專利名稱：一組人成骨肉瘤細(xì)胞系及小鼠體內(nèi)移植模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物動物細(xì)胞系領(lǐng)域，更具體地講，涉及一組人成骨肉瘤細(xì)胞系和 小鼠體內(nèi)移植模型的建立。
背景技術(shù)：
成骨肉瘤是常見的骨惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，惡性程度高。目前常用治療方案為 手術(shù)治療+新輔助化療，根治效果并不十分理想，肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率高。基本原因在于對于骨肉 瘤發(fā)病機(jī)制的了解尚不清楚，基礎(chǔ)研究工作的開展也不深入。成骨腫瘤細(xì)胞系和動物成瘤 移植模型是在腫瘤發(fā)病機(jī)理和藥物及其它療法篩選研究工作中常用到的基本工具。雖然國 際上權(quán)威的細(xì)胞庫ATCC已存有數(shù)個成骨肉瘤細(xì)胞系(MG-63、&iOS-2和U_2os等)，但它們 在動物體內(nèi)致瘤率都極低；極大地影響了基礎(chǔ)研究工作的質(zhì)量。另外，少數(shù)個別實(shí)驗(yàn)室可能 已有自建的、有致瘤能力的成骨肉瘤細(xì)胞系，但均未見廣泛使用。因此，建立新型成骨肉瘤 細(xì)胞系及體內(nèi)穩(wěn)定移植模型是促進(jìn)臨床和基礎(chǔ)研究工作的一個基本前提條件。目前，國內(nèi)國外常用的成骨肉瘤細(xì)胞系有MG-63、&iOS-2和U-2os等。這些細(xì)胞系 長期在體外傳代，有些已經(jīng)喪失了原有分離之腫瘤組織的一些特征，尤其是它們在動物體 內(nèi)致瘤能力極低，不能建立體內(nèi)研究模型。少數(shù)實(shí)驗(yàn)室自建的、可有致瘤能力的成骨肉瘤細(xì) 胞系，長期傳代性狀不穩(wěn)定，沒有得到廣泛使用，從而造成了成骨肉瘤動物體內(nèi)成瘤模型建 立的限制，成骨肉瘤致病機(jī)理的基礎(chǔ)研究和藥物和其它療法篩選工作不能深入開展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供三個成骨肉瘤細(xì)胞系。本發(fā)明的第二個目的是提供所述相應(yīng)的人成骨肉瘤細(xì)胞系N0D/SCID小鼠體內(nèi)移 植模型。本發(fā)明公開的人成骨肉瘤細(xì)胞系(Well5、Well2和LZJ)來自中國人成骨肉瘤組織 標(biāo)本在N0D/SCID小鼠體內(nèi)接種及傳代組織衍生物，爾后又在體外穩(wěn)定傳代兩年以上，生物 性狀和表型與原代培養(yǎng)的成骨肉瘤細(xì)胞相似，在N0D/SCID小鼠上致瘤能力強(qiáng)。其在NOD/ SCID小鼠體內(nèi)移植模型致瘤穩(wěn)定，產(chǎn)生的移植瘤病理形態(tài)與成骨肉瘤病人原代標(biāo)本相似。 體內(nèi)模型很好的模擬了成骨肉瘤臨床發(fā)生和發(fā)展的過程。本發(fā)明改進(jìn)和優(yōu)化組織標(biāo)本的處理過程，盡量保證組織細(xì)胞活力。首先建立NOD/ SCID體內(nèi)移植模型，經(jīng)多次體內(nèi)傳代后再開始體外建系。進(jìn)行嚴(yán)格篩選工作，在建立約19 個原代培養(yǎng)物中篩選出3個穩(wěn)定體內(nèi)外傳代的細(xì)胞系。建立的成骨肉瘤細(xì)胞系(well5、 well2和LZJ)在體外穩(wěn)定傳代兩年以上，性狀穩(wěn)定，形態(tài)、免疫表型和染色體遺傳學(xué)等特征 與常用的成骨肉瘤細(xì)胞系相似。另外，建立的成骨肉瘤細(xì)胞系具有致瘤能力強(qiáng)，生長活力好 等特點(diǎn)。N0D/SCID小鼠成瘤穩(wěn)定，瘤體病理形態(tài)與病人原代腫瘤組織相似，同時(shí)該動物模型 對成骨肉瘤常用化療藥物敏感，很好的模擬了臨床病人骨肉瘤的臨床轉(zhuǎn)軌。


