸地棉(G/^rsw,"附)。秋葵屬(J^/附^cA附)的優(yōu)選的物種是咖啡黃葵(^.^cw/ew似力。當(dāng)植物是亞麻科(l/miceM)時，優(yōu)選的屬是亞麻屬(丄/mi附)，優(yōu)選的物種是亞麻(丄.M5ito,/ss/zw"w)。當(dāng)植物是大戟科(jE"M/7/rw6i'flc^ie)時,優(yōu)選的屬是木薯屬(Mawi7^r)、麻風(fēng)樹屬(/fl&印a)或Rhizinus，優(yōu)選的物種是木薯(M.escw/ew似)、麻風(fēng)樹(/或/.co附ww/s。當(dāng)植物是旋花科(aww/vM/flce"e)時，優(yōu)選的屬是番薯屬(//^附^)，優(yōu)選的物種是/.^,"tos。當(dāng)植物是薔薇科(/仍tf""e)時，優(yōu)選的屬是薔薇屬(/w")、蘋果屬(Mfl/""、梨屬(/^r"s)、李屬(iV"""s)、懸鉤子屬(及"6ws)、茶薦子屬(及幼")、越橘屬(^w"Vi/扁)或草莓屬CFmg",/ff),優(yōu)選的物種是雜種荷蘭草莓(Frflgfl"Vi;c。當(dāng)植物是葫蘆科(C"c"f6/toce"e)時，優(yōu)選的屬是香瓜屬(Cwcw附&)、西瓜屬(C7《r"http://"s)或南瓜屬(C"cur6/to)，優(yōu)選的物種是黃瓜(Cmcm附Zssfl,/v"s)、西瓜(0//"5/朋tf似s)或西葫,(CWw,6/to。當(dāng)植物是山茶科(77^fl"m)時，優(yōu)選的屬是山茶屬(0^^///<0,優(yōu)選的物種是茶(c.w'"e附/s)。當(dāng)植物是茜草科(及"6iVice"e)時，優(yōu)選的屬是咖啡屬(a/7^)，優(yōu)選的物種是小果咖啡(C.arfl^V")或中果咖啡(C.c朋印/^r")。當(dāng)植物是梧桐科(5&^"http://"""《)時，優(yōu)選的屬是可可樹屬(77^M/Wfifl)，優(yōu)選的物種是可可樹(rc"cm)。當(dāng)植物是柑橘屬(Ows)時，優(yōu)選的物種是甜橙(C.s/wews/s)、檸檬(C.//附o")、桔(C.rW/cw/a似)、^由(G附ax/附a)和才甘橘物種的雜種等等。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，植物是大豆、馬鈴薯或玉米植物。段71轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染包括植物細(xì)胞的宿主細(xì)胞的適當(dāng)方法在植物生物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)已知。任何方法都可以用于將重組表達(dá)栽體轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞中以獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)化雙子葉植物的一般方法公開于例如美國專利號4,940,838和5,464,763等中。轉(zhuǎn)化具體雙子葉植物(例如棉花)的方法在美國專利號5，004，863、5,159,135和5,846,797中列出。大豆轉(zhuǎn)化方法于美國專利號4，992，375、5,416,011、5,569,834、5，824，877和6，384，301中列出，也可以使用EP0301749B1中的方法。[段72轉(zhuǎn)化方法可包括直接或間接轉(zhuǎn)化法。適當(dāng)?shù)闹苯臃òň垡叶颊T導(dǎo)的DNA才聶取、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(US4,536,475)、用基因槍的生物發(fā)射技術(shù)(FrommME等人，Bio/Technology.8(9):833-9，1990;Gordon-Kamm等人PlantCell2:603,1990)、電穿孔、在含DNA的溶液32中孵育干胚的方法和^:注入法。在直接轉(zhuǎn)化法的情況下，所用質(zhì)粒不需要滿足任何特殊要求。可以使用簡單的質(zhì)粒，例如pUC系列的質(zhì)粒、pBR322、M13mp系列和pACYC184等等。如果要從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生完整的植物，優(yōu)選在質(zhì)粒中有一個附加的選擇性標(biāo)記基因。