專利名稱：一種采用西瓜子葉節(jié)直接再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。是一種以西瓜子葉節(jié)為外植體直接進行西瓜植株再生 的方法。
背景技術(shù)：
西瓜(Citrullus lanatus)是一種重要的蔬菜作物，其果實汁多味甜，富含番茄素 和維生素。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FA0)2002年統(tǒng)計，西瓜在世界10大果品中居第5位。在 春節(jié)早熟栽培時，西瓜容易遭受冷害、病害等各種不利因素的影響，導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)的降 低。隨著人民生活水平的提高，人們對西瓜種類和品質(zhì)的要求越來越高，希望一年四季不斷 有高品質(zhì)、不同品種的西瓜產(chǎn)品上市。通過離體培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化和體細胞無性系突變體篩選 獲得多抗、高品質(zhì)的西瓜品種已成為重要的育種手段之一。西瓜離體培養(yǎng)已經(jīng)有幾十年的 歷史，并且從莖尖培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)和體細胞胚胎發(fā)生等各種途徑對西瓜離體培養(yǎng)進行了 研究。國內(nèi)外研究人員以西瓜的莖尖、幼胚、子葉和胚軸等多種類型的外植體，采用不同 濃度的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的配比，建立了西瓜的器官發(fā)生再生系統(tǒng)。不同的外植體再生頻 率差異較大，其中以子葉的再生頻率較高，是進行西瓜植株再生培養(yǎng)最有效的途徑和方法。 目前，已有很多關(guān)于西瓜子葉再生植株的報道，但以西瓜子葉節(jié)為外植體直接誘導(dǎo)不定芽 進行西瓜植株再生的方法還未見報道。同時，在組織培養(yǎng)過程中，對種子消毒、器官發(fā)生過 程中各種培養(yǎng)基的應(yīng)用還比較混亂，對植株再生頻率也產(chǎn)生了很大的影響。無菌苗的獲得 離不開有效的種子消毒方法，常用的消毒劑有次氯酸鈉、過氧化氫和升汞等，在西瓜組織培 養(yǎng)中以應(yīng)用升汞和次氯酸鈉居多。在組織培養(yǎng)過程中，尤其重要的是培養(yǎng)基的選擇及其激 素的添加，這對外植體不定芽的誘導(dǎo)、伸長和生根都有重要的影響，是決定外植體器官發(fā)生 和植株再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，要建立簡便、高效的西瓜子葉節(jié)直接再生系統(tǒng)，必須在相應(yīng) 培養(yǎng)基中添加必要的生長激素，并確定合理添加濃度。為此，我們針對上述問題，提供一種利用西瓜子葉節(jié)直接再生植株的方法，使其建 立一個簡便、高效的繁殖體系，陣低成本，達到獲得優(yōu)良種苗的目的，也為西瓜轉(zhuǎn)基因研究 提供一種新技術(shù)手段。參考文獻1.京欣一號西瓜子葉組織培養(yǎng)的研究.王春霞，簡志英，劉愚，鄒琦.園藝學(xué) 報·1996，23 (4) :401-4032.西瓜組織培養(yǎng)的研究與應(yīng)用.任春梅，董延瑜.長江蔬菜，2001，(12) :30-32.3.西瓜高頻再生系統(tǒng)的研究.張志忠，吳著華，呂柳新.中國農(nóng)學(xué)通報，2004， 20(2) :151-153.4.西瓜子葉組織培養(yǎng)及植株再生的研究.常尚連，張立賓，于德花，徐化凌.湖北 農(nóng)業(yè)科學(xué)· 2009，48 (3) :533-535.