下面結(jié)合說明書附圖，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖IA 成骨肉瘤病人手術(shù)前瘤體大致外觀圖；圖IB 成骨肉瘤病人診斷CT圖像。圖2A:將病人標(biāo)本消化成單細(xì)胞懸液后注射入N0D/SCID小鼠皮下，成功建立跨物 種移植模型，所示瘤體體積較大，長約30mm ；圖2B 頸椎脫白法處死小鼠后，解剖取出瘤塊， 將其剪成小碎塊后，消化成單細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。圖3 長期體外穩(wěn)定培養(yǎng)的細(xì)胞系Well2、We115、LZJ的光鏡相差圖像GX、20X)， 細(xì)胞形態(tài)大而粗壯、梭形，與常用成骨肉瘤細(xì)胞系相似。圖4A 建立的well5成骨肉瘤細(xì)胞系染色體數(shù)量異常，畸變明顯；圖4B 建立的 LZJ成骨肉瘤細(xì)胞系染色體數(shù)量異常，畸變明顯。圖5 在無血清培養(yǎng)的條件下，well2, well5, LZJ分別具有能在體外 sphere-forming 白勺能力。圖6 所示病人原代標(biāo)本LZJ PO和N0D/SCID小鼠跨物種移植模型LZJ Pl的病理 形態(tài)相似，此模型很好得反映了成骨肉瘤在病人體內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所公開的人成骨肉瘤細(xì)胞系，已保藏在武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，地址武漢大學(xué)，保藏日期為2009年10月四日，其命名和保藏編號分別為 (1)命名為人成骨肉瘤細(xì)胞系well2 ；保藏編號CCTCC-C200961 ;(2)命名為人成骨肉 瘤細(xì)胞系well5 ；保藏編號CCTCC-C200962 ； (3)命名人成骨肉瘤細(xì)胞系LZJ ；保藏編號 CCTCC-C200963。I、主要收集瑞金醫(yī)院07-08年間初發(fā)成骨肉瘤病人的原代標(biāo)本，去除壞死組織和 血塊，剪碎肉瘤組織，用膠原酶消化成單細(xì)胞懸液，一部分用培養(yǎng)液重懸后加入至細(xì)胞培養(yǎng) 皿進(jìn)行體外培養(yǎng)，另一部分直接皮下植入N0D/SCID小鼠，待腫瘤形成。II、觀察N0D/SCID小鼠成瘤情況，對移植后產(chǎn)生的瘤體進(jìn)行病理和免疫表型等分 析。將腫瘤移植物制備單細(xì)胞懸液，在體外不斷長期穩(wěn)定傳代，去除死細(xì)胞和雜細(xì)胞。III、建立的人成骨肉瘤細(xì)胞系(well2 :CCTCC_C200961 ；well5 :CCTCC_C200962 ； LZJ :CCTCC-C200963)在體外穩(wěn)定傳代兩年以上，細(xì)胞形態(tài)大而粗壯、梭形，與常用成骨肉 瘤細(xì)胞系相似，并且能在體外無血清培養(yǎng)體系下形成成骨肉瘤細(xì)胞球。
權(quán)利要求
1.一種人成骨肉瘤細(xì)胞系，其保藏編號為CCTCC-C200961。
2.權(quán)利要求1所述的人成骨細(xì)胞系N0D/SCID小鼠體內(nèi)移植模型。
3.一種人成骨肉瘤細(xì)胞系，其保藏編號為CCTCC-C200962。
4.權(quán)利要求3所述的人成骨細(xì)胞系N0D/SCID小鼠體內(nèi)移植模型。
5.一種人成骨肉瘤細(xì)胞系，其保藏編號為CCTCC-C200963。
6.權(quán)利要求5所述的人成骨細(xì)胞系N0D/SCID小鼠體內(nèi)移植模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了三個人成骨肉瘤細(xì)胞系well2、well5和LZJ，保藏編號分別為CCTCC C200961；CCTCC C200962；CCTCC C200963，本發(fā)明還公開了相應(yīng)的NOD/SCID小鼠體內(nèi)移植模型的建立，為骨肉瘤臨床和基礎(chǔ)研究工作提供良好和穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)對象及模型平臺。建立的成骨肉瘤細(xì)胞系在體外穩(wěn)定傳代兩年以上，性狀穩(wěn)定，形態(tài)、免疫表型和染色體遺傳學(xué)等特征與常用的成骨肉瘤細(xì)胞系相似。NOD/SCID小鼠成瘤穩(wěn)定，瘤體病理形態(tài)與病人原代腫瘤組織相似，同時(shí)該動物模型對成骨肉瘤常用化療藥物敏感，很好的模擬了臨床病人骨肉瘤的臨床轉(zhuǎn)軌。
文檔編號A01K67/027GK102051344SQ200910197960
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者張偉賓, 張武, 諸江 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院