直接轉(zhuǎn)化技術(shù)對雙子葉和單子葉植物都同等適用。段73還可以通過利用農(nóng)桿菌(例如EP0116"S)的細(xì)菌感染、利用病毒載體(EP0067553、US4,407,956、WO95/34668、WO93/03161)的病毒感染來進(jìn)行轉(zhuǎn)化或借助花粉轉(zhuǎn)化(EP0270356;WO85/01856;US4,684,611)。農(nóng)桿菌類轉(zhuǎn)化技術(shù)(尤其是對于雙子葉植物)為本領(lǐng)域公知的技術(shù)。農(nóng)桿菌菌林(例如才艮癌農(nóng)桿菌或發(fā)才艮農(nóng)桿菌(爿g/Y^fl"er/ww/7^oge"es))包括質(zhì)粒(Ti或Ri質(zhì)粒)和用農(nóng)桿菌感染之后轉(zhuǎn)移入植物的T-DNA元件。該T-DNA(轉(zhuǎn)移DNA)被整合到植物細(xì)胞的基因組中。T-DNA可定位在Ri-或Ti-質(zhì)粒上，或者分開包括在所謂的雙元載體中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法記載于例如HorschRB等人(1985)Science225:1229中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化最適用于雙子葉植物，也已經(jīng)適用于單子葉植物。用農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化記載于下列文獻(xiàn)中，例如WhiteFF，VectorsforGeneTransferinHigherPlants,TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,S.D.Kung和R.Wu編著，AcademicPress,1993，第15—38頁、JenesB等人TechniquesforGeneTransfer,TransgenicPlants,第1巻，EngineeringandUtilization,S.D.Kung和R.Wu編著，AcademicPress,1993,第128-143頁和Potrykus(1991)AnnuRevPlantPhysiolPlantMolecBiol42:205-225中。[段74轉(zhuǎn)化可能會導(dǎo)致瞬時或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化和表達(dá)。雖然本發(fā)明的核苷酸序列可以插入到屬于這些廣泛類別的任何植物和植物細(xì)胞中，但是它特別適用于農(nóng)作物植物細(xì)胞。段75利用植物育種中的已知方法，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以與相似的轉(zhuǎn)基因植物雜交，或與缺少本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)基因植物雜交，或與非轉(zhuǎn)基因植物雜交，來產(chǎn)生種子。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可包括、和/或與另一種含有一種或多種核酸的轉(zhuǎn)基因植物雜交，從而在該植物和/或其后代中形成轉(zhuǎn)基因的"垛疊"。然后種植種子來得到雜交的能育的含有本發(fā)明核酸的轉(zhuǎn)基因植物。該雜交能育的轉(zhuǎn)基因植物可以具有特定的通過母本或通過父本遺傳的表達(dá)盒。第二代植物可以是近交植物。雜交的能育轉(zhuǎn)基因植物可以是雜交種。本發(fā)明還包括任何這些雜交能育轉(zhuǎn)基因植物的種子。本發(fā)明種子可從能育轉(zhuǎn)基因植物收獲，并用于生長包括含有所述DNA構(gòu)建體的雜交植物系的本發(fā)明轉(zhuǎn)化植物的后代。[段76"基因垛疊"也可以用植物轉(zhuǎn)化通過將兩個或多個基因轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核中來實(shí)現(xiàn)。在轉(zhuǎn)化過程中多個基因可以引入細(xì)胞核中，無論是依次引入還是一次引入。利用針對多個連鎖的部分目的序列的單次轉(zhuǎn)基因，可以通過基因沉默機(jī)制特別是RNAi下調(diào)植物中或目的病原體物種中的多個基因。