專利名稱：一種原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所涉及一種動物肝癌模型的制備方法，尤其是涉及一種建立在普通小鼠具有正常免疫功能的生理條件下，經(jīng)異種原位移植構(gòu)建人類肝癌動物模型的方法。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝細胞癌(Primary Hepatocellular Carcinoma，PHC)是世界上惡性程度和死亡率最高的惡性腫瘤之一；建立理想的人類肝癌動物模型是研究肝癌、篩選抗腫瘤藥物及進行肝癌實驗性治療的重要基礎。在既往的研究中，曾有多種動物肝癌荷瘤模型被發(fā)明，但是由于人與動物之間的差異以及人類肝癌形成過程中的諸多因素，建立一個完全反映在動物肝臟內(nèi)具有人類肝癌生物特性的動物模型是一件極具挑戰(zhàn)的課題。
移植性肝癌模型，是指將肝癌組織塊或肝癌細胞株接種于實驗動物(常用鼠)而建立的模型，主要包括同種(鼠與鼠之間)移植和異種(人和裸鼠之間)移植兩種。瘤源可以是自發(fā)的、誘發(fā)的、切除的人肝癌標本或肝癌細胞株。根據(jù)受體動物不同，移植性肝癌模型可分為正常動物移植性肝癌模型和免疫缺陷動物移植性肝癌模型；前者受體動物多為小鼠和大鼠，后者受體動物多為裸鼠、裸大鼠；可將腫瘤移植于動物的不同組織，如肝臟內(nèi)，也可植入皮下、腹腔等部位。
1、移植性鼠-鼠肝癌模型正常動物移植性肝癌模型多為自發(fā)性肝外——肝同種移植性鼠肝癌模型，該模型多采用來源于大鼠肝癌的Walker2256細胞株，通過不同途徑移植入大鼠的肝臟，從而形成大鼠移植性肝癌模型。實驗動物一般選用雄性Wistar大鼠，也有用SD雄性大鼠。而移植性小鼠肝癌模型遠少于移植性大鼠肝癌模型，1982年遵義醫(yī)學院用615近交系小鼠建立了我國第1株小鼠移植性肝癌模型H615，H615肝癌為615系小鼠同基因型瘤株，也只能在615小鼠體內(nèi)移植。
此類模型性質(zhì)穩(wěn)定、制作方法簡單，成功率高(＞95％)、周期短(7～10d)，自然生存時間為3～4周，腫瘤生物學特性穩(wěn)定而均一，均為肝細胞癌及高濃度甲胎蛋白AFP的分泌；目前廣泛地應用于肝癌影像學診斷實驗及肝癌局部治療。但是由于此種模型一般只能用于同種動物間(鼠)的腫瘤移植，與裸鼠人肝癌移植模型相比，有一定的局限性。
2、移植性裸鼠—人肝癌模型將人肝癌細胞株或肝癌組織塊，直接移植到無免疫功能的裸鼠體內(nèi)建立移植性肝癌模型，屬于人—鼠異種移植。目前主要有三種人—裸小鼠異種移植肝癌模型、人—裸大鼠異種移植肝癌模型以及人肝癌裸鼠皮下—肝原位移值瘤模型。
自1976年Shimosato首次報道人肝癌組織在裸小鼠移植成功以來，我國于1979年引入裸小鼠，已建立5株裸小鼠人肝癌組織模型LTNM 1～5和1株裸小鼠人肝癌細胞株模型LCNM1。這些模型均保留原發(fā)人肝癌形態(tài)及功能(分泌人甲胎蛋白)的特征。1982年由湯釗猷院士等建立我國首例人體肝癌裸小鼠移植模型，使得在動物身上研究人類肝癌成為可能，自此裸鼠人肝癌移植模型在我國得到了長足的發(fā)展。
此類模型有較高的異種移植成功率，潛伏期短，但大部分轉(zhuǎn)移率低。同時，由于裸鼠缺乏以T細胞為主的免疫系統(tǒng)，飼養(yǎng)及實驗要求條件高、壽命短，對實驗處理因素耐受性低，尤其是移植如肝癌這樣的細胞，在動物體內(nèi)生長迅速，短時間內(nèi)即產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)及致死性血性腹水，使裸鼠帶瘤生存時間短暫而影響實驗研究，不適于藥物靶向性治療中所進行的動態(tài)性觀察，因而限制了對此肝癌模型的廣泛應用。
