專利名稱：4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種縮氨基硫脲類化合物，尤其是涉及一種4-甲氧基肉桂醛縮氨基 硫脲的制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
縮氨基硫脲類化合物是由氨基硫脲與相應(yīng)的醛或酮縮合形成的希夫堿類化合 物，其具有廣泛的生物活性，在醫(yī)藥學(xué)與化學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。李錦州([l]李錦州，張光 林，沙靖全，等.呋喃甲?；吝蜻s氨基硫脲配合物的合成、光譜表征及生物活性 [J].光譜學(xué)與光譜分析，2005，25(2) :216-219)研究發(fā)現(xiàn)呋喃甲?；吝蜻s氨基硫 脲對金黃葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、白菜軟腐病菌和菜豆葷疫菌等均具有良好的抑 菌效應(yīng)；Richardson([2]RichardsonD R. Therapeutic potential of iron chelators in cancer therapy [J] Adv. Exp. Med. Biol. ， 2002， 509 :231-249)指出縮氨基硫脲類 化合物是極好的核苷二磷酸還原酶(RR)抑制劑，通過對RR的抑制，影響DNA的合成與 修復(fù)，從而具有抗腫瘤活性；Jiang Z G等([3] Jiang Z G， LebowitzM S， Ghanbari H A. Neuroprotective activity of 3_aminopyridine_2_carboxaldehydethiosemicarba zone(PAN-811)， a cancer therapeutic agent[J].CNS Drug Rev. ，2006，12 :77-90)的 研究表明3-氨基-2-吡啶醛縮氨基硫脲(3-AP， PAN-811)不僅具有抗腫瘤作用，而且 在腦缺血癥的治療中起神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)理為減少鈣離子與活性氧簇的積聚。同 時，作為金屬螯合劑，縮氨基硫脲可螯合不同的金屬形成金屬配合物，應(yīng)用于分析化學(xué)領(lǐng) 域([4]陸勤，王國雄，尹湛峰，等.^氧化吡啶-2-甲醛縮氨基硫脲鈷配合物的研究[J]. 無機(jī)化學(xué)學(xué)報，1991. 7(1) :65-68)。近期，Zhu Yu-jing[等([5]ZhuYJ， Song K K， Li Z C， et al. Antityrosinaseand antimicrobial activities of trans—ci皿咖aldehyde thiosemicarbazone[J]. J Agri. Food Chem. 2009， 57 :5518-5523)首先研究了肉桂醛縮 氨基硫脲對蘑菇酪氨酸酶的抑制機(jī)理以及其抗菌活性，解先業(yè)等([6]解先業(yè)，姜林，薛 超彬，等.取代苯甲醛縮氨基硫脲的合成及對昆蟲酚氧化酶的抑制活性[J].化學(xué)試劑， 2007.29(1) :34-36)設(shè)計(jì)合成了部分取代苯甲醛縮氨基硫脲，并研究了其對昆蟲酚氧化酶 的抑制活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，縮氨基硫脲類化合物對酚氧化酶有著良好的抑制活性。
酚氧化酶(phenoloxidase， EC. 1. 14. 18. l，簡稱PO)是存在于昆蟲體內(nèi)的一種含 銅的金屬酶，是生物體內(nèi)合成黑色素的關(guān)鍵酶，對昆蟲的生長、發(fā)育起著重要作用的關(guān)鍵酶 類。酚氧化酶催化L-酪氨酸羥化轉(zhuǎn)變?yōu)長-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌經(jīng)一系 列反應(yīng)后，形成保護(hù)性黑色素。同時，該酶也與昆蟲蛻皮過程中的鞣化作用有關(guān)，是昆蟲賴 于生存的——禾中重要的醇([7]Ashida M，Yamazaki H，Biochemistry of the phenoloxidase system in insect :withspecial reference to its activation. 0hnishi E， Ishizaki H. (eds) [M]Molting and Metamorphosis. 1990， Tokyo :Japan Science Society Press. 239-261)。張宗炳([8]張宗炳，冷欣夫.殺蟲藥劑毒力及應(yīng)用[M].北京化學(xué)出 版社，1993， 331-337)指出探索新殺蟲藥劑的一條最有希望的途徑是生物合理途徑，其中"原酪氨酸酶抑制劑"和"鞣化過程抑制劑"被列在第一、二位.已有研究([9]薛超彬， 王勤，羅萬春，等.銅鐵試劑對菜青蟲多酚氧化酶的抑制作用[J].昆蟲學(xué)報，2005， 48(1): 290-294)結(jié)果表明，酚氧化酶抑制劑可以通過抑制酶活力來阻礙昆蟲在蛻皮時的鞣化作 用，從而達(dá)到其殺蟲作用。以多酚氧化酶作為生物農(nóng)藥的靶點(diǎn)開發(fā)新型高效殺蟲劑，可以大 大減少生物農(nóng)藥的使用量，既能使農(nóng)藥的殘留減至最低，又能獲得很高的經(jīng)濟(jì)效益。