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供了一種西瓜子葉節(jié)直接再生植株的 方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，包括以下步驟(1)無菌苗的培育。挑選成熟飽滿的西瓜品種傲龍早蜜龍的種子，用H2O2浸泡7_8hr后，去除種 皮，在超凈工作臺上，先75 %的酒精消毒60s，用無菌水沖洗2-3次，再用15 % NaClO消 毒15min，無菌水沖洗4-5次，接到萌發(fā)培養(yǎng)基上，萌發(fā)培養(yǎng)基為0. 8%瓊脂。接種后，置于連續(xù)黑暗條件下，培養(yǎng)3d，再置于培養(yǎng)溫度為^±2°C，16hr、3000Lux光照條件下 培養(yǎng)2-3d。(2)子葉節(jié)的獲得。播種后5-6d，當(dāng)無菌苗子葉由黃轉(zhuǎn)呈淺綠色時，在生長點下3_4mm處切去下胚軸， 然后縱向切開胚軸，刮除頂芽、再切除2/3子葉，獲得西瓜子葉節(jié)。(3)不定芽的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ms5是按照每升MS基本培養(yǎng)基加入30g蔗糖、8g瓊脂、5. OmgAgNO3^ 1. 0mg6-BA和0. Img IBA配制而成，并用0. IM的KOH溶液將pH調(diào)整為5. 8。將子葉節(jié)(子葉的近軸面朝上)接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ms5上，在溫度為 沈士21，1^11~、3000^ 光照條件下培養(yǎng)，14(1后出現(xiàn)不定芽。不定芽出現(xiàn)后，再經(jīng)過20_25d 的培養(yǎng)，即可獲得0. 5-1. Ocm不定芽。每2周更換一次培養(yǎng)基。(4)不定芽的伸長伸長培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基加入30g蔗糖、8g瓊脂、0. 2mg KT配制而成， 并用0. IM的KOH溶液將pH調(diào)整為5. 8。將0. 5-lcm不定芽移入伸長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過25_30d培養(yǎng)后，不定芽可長 到3-km。每2周更換一次培養(yǎng)基。(5)生根培養(yǎng)。將34cm的不定芽移入生根培養(yǎng)基中。培養(yǎng)10-14d即可生根。生根培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基加入30g蔗糖、8g瓊脂和0. 5mg NAA配制而 成，并用0. IM的KOH溶液將pH調(diào)整為5. 8。(6)再生植株的馴化。當(dāng)再生植株根長至2cm左右時，揭去封口膜，使無菌苗適應(yīng)有菌的外界環(huán)境，2_3d 后向培養(yǎng)瓶中注入清水，用鑷子將生根苗取出，流動水沖洗凈根部培養(yǎng)基，移栽于滅菌的營 養(yǎng)土中，并用透明的塑料薄膜覆蓋保濕，放在培養(yǎng)室中。2周左右揭去薄膜并進行煉苗，4周 后即可與實生苗長勢相同。西瓜再生苗在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗站進行種植，結(jié)果表明西 瓜再生苗與實生苗長勢相同。本發(fā)明在研究過程中，具體考慮了以下幾種因素在本發(fā)明中所起的作用(1)種子處理對西瓜無菌苗的影響無菌萌發(fā)是植物組織培養(yǎng)中最基礎(chǔ)的一環(huán)，對發(fā)芽率和以后不定芽的分化有著直 接的影響。用I1^H2O2浸泡西瓜種子7-他，能明顯提高發(fā)芽率，而且無菌苗整齊度高，長勢 好，有利于再生出不定芽(見表1)。表1不同處理方式對西瓜種子萌發(fā)的影響
權(quán)利要求
1.一種采用西瓜子葉節(jié)為外植體直接進行西瓜植株再生的方法，其特征在于，包括以 下步驟(1)無菌苗的培育。挑選成熟飽滿的西瓜種子，用1 % H2O2浸泡7- 后，去除種皮，先75%的酒精消毒60s， 用無菌水沖洗2-3次，再用15% Natno消毒15min，無菌水沖洗4_5次，接到萌發(fā)培養(yǎng)基上， 萌發(fā)培養(yǎng)基為0. 8%瓊脂。接種后，置于連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)3d，再置于培養(yǎng)溫度 為洸士2°C，16hr、3000Lux光照條件下培養(yǎng)2_3d。(2)子葉節(jié)的獲得。播種后5-6d，當(dāng)無菌苗子葉由黃轉(zhuǎn)呈淺綠色時，在生長點下3-4mm處切去下胚軸，縱向 切開胚軸，刮除頂芽、然后切除2/3子葉，獲得西瓜子葉節(jié)。(3)不定芽的誘導(dǎo)。將子葉節(jié)接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ms5上，在溫度為^±2°C，l^ir、3000LuX光照條件 下培養(yǎng)14d后可出現(xiàn)不定芽。不定芽出現(xiàn)后，再經(jīng)過20-25d的培養(yǎng)，即可獲得0. 5-1. Ocm 不定芽。