在單獨(dú)啟動子控制下的垛疊的多個基因也可以過表達(dá)，來得到所需的單個或多個表型。含有既包括過表達(dá)基因又包括沉默靶基因的基因垛疊的構(gòu)建體也可以引入植物中，獲得單個或多個農(nóng)藝學(xué)重要表型。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸序列可以與任何目的多核苷酸序列的組合垛疊，以形成所需的表型。這些組合可以產(chǎn)生具有多種性狀組合的植物，這些性狀包括但不限于，疾病抗性、除草劑耐受、產(chǎn)量升高、耐冷和抗旱。這些垛疊組合可以通過包括但不限于常規(guī)方法或遺傳轉(zhuǎn)化方法雜交育種植物的任何方法形成。如果通過遺傳轉(zhuǎn)化法垛疊所述性狀，目的多核苷酸可以以任何順序依次組合或同時組合。例如，如果要引入兩個基因，這兩個序列可以包含在分別的轉(zhuǎn)化盒中，或在同一個轉(zhuǎn)化盒中。這些序列的表達(dá)可以被同一個啟動子或不同啟動子驅(qū)動。[段77才艮據(jù)本實(shí)施方案，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物用包括如下步驟的方法生產(chǎn)提供、制備具有與50657480基因、50657480-樣基因或50657480同源物的一部分基本上相同的第一區(qū)和與第一區(qū)基本上互補(bǔ)的第二區(qū)的表達(dá)盒；將該表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入植物中；選擇表達(dá)本發(fā)明雙鏈RNA構(gòu)建體的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的子代。[段78本發(fā)明可用于減少任何植物寄生線蟲造成的農(nóng)作物破壞。優(yōu)34選地，寄生線蟲屬于誘導(dǎo)巨細(xì)胞或合體細(xì)胞的線蟲科。誘導(dǎo)巨細(xì)胞或合胞體細(xì)胞的線蟲存在于長針線蟲科(Longidoridae)、毛刺線蟲科(Trichodoridae)、異皮線蟲科(Heterodidae)、才艮結(jié)線蟲科(Meloidogynidae)、短體線蟲科(Pratylenchidae)或小墊刃線蟲科(Tylenchulidae)。尤其存在于異皮線蟲科和根結(jié)線蟲科中。[段79因此，本發(fā)明靶向的寄生線蟲屬于選自以下的一個或多個屬偽根瘤線蟲屬(Naccobus)、仙人掌胞嚢線蟲屬(Cactodera)、長形胞嚢線蟲屬(Dolichodera)、球胞嚢線蟲屬(Globodera)、胞嚢線蟲屬(Heterodera)、Punctodera、長4十線蟲屬(Longidorus)或才艮結(jié)線蟲屬(Meloidogyne)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生線蟲屬于選自以下的一個或多個屬偽根瘤線蟲屬、仙人掌胞嚢線蟲屬、長形胞嚢線蟲屬、球胞嚢線蟲屬、胞嚢線蟲屬、Punctodera或根結(jié)線蟲屬。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生線蟲屬于選自以下的一個或多個屬球胞嚢線蟲屬、胞嚢線蟲屬或根結(jié)線蟲屬。在一個甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生線蟲屬于選自球胞嚢線蟲屬或胞嚢線蟲屬(Heterodera)中一個或兩個的屬。在另一個實(shí)施方案中，寄生線蟲屬于根結(jié)線蟲屬。[段80當(dāng)寄生線蟲是球胞嚢線蟲屬(G/M^/mi)時，寄生物種優(yōu)選地來自蓍草球胞嚢線蟲(Gflc/^//e"e)、蒿球胞嚢線蟲(G"rfe附/wVie義枸杞球胞嚢線蟲(G/^/^/"i')、G附eA:/amflr、歐著草球胞嚢線蟲(G附///咖///)、喬巴特棘皮線蟲(G附fl&'人馬鈴薯白線蟲(G/m//iW)、馬鈴薯金線蟲(Gra對0c7^附的、煙草球胞嚢線蟲(GtoZwc"附)和弗吉亞球胞嚢線蟲(Gv/^/",Vie)。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生球胞嚢線蟲屬(Gto幻&m)線蟲包括至少一種物種馬鈴薯白線蟲、煙草球胞嚢線蟲或馬鈴薯金線蟲。