因此， 研究設(shè)計(jì)高效的酚氧化酶抑制劑，不僅具有重要的理論意義，同時可以作為"環(huán)境友好"的 新型農(nóng)藥而具有重要的實(shí)踐意義和應(yīng)用前景([7]shida M， Yamazaki H， Biochemistry of the phenoloxidase system in insect :with special reference to its activation. 0hnishiE， Ishizaki H. (eds) [M]Molting and Metamorphosis. 1990，Tokyo :J即an Science SocietyPress. 239-261)。Heilbron， I. M. ， Hudson, H. E. ， Huish， Doris M et al. ([10]Heilbron， I. M. ;Hudson， H. E. ;Huish， Doris M. The reversed phototropy of ci皿amaldehyde semicarbazone and its methoxyderivatives[J]. J. Chem. Soc. ，Trans. ，123，2273-2279.) 于1923年首次合成了 4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲，并研究了其抗光色互變作用。 Bernstein, J. ， Yale， Harry L與Toldy， L ;Nogradi， T. ;Vargha， L等分另U于1951年 ([ll]Bernstein，J. ，Yale，Harry L. ，Losee，K. et al. The chemotherapyof experimental tuberculosis. III. The synthesis of thiosemicarbazones and related compo皿ds[J]. J. Amer.Chem.Soc. 73， 906-912.)與1954年([12]Toldy， L ， Nogradi， T. ， Vargha， Let al. Antituberculous agents. I. Thiosemicarbazones and hydrazides[J]. Acta. Chim. Hung. ，4. 302-313)報道了該化合物的抗結(jié)核效應(yīng)。然而對于該化合物作為新型殺蟲劑靶標(biāo) 蛋白——酚氧化酶的抑制劑的應(yīng)用尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種化合物——4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲及其制備方法。
本發(fā)明的另一目的是4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲在殺蟲劑靶標(biāo)蛋白酚氧化酶中 的應(yīng)用。 本發(fā)明所述4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的分子式為CUH13N30S，4_甲氧基肉桂醛
縮氨基硫脲的結(jié)構(gòu)式為
在常溫下，4_甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲易溶于匿SO，微溶于甲醇、乙醇等；紅外光 譜的結(jié)果顯示，1680cm—1附近C = 0的吸收峰消失，而在1602cm—1出現(xiàn)C = N的吸收峰；4-甲 氧基肉桂醛縮氨基硫脲的分子量為m/z 235. 1 (M+H+， CH30H);核磁共振氫譜的結(jié)果如下
力畫R(DMS0-d6， TMS， 400MHz) :S (ppm) 11. 35 (HN， s) ， 7. 90 (CH， s) ， 7. 48 6. 91(C6H4，4H， d) ，8. 21， 7. 62(NH2， s) ， 3. 76(CH30， s) ，6. 70， 6. 75 (CH = CH， d)。
本發(fā)明所述4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的制備方法包括以下步驟
1)稱取氨基硫脲溶于溶劑中，加入與氨基硫脲等量的4-甲氧基肉桂醛，磁力攪拌下，加入適量冰醋酸，加熱回流反應(yīng)后將反應(yīng)體系冷卻至室溫，靜置結(jié)晶，抽濾，獲得粗產(chǎn)物； 2)將粗產(chǎn)物重結(jié)晶，得到產(chǎn)物4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲。 所述加熱回流反應(yīng)的溫度最好為60 7(TC，加熱回流反應(yīng)的時間最好為3 5h。