每2周更換一次培養(yǎng)基。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ms5是按照每升MS基本培養(yǎng)基加入30g蔗糖、8g瓊脂、5. OmgAgNO3^ 1. Omg 6-BA和0. Img IBA配制而成，并用0. IM的KOH溶液將pH調(diào)整為5. 8。(4)不定芽的伸長將0. 5-lcm不定芽移入伸長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過25-30d培養(yǎng)后，不定芽可長到 3-4cm0每2周更換一次培養(yǎng)基。所述的伸長培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基加入30g蔗糖、8g瓊脂、0. 2mg KT配制而 成，并用0. IM的KOH溶液將pH調(diào)整為5. 8。(5)生根培養(yǎng)。將34cm的不定芽移入生根培養(yǎng)基中。培養(yǎng)10-14d即可生根。所述的生根培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基加入30g蔗糖、8g瓊脂和0. 5mg NAA配制 而成，并用0. IM的KOH溶液將pH調(diào)整為5. 8。(6)再生植株的馴化。當(dāng)再生植株根長至2cm左右時，揭去封口膜，進行馴化，2的后，用鑷子將生根苗取出， 移栽于滅菌的營養(yǎng)土中，并用透明的塑料薄膜覆蓋保濕，放在培養(yǎng)室中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的西瓜子葉節(jié)直接再生植株的方法，其特征是所述無菌苗培育 的步驟為挑選成熟飽滿的西瓜種子，用1 % H2O2浸泡7-8hr后，去除種皮，先75%的酒精消毒60， 用無菌水沖洗2-3次，再用15% NaClO消毒15min，無菌水沖洗4 5次，接到萌發(fā)培養(yǎng)基 上，萌發(fā)培養(yǎng)基為0. 8%瓊脂。接種后，置于連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)3d，再置于培養(yǎng)溫 度為 ^±2°C，16hr、3000Lux 光照培養(yǎng) 2_3d。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的西瓜子葉節(jié)直接再生植株的方法，其特征是所述子葉節(jié)獲得 的步驟為播種后5-6d，當(dāng)無菌苗子葉由黃轉(zhuǎn)呈淺綠色時，在生長點下3-4mm處切去下胚軸，縱向 切開胚軸，刮除頂芽、然后切除2/3子葉，獲得西瓜子葉節(jié)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的西瓜子葉節(jié)直接再生植株的方法，其特征是所述不定芽誘導(dǎo)的步驟為將子葉節(jié)接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ms5上，在溫度為^±2°C，l^ir、3000LuX光照條件 下培養(yǎng)，14d后可出現(xiàn)不定芽。不定芽出現(xiàn)后，再經(jīng)過20-25d的培養(yǎng)，即可獲得0. 5-1. Ocm 不定芽。每2兩周更換一次培養(yǎng)基。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ms5是按照每升MS基本培養(yǎng)基加入30g蔗糖、妝瓊脂、5. Omg AgN03、 1. Omg 6-BA和0. Img IBA配制而成，并用0. IM的KOH溶液將pH調(diào)整為5. 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通過西瓜子葉節(jié)離體培養(yǎng)直接再生植株的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。包括以下步驟(1)采用西瓜品種傲龍早蜜龍的種子為材料培育無菌苗。(2)在生長點下3-4mm處切去下胚軸，縱向切開胚軸，刮除頂芽、然后切除2/3子葉，獲得西瓜子葉節(jié)。(3)將子葉節(jié)種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基Ms5上，經(jīng)過14d的培養(yǎng)，出現(xiàn)不定芽；繼續(xù)培養(yǎng)20-25d，即可獲得0.5-1.0cm不定芽。(4)將不定芽移入伸長培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)25～30d，不定芽可長到3-4cm。(5)將獲得的不定芽移入生根培養(yǎng)基，獲得再生植株。通過本發(fā)明的實施，可以直接獲得完整的西瓜再生植株，為西瓜的基因工程提供的培養(yǎng)技術(shù)。
文檔編號A01H4/00GK102047842SQ200910073169
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者劉宏宇, 周秀艷, 懷鳳濤, 秦智偉, 陳磊 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)