當(dāng)寄生線蟲是胞嚢線蟲屬(iyeten^mi)時，物種可優(yōu)選地來自燕麥胞嚢線蟲(H.avenae)、胡蘿卜胞嚢線蟲(H.carotae)、鷹嘴豆胞嚢線蟲(H.ciceri)、十字花科胞嚢線蟲(H.cruciferae)、龍爪稷胞嚢線蟲(H.delvii)、褐藻胞嚢線蟲(H.dachista)、菲氏胞嚢線蟲(H.filipjevi)、岡比亞胞嚢線蟲(H.gambiensis)、大豆胞嚢線蟲、豌豆胞嚢線蟲(H.goettingiana)、蕎麥異皮線蟲(H.gradimi)、嘩酒花胞嚢線蟲(H.humuli)、大麥異皮線蟲(H.hordecalis)、麥類胞嚢線蟲(H.latipons)、燕麥異皮線蟲(H.major)、苜蓿胞嚢線蟲(H,medicaginis)、7jC稻同居胞嚢線蟲(H.oryzicola)、巴基斯坦胞囊線蟲(H.pakista醒sis)、玫瑰胞嚢線蟲(H.rosii)、甘蔗胞嚢線蟲(H.sacchari)、甜菜胞嚢線蟲(H.schachtii)、蜀黍胞嚢線蟲(H.sorghi)、三葉草胞囊線蟲(H.trifolii)、蕁麻胞囊線蟲(H.urticae)、木豆胞嚢線蟲(H.vigni)和玉米胞嚢線蟲(H.zeae)。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生胞嚢線蟲屬線蟲包括至少一種物種大豆胞嚢線蟲、燕麥胞嚢線蟲、木豆胞嚢線蟲(H.cajani)、豌豆胞囊線蟲、三葉草胞嚢線蟲、玉米胞嚢線蟲或甜菜胞嚢線蟲。在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生線蟲包括至少一種物種大豆胞嚢線蟲或甜菜胞嚢線蟲。在一個最優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生線蟲是物種大豆胞嚢線蟲。段81當(dāng)寄生線蟲是根結(jié)線蟲屬(Me/wVfegv"e)時，寄生線蟲可選自高粱才艮結(jié)線蟲(M.acronea)、M.arabica、花生才艮結(jié)線蟲(M.arenaria)、甘藍(lán)根結(jié)線蟲(M.artiellia)、短尾根結(jié)線蟲(M.brevicauda)、山茶根結(jié)線蟲(M.camelliae)、奇氏才艮結(jié)線蟲(M.chitwoodi)、咖啡根結(jié)線蟲(M.cofdcola)、短小根結(jié)線蟲(M.esigua)、禾草根結(jié)線蟲(M.graminicola)、北方根結(jié)線蟲(M.hapla)、南方才艮結(jié)線蟲(M.incognita)、印度才艮結(jié)線蟲(M.indica)、海濱根結(jié)線蟲(M.inornata)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)、林氏根結(jié)線蟲(M.lini)、蘋果根結(jié)線蟲(M.mali)、小頭根結(jié)線蟲(M.microcephala)、小突根結(jié)線蟲(M.microtyla)、納西根結(jié)線蟲(M.naasi)、薩拉斯根結(jié)線蟲(M.salasi)和花生;f艮結(jié)線蟲(M.thamesi)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，寄生線蟲包括至少爪哇根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲或奇氏根結(jié)線蟲。[段821本發(fā)明還提供一種抑制50657480基因、50657480-樣基因或50657480同源物表達(dá)的方法。才艮據(jù)該實(shí)施方案，該方法包括對所述植物施用本發(fā)明的雙鏈RNA的步驟。[段83下列實(shí)施例并不意味著限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，而意在作為某些實(shí)施方案的示例性描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)水平內(nèi)的對這些示例性方法的任何改變都應(yīng)落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例1:從大豆克隆50657480合胞體的激光切割段84使大豆栽培種Williams82(G(v""e/waxcv.Williams82)在瓊脂平板上萌發(fā)三天，然后轉(zhuǎn)移至萌發(fā)袋中。一天后，用大豆胞嚢線蟲3號小種的第二階段幼蟲(J2)孵育每個幼苗。