本發(fā)明所述4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲可用在殺蟲劑靶標(biāo)蛋白酚氧化酶中。 在常溫下，所得產(chǎn)物4_甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲易溶于匿SO，微溶于甲醇、乙醇等。 反應(yīng)產(chǎn)物采用紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振譜對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定(紅外光譜如圖1所示，質(zhì)譜圖如圖2所示，核磁共振譜如圖3所示)。紅外光譜的結(jié)果顯示，1680cm—1附近C=0的吸收峰消失，而在1602cm—1出現(xiàn)C = N的吸收峰；ESI-MS的結(jié)果表明，該化合物的分子量為m/z 258. 0 (M+Na+， CH3OH);核磁共振氫譜的結(jié)果如下 力畫R(DMS0-d6， TMS，400MHz) :S (ppm) 11. 35 (HN， s) ， 7. 90 (CH， s) ， 7. 48 6. 91(C6H4，4H， d) ，8. 21， 7. 62(NH2， s) ， 3. 76(CH30， s) ，6. 70， 6. 75 (CH = CH， d)。 結(jié)合紅外光譜、質(zhì)譜與核磁共振氫譜數(shù)據(jù)，確定合成化合物為4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲。 與Bernstein等的方法相比，本發(fā)明所述4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的制備方法將氨基硫脲與4-甲氧基肉桂醛用相同的溶劑溶解，有利于反應(yīng)體系的均一化；另外，本發(fā)明在重結(jié)晶后產(chǎn)率較高，達(dá)77. 1% (Bernstein方法為70% )。 以菜青蟲酚氧化酶研究對象，測定了 4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲對酚氧化酶的抑制效應(yīng)、抑制機(jī)理與抑制類型和抑制參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲對酚氧化酶有強(qiáng)烈的抑制作用，其導(dǎo)致酚氧化酶活力喪失50%的濃度(半抑制率，IC5。)為1.62iimol/L，抑制機(jī)理以反應(yīng)初速度對酶量作圖，得到一組相交于原點(diǎn)的直線，說明4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲對酚氧化酶的抑制表現(xiàn)為可逆抑制；抑制類型的判定采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，得到一組相交于Y軸的直線，從而判定其抑制類型為競爭性抑制，二次作圖，求得抑制常數(shù)K工=0. 94ii mol/L。與已見報道的酚氧化酶抑制劑如4-羥基苯甲酸(IC5。 = 11. 3mmol/L)、銅鐵試劑(IC5。 = 0. 652mmol/L)和曲酸(IC5。 = 0. 468mmo1/L)等相比，其抑制效果分別提高了 69S00、400和290倍，該結(jié)果表明，4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲可作為以酚氧化酶為靶標(biāo)的新型殺蟲劑投入應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例所述4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的紅外光譜圖。在圖1中，
橫坐標(biāo)為紅外輻射的波數(shù)(cm—"，縱坐標(biāo)為透光率(％ );其主要波峰信息如下 波峰1波數(shù)3400. 97cm—1強(qiáng)度12. 09%為NH2伸縮振動吸收峰； 波峰2波數(shù)3264. 36cm—1強(qiáng)度12. 40%為NH伸縮振動吸收峰； 波峰3波數(shù)3165. 59cm—1強(qiáng)度12. 40%為苯環(huán)上C-H伸縮振動吸收峰； 波峰1波數(shù)1602. 11cm—1強(qiáng)度8. 32%為C = N伸縮振動吸收峰；波峰5，6波數(shù)1578. 90cm—、 1511. 93cm—1強(qiáng)度為11. 86 % ， 5. 40 %為C = C伸縮振
動吸收峰； 波峰7波數(shù)1258. 73cm—1強(qiáng)度10. 05%為C = S伸縮振動吸收峰；
波峰8波數(shù)1246. 79cm—1強(qiáng)度11. 31%為C_0伸縮振動吸收峰。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例所述4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的ESI-MS質(zhì)譜圖。在圖2中，橫坐標(biāo)為化合物分子的荷質(zhì)比(m/z)，縱坐標(biāo)為離子信號強(qiáng)度(X104);對應(yīng)碎片離子的荷質(zhì)比從左至右為102. 4， 145. 2， 186. 5， 236. 1，258. 0，291. 1，359. 2，其中258. 0對應(yīng)峰為分子離子碎片(M+Na+)。 圖3為本發(fā)明實(shí)施例所述4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的核磁共振氫譜。在圖3中，橫坐標(biāo)為化學(xué)位移值(卯m);化學(xué)位移從左至右分別為11.340,8. 136,7.893,7.869，7. 604， 7. 583， 7. 499， 7. 477， 6. 955， 6. 944， 6. 921 ，6. 916， 6. 754， 6. 731， 6. 714， 6. 691，3. 758ppm。 圖4為本發(fā)明實(shí)施例所述4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的核磁共振氫譜化學(xué)位移6. 5 8. 5部分的放大圖。在圖4中，橫坐標(biāo)為化學(xué)位移值(ppm);化學(xué)位移從左至右分別為8. 136， 7. 893， 7. 869， 7. 604， 7. 583， 7. 499， 7. 477， 6. 955， 6. 944， 6. 921， 6. 916， 6. 754，6. 731，6. 714，6. 691ppm。 圖5為本發(fā)明實(shí)施例所述4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲對酚氧化酶的抑制效應(yīng)。在圖5中，橫坐標(biāo)為[I] (4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的濃度，單位為Pmol/L)，縱坐標(biāo)為Relative Activity (相對酶活力，單位為％ )。 圖6為本發(fā)明實(shí)施例所述4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲對酚氧化酶的抑制機(jī)理的判定。在圖6中，橫坐標(biāo)為[E](反應(yīng)體系中的酶濃度，單位為mg/L)，縱坐標(biāo)為v(酶催化反應(yīng)速率，單位為iimol *L*min—0 ;線1， 2， 3， 4， 5對應(yīng)的4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲濃度分別為O，O. 4，0. 8， 1. 2和1.6iimol/L。 圖7為本發(fā)明實(shí)施例所述4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲對酚氧化酶的抑制類型與抑制參數(shù)的確定。在圖7中，橫坐標(biāo)為[S]—、反應(yīng)體系中底物L(fēng)-DOPA的濃度的倒數(shù)，單位為ii mo1—1 L)，縱坐標(biāo)為v—1 (酶催化反應(yīng)速率的倒數(shù)，單位為y mo1—1 L-1 min);線1， 2，3，4，5對應(yīng)的抑制劑濃度分別為O，O. 4，0. 8， 1. 2和1. 6ii mol/L。 圖8為二次作圖。在圖8中，橫坐標(biāo)為[1](4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲濃度，y mol/L)，縱坐標(biāo)為Slope (圖7中5條線的斜率)。
具體實(shí)施例方式
1. 4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的合成步驟 稱取氨基硫脲O. 455g(5mmol)，溶于10mL 95%乙醇溶液中，加入含有0. 81g 4-甲氧基肉桂醛的95%乙醇溶液，磁力攪拌下，加入2mL冰醋酸，加熱回流，薄層層析監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程，加熱回流3h后，將反應(yīng)體系冷卻至室溫，于4t:靜置結(jié)晶，抽濾，獲得粗產(chǎn)物。
采用50%乙醇重結(jié)晶，得到產(chǎn)物，烘箱干燥，稱重，計(jì)算產(chǎn)率為77. 1%。采用質(zhì)譜、紅外光譜和核磁共振譜鑒定所得產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的紅外光譜圖參見圖1，4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的ESI-MS質(zhì)譜圖參見圖2，4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的核磁共振氫譜參見圖3，4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的核磁共振氫譜化學(xué)位移6. 5 8.5部分的放大圖參見圖4。 2. 4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲對菜青蟲酚氧化酶的抑制作用 菜青蟲酚氧化酶的提取參考文獻(xiàn)[9]，本實(shí)驗(yàn)使用的酚氧化酶未經(jīng)純化。在2mL
6反應(yīng)體系中，在1. 8mL含有l(wèi)mmol/L底物L(fēng)-D0PA的0. lmmoL/L的磷酸緩沖液(PBS， pH =6. 8)中，加入200 ii L粗酶液，使用Beckman DU650分光光度計(jì)，37。C恒溫下測定475nm的光密度值隨時間的增長直線，從直線的斜率求得酶活力，消光系數(shù)按(e = 37001 cm—1)計(jì)算.DMS0終濃度都為3.33X，并在對照中排除其對酶的影響.酶活力單位(U)定義為在該條件下，每分鐘產(chǎn)生1 P mol/L產(chǎn)物的酶量。4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲對酚氧化酶的抑制效應(yīng)參見圖5。 3. 4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲對菜青蟲酚氧化酶的抑制機(jī)理的判斷 在上述酶活力測定體系中，固定底物L(fēng)-DOPA的濃度為lmmol/L，改變加入粗酶液
的體積，使用Beckman DU650分光光度計(jì)，37。C恒溫下測定不同濃度的4-甲氧基肉桂醛縮