接種后六天，使用已知方法將新的根組織切成1cm長的段、固定、包埋在cryomold中并切片。通過擴(kuò)大的細(xì)胞尺寸、增厚的細(xì)胞壁和稠密的細(xì)胞質(zhì)的特有形態(tài)識別合胞體細(xì)胞，并<吏用PALM顯樣i鏡(P.A.L.M.MicrolaserTechnologiesGmbH,Bernried，德國)切碎放入RNA提取緩沖液中。使用已知方法提取總細(xì)胞RNA、擴(kuò)增并用熒光標(biāo)記。作為對照，從"非-合胞體"和未經(jīng)處理的對照根分離總RNA并進(jìn)行相同的RNA擴(kuò)增過程。將擴(kuò)增的RNA與私人擁有的大豆cDNA陣列雜交。[段85j如表2中所述，大豆cDNA克隆50657480被鑒定為在SCN-感染的大豆根的合胞體中被上調(diào)。大豆cDNA克隆50657480(SEQIDNO:l)的^J^絲列被描述為SEQIDNO:3。50657480cDNA序列(SEQIDNO:l)被測定為不是全長的，因?yàn)椴淮嬖贏TG起始密碼子。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實(shí)施例2:轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)根的產(chǎn)生和線蟲生物測定該示范方法使用含有50657480耙基因片段的二元載體。該載體由靶50657480基因的反義片段、間隔區(qū)、耙基因的有義片段和載體主鏈組成。50657480cDNA克隆的序列描述為SEQIDNO:l。使用對應(yīng)于SEQIDNO:l的核苷酸7到483的、SEQIDNO:2所描述的耙基因片段構(gòu)建二元載體RAW464。在RAW464中，50657480耙基因的dsRNA在過氧化物酶基因啟動子一一合胞體或根優(yōu)選的啟動子p-At5g05340(美國臨時申請?zhí)朜o:60/899,693SEQIDNO:6)下表達(dá)。該啟動子優(yōu)選地在根和/或合胞體或巨大細(xì)胞中驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達(dá)。二元載體中的植物可選擇標(biāo)記物是由天然擬南芥AHAS啟動子驅(qū)動的來自擬南芥的乙酰羥酸合酶(AHAS)基因的抗除草劑形式(Sathasivan等人，PlantPhys.97:1044-50，1991)。使用ARSENAL(imazapyr，BASFCorp,FlorhamPark,NJ)作為選擇劑。[段86通過電穿孔將二元載體RAW464轉(zhuǎn)化進(jìn)毛根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogene)K599菌抹中，并使用已知方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因發(fā)根。通過轉(zhuǎn)化產(chǎn)生若干獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因發(fā)才沐系。還通過使用未轉(zhuǎn)化的毛根土壤桿菌產(chǎn)生來自大豆栽培種Williams82(SCN易感)和Jack(抗SCN)的非轉(zhuǎn)基因發(fā)根，以作為測定中線蟲生長的對照。用SCN3號小種的第二階段幼蟲(J2)接種每種林系的發(fā)根培養(yǎng)物。線蟲接種后四周，計數(shù)每個孔中的胞囊數(shù)。對RAW464轉(zhuǎn)基因根林系而言，存在顯示6-7和11-18左右平均胞嚢計數(shù)的多個林系，相比較而言，易感林系Williams82(W82)和已知抗性林系Jack的平均胞嚢計數(shù)分別為24和26，與1和1。這些生物測定結(jié)果指出，在RAW464中表達(dá)的雙鏈RNA導(dǎo)致降低的胞嚢計數(shù)。實(shí)施例3:測定50657480全長轉(zhuǎn)錄序列(SEQIDNO:l)的RACE[段87j使用來自Invitrogen的GeneRacer試劑盒(Ll502-01),根據(jù)制造商i兌明，實(shí)現(xiàn)對應(yīng)于50657480所迷cDNA序列(SEQIDNO:l)的全長轉(zhuǎn)錄本序列的擴(kuò)增。用于初級PCR反應(yīng)的引物由SEQIDNO:12和14描述。次級嵌套PCR反應(yīng)引物由SEQIDNO:13和15描述。