氨基硫脲作用下酶的活力，消光系數(shù)按(e = 3700M—1 cm—"，計(jì)算酶催化反應(yīng)速率。4-甲
氧基肉桂醛縮氨基硫脲對酚氧化酶的抑制機(jī)理的判定參見圖6。以酶量對酶催化反應(yīng)速率
作圖，得到一組相交于原點(diǎn)的直線，說明4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲對酚氧化酶的抑制表
現(xiàn)為可逆抑制。 4. 4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲對菜青蟲酚氧化酶的抑制類型和抑制常數(shù)的測定
在上述酶活力測定體系中，固定酶量不變，改變加入底物L(fēng)-DOPA的濃度，使用BeckmanDU650分光光度計(jì)，37。C恒溫下測定不同濃度的4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲作用下酶的活力，消光系數(shù)按"二 3700"cm—"，計(jì)算酶催化反應(yīng)速率.以底物濃度的倒數(shù)對酶催化反應(yīng)速率的倒數(shù)作圖，得到一組相交于Y軸的直線，從而判定其抑制類型為競爭性抑制，4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲對酚氧化酶的抑制類型與抑制參數(shù)的確定參見圖7。以所得直線的斜率對4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的濃度二次作圖(參見圖8)，求得抑制常數(shù)K工=0. 94iimol/L。
權(quán)利要求
4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲，其特征在于其分子式為C11H13N3OS，4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的結(jié)構(gòu)式為在常溫下，4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲易溶于DMSO，微溶于甲醇、乙醇；紅外光譜的結(jié)果顯示，1680cm-1附近C＝O的吸收峰消失，而在1602cm-1出現(xiàn)C＝N的吸收峰；4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的分子量為m/z 235.1(M+H+，CH3OH)；核磁共振氫譜的結(jié)果如下1H NMR(DMSO-d6，TMS，400MHz)δ(ppm)11.35(HN，s)，7.90(CH，s)，7.48～6.91(C6H4，4H，d)，8.21，7.62(NH2，s)，3.76(CH3O，s)，6.70，6.75(CH＝CH，d)。
2. 如權(quán)利要求l所述的4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的制備方法，其特征在于包括以下 步驟1) 稱取氨基硫脲溶于溶劑中，加入與氨基硫脲等量的4-甲氧基肉桂醛，磁力攪拌下， 加入適量冰醋酸，加熱回流反應(yīng)后將反應(yīng)體系冷卻至室溫，靜置結(jié)晶，抽濾，獲得粗產(chǎn)物；2) 將粗產(chǎn)物重結(jié)晶，得到產(chǎn)物4_甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲。
3. 如權(quán)利要求2所述的4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的制備方法，其特征在于所述加熱 回流反應(yīng)的溫度為60 7(TC，加熱回流反應(yīng)的時間為3 5h。
4. 如權(quán)利要求l所述的4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲用在殺蟲劑靶標(biāo)蛋白酚氧化酶中。
全文摘要
4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的制備與應(yīng)用，涉及一種縮氨基硫脲類化合物。提供一種化合物——4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲及其制備方法以及4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲在殺蟲劑靶標(biāo)蛋白酚氧化酶中的應(yīng)用。4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲的分子式為C11H13N3OS。稱取氨基硫脲溶于溶劑中，加入與氨基硫脲等量的4-甲氧基肉桂醛，磁力攪拌下，加入適量冰醋酸，加熱回流反應(yīng)后將反應(yīng)體系冷卻至室溫，靜置結(jié)晶，抽濾，獲得粗產(chǎn)物；將粗產(chǎn)物重結(jié)晶，得到產(chǎn)物4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲。4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲可用在殺蟲劑靶標(biāo)蛋白酚氧化酶中。
文檔編號A01P7/04GK101696181SQ20091011269
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者朱育菁, 李智聰, 陳清西, 馬素娟 申請人:廈門大學(xué);