[段88如圖2中所示，SEQIDNO:7是50657480的5'片段。根據(jù)圖2中所示SEQIDNO:7和SEQIDNO:l的比對，分離了推定的全長重疊群序列并由SEQIDNO:8描述。在SEQIDNO:8重疊群序列中存在可讀框，如圖3所示，其范圍>^基124到1440。可讀框序列由SEQIDNO:9描述。SEQIDNO:9所述可讀框的^J^酸序列顯示為SEQIDNO:IO。實(shí)施例4:同源物的描述(核苷酸和氨基酸)如實(shí)施例3中所公開的，對應(yīng)于SEQIDNO:l的基因的推定全長轉(zhuǎn)錄物序列含有可讀框，所述可讀框具有如SEQIDNO:10中公開的氨基^列。SEQIDNO:10所述M^列的基因同源物的鑒定識別了額外的序列。鑒定了具有分別與SEQIDNO:IO和SEQIDNO:9同源的^J^酸和DNA序列的基因樣品，用SEQIDNO:16到29描述并展示于圖4中。經(jīng)鑒定的SEQIDNO:10的截短同源物的氨基酸比對展示于圖5中。圖6中顯示矩陣表格，其顯示經(jīng)鑒定的同源物和SEQIDNO:10對彼此的氨基酸百分比同一性。圖7中展示矩陣表格，其顯示經(jīng)鑒定的同源物和SEQIDNO:9對彼此的DNA序列百分比同一性。段89本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就會明白或能夠確定本文所述的本發(fā)明具體實(shí)施方案的許多等價物。這類等價物旨在被以下的權(quán)利要求包括。權(quán)利要求1.dsRNA分子，其包含a)包含下述序列的第一鏈，所述序列與50657480基因、50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分基本相同，和b)包含與第一鏈基本互補(bǔ)的序列的第二鏈。2.權(quán)利要求l的dsRNA分子，其中所述50657480基因、50657480-樣基因或50657480-同源物的部分是選自以下的序列a)包含下述序列的多核苷酸，所述序列如在SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核普酸1到1096或SEQIDNO:8中所示；b)包含下絲列的多核苷酸，所述序列與SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核普酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苦酸1到1096或SEQIDNO:8具有至少80%的序列同一性；c)在嚴(yán)格條件下與下述多核苷酸雜交的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苦酸1到1096或SEQIDNO:8中所示的序列；d)能夠通過下述引物獲得的多核苷酸，所述引物具有SEQIDNO:4、5、14或15中所示的序列；e)包含下述序列的多核苷酸，所狄列與編碼SEQIDNO:9、17、19、21、23、25、27或29中所示的核苷酸序列的多核苷酸具有至少50%的序列同一性；f)包含下述序列的多核苷酸，所述序列與編碼SEQIDNO:IO、16、18、20、22、24、26或28中所示的氨基酸序列的多核苷酸具有至少40%的序列同一性。3.權(quán)利要求1的dsRNA分子，其中耙基因的部分是從約19到500個核苷酸。4.包含多個RNA分子的dsRNA分子庫，所述每個RNA分子包含具有約19到24個核苷酸長度的雙鏈區(qū)，其中所述RNA分子衍生自與50657480基因、50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分基本相同的多核苷酸。5.權(quán)利要求4所述的dsRNA分子庫，其中所述RNA分子f汙生自選自以下的多核苷酸a)包含下述序列的多核苷酸，所述序列如在SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苷酸1到1096或SEQIDNO:8中所示；b)包含下述序列的多核苷酸，所述序列與SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苷酸1到1096或SEQIDNO:8具有至少80%的序列同一性；c)在嚴(yán)格條件下與下述多核苷酸雜交的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苷酸1到1096或SEQIDNO:8中所示的序列；d)能夠通過下述引物獲得的多核苷酸，所述引物具有SEQIDNO:4、5、14或15中所示的序列；e)包含下述序列的多核苷酸，所述序列與編碼SEQIDNO:9、17、19、21、23、25、27或29中所示的核苷酸序列的多核苷酸具有至少50%的序列同一性；f)包含下述序列的多核苷酸，所述序列與編碼SEQIDNO:IO、16、18、20、22、24、26或28中所示的氨基酸序列的多核苷酸具有至少40%的序列同一性。6.能夠表達(dá)下述dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物，所述dsRNA與50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分基本相同。7.權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述50657480基因、50657480-樣基因或50657480-同源物包含選自以下的序列a)包含下述序列的多核苷酸，所述序列如SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核香酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苷酸1到1096或SEQIDNO:8中所示；b)包含下狄列的多核苷酸，所述序列與SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苷酸1到1096或SEQIDNO:8具有至少80%的序列同一性；c)在嚴(yán)格條件下與下述多核苷酸雜交的多核苷酸，所述多核普酸包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苷酸1到1096或SEQIDNO:8中所示的序列；d)能夠通過下述引物獲得的多核苦酸，所述引物具有SEQIDNO:4、5、14或15中所示的序列；e)包含下絲列的多核苷酸，所述序列與編碼SEQIDNO:9、17、19、21、23、25、27或29中所示的核苷酸序列的多核苷酸具有至少50%的序列同一性；f)包含下述序列的多核苷酸，所述序列與編碼SEQIDNO:IO、16、18、20、22、24、26或28中所示的氨基酸序列的多核苷酸具有至少40%的序列同一性。8.能夠表達(dá)dsRNA分子庫的轉(zhuǎn)基因植物，其中RNA分子庫各包含具有約19-24個核苷酸長度的雙鏈區(qū)域，其中所述RNA分子衍生自與50657480基因、50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分基本相同的多核苷酸。9.權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述RNA分子衍生自選自以下的多核苷酸a)包含下述序列的多核苷酸，所述序列如在SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核普酸1到1096或SEQIDNO:8中所示；b)包含下述序列的多核苷酸，所狄列與SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苷酸1到1096或SEQIDNO:8具有至少80%的序列同一性；c)在嚴(yán)格條件下與下述多核苷酸雜交的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苷酸l到1096或SEQIDNO:8中所示的序列；d)能夠通過下述引物獲得的多核苷酸，所述引物具有SEQIDNO:4、5、14或15中所示的序列；e)包含下財列的多核苷酸，所述序列與編碼SEQIDNO:9、17、19、21、23、25、27或29中所示的核苷酸序列的多核苷酸具有至少50%的序列同一性；f)包含下述序列的多核苷酸，所述序列與編碼SEQIDNO:IO、16、18、20、22、24、26或28中所示的氨基酸序列的多核苷酸具有至少40%的序列同一性。10.能夠表達(dá)dsRNA分子庫的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，所述dsRNA分子與植物中50657480基因、50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分基本相同，所述方法包括步驟a)制備具有下述區(qū)域的核酸序列，所述區(qū)域與50657480基因、50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分基本相同，其中所述核酸在植物中被束達(dá)時能夠形成50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分的雙鏈轉(zhuǎn)錄物；b)用所述核酸轉(zhuǎn)化受體植物；c)生產(chǎn)所述受體植物的一個或多個轉(zhuǎn)基因子代；和d)針對所述轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)選擇子代。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述耙基因包含選自以下的序列a)包含下述序列的多核苷酸，所述序列如SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苦酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苷酸1到1096或SEQIDNO:8中所示；b)包含下述序列的多核苷酸，所述序列與SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苷酸1到1096或SEQIDNO:8具有至少80%的序列同一性；c)在嚴(yán)格條件下與下述多核苷酸雜交的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQIDNO:l、SEQIDNO:1的核苷酸7到483、SEQIDNO:7、SEQIDNO:7的核苷酸1到1096或SEQIDNO:8中所示的序列；d)能夠通過下述引物獲得的多核苷酸，所述引物具有SEQIDNO:4、5、14或15中所示的序列；e)包含下述序列的多核苷酸，所述序列與編碼SEQIDNO:9、17、19、21、23、25、27或29中所示的核苷酸序列的多核苷酸具有至少50%的序列同一性；f)包含下述序列的多核苷酸，所述序列與編碼SEQIDNO:IO、16、18、20、22、24、26或28中所示的^J^酸序列的多核苷酸具有至少40%的序列同一性。12.權(quán)利要求10的方法，其中所述50657480基因、50657480-樣基因或50657480-同源物的部分是從約19到約500個核苷酸。13.權(quán)利要求10的方法，其中所述植物選自大豆、馬鈴薯、番茄、花生、棉、木薯、咖啡、椰子、鳳梨、柑橘樹、香蕉、玉米、歐洲油菜(rape)、甜菜、向日葵、高粱、小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、四季豆(greenbean)、利馬豆、豌豆和煙草。14.權(quán)利要求10的方法，其中所述植物是大豆植物。15.對植物賦予線蟲抗性的方法，所述方法包括步驟a)制備具有下述區(qū)域的核酸序列，所述區(qū)域與50657480基因、50657480-才羊基因或50657480-同源物的一部分基xM目同，其中所述核酸在植物中被束達(dá)時能夠形成50657480-樣基因或50657480-同源物一部分的雙鏈轉(zhuǎn)錄物；b)用所述核酸轉(zhuǎn)化受體植物；c)生產(chǎn)所述受體植物的一個或多個轉(zhuǎn)基因子代；和d)針對線蟲抗性選擇子代。16.包含下述序列的表達(dá)載體，所述序列與50657480基因、50657480-樣基因或50657480-同源物的一部分基^目同。17.權(quán)利要求16中所述的表達(dá)載體，其包含與第一鏈基本互補(bǔ)的第二鏈，當(dāng)兩a均被轉(zhuǎn)錄時能夠形成dsRNA。18,權(quán)利要求16所述的表達(dá)載體，其包含根優(yōu)選的啟動子。全文摘要本發(fā)明涉及能夠抑制在植物中建立或維持線蟲侵襲必需的基因表達(dá)的雙鏈RNA組合物和轉(zhuǎn)基因植物，以及與之相關(guān)的方法。具體地，本發(fā)明涉及RNA干擾用于抑制靶植物基因表達(dá)的用途，所述靶植物基因?yàn)?0657480基因或其同源物，并涉及對寄生線蟲具有增加的抗性的植物的產(chǎn)生。文檔編號A01H5/00GK101605896SQ200880004339公開日2009年12月16日申請日期2008年2月4日優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日發(fā)明者A·威格申請人:巴斯福植物科學(xué)有限公司