從以上的研究可以看出，現(xiàn)存的人肝癌鼠模型主要是利用裸小鼠、裸大鼠無胸腺、缺乏T淋巴細胞這樣的免疫缺陷動物，進行的跨物種的人肝癌的移植及模型的構(gòu)建，雖然保證了移植的成功率，但是不能真實的模擬肝癌發(fā)生及發(fā)展過程中機體對腫瘤的細胞免疫應答狀況，致使人體抗肝腫瘤免疫應答的研究一直停頓于體外實驗，從很大程度上限制了腫瘤生物學及抗腫瘤免疫藥物治療效果的研究和評估。因此，建立在具有正常免疫功能的鼠-人肝癌移植性模型已成為當代生物醫(yī)藥學及腫瘤免疫研究中的迫切需要。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的狀況，本發(fā)明的目的是提供一種原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法。
本發(fā)明利用乳鼠肝內(nèi)高表達的甲胎蛋白(alpha-fetaprotein，AFP)可抑制機體抗腫瘤免疫的生物學活性及原位移植的原理，首次利用具有正常免疫功能的昆明種乳鼠，建立了人肝癌小鼠原位移植性模型。
本發(fā)明涉及的一種原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法，步驟是[1]人肝癌細胞株培養(yǎng)選人肝癌細胞株常規(guī)傳代培養(yǎng)，備用；[2]熒光染料DiI標記的細胞懸液的制備選取上述對數(shù)生長期的人肝癌細胞株之一，與20μg/ml活體熒光染料DiI在37℃～38℃下共孵30min～60min，之后，0.25％無菌胰蛋白酶消化，以基本培養(yǎng)液收集細胞并調(diào)整細胞懸液濃度至0.5×106個/ml～1.0×109個/ml；[3]原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型選用昆明種三日齡乳鼠，腹部皮膚消毒后，利用無菌30-gauge 50-μl玻璃微量進樣器，將10μl～50μl上述DiI標記的人肝癌細胞懸液，直接移植入鼠肝葉內(nèi)，建立人肝癌小鼠原位移植性模型；[4]模型鑒定。
上述原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法中，步驟[1]所述人肝癌細胞株優(yōu)選HepG-2(甲胎蛋白陽性，購于中國科學院上海細胞生物學研究所)、Bel-7402(甲胎蛋白陽性，購于山東省醫(yī)學科學院)、SK-Hep-1(甲胎蛋白陰性，購于中國科學院上海細胞生物學研究所)之一，細胞株液氮保存，實驗室常規(guī)傳代培養(yǎng)。
所述人肝癌細胞株培養(yǎng)方法是胎牛血清濃度為10％的細胞培養(yǎng)液，37℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)，其中人肝癌細胞株HepG-2、SK-Hep-1選用DMEM-H基本培養(yǎng)液；Bel-7402選用RPMI1640基本培養(yǎng)液。
上述原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法中，步驟[2]所述活體熒光染料DiI標記人肝癌細胞的方法是活體熒光染料DiI使用前用無水乙醇溶解至2.0mg/ml，0.22μm的一次性過濾器過濾除菌后，室溫密閉避光保存，備用；10％血清細胞培養(yǎng)液將上述熒光染料DiI稀釋至20μg/ml的終濃度，與對數(shù)生長期的貼壁人肝癌細胞于37℃孵箱內(nèi)共孵50min～60min，每隔10min將熒光染液搖勻一次，肝癌細胞即被熒光染料DiI完全標記。
熒光染料DiI(1，1’’-Dioctadecyl-3，3，3’’，3’’-tetramethylindocarbocyanineperchlorate)是一種親脂性碳花青熒光染料，易嵌入生物質(zhì)膜內(nèi)并在膜內(nèi)作側(cè)向擴散運動，或者通過胞飲作用進入胞質(zhì)，從而標記整個細胞。DiI使用簡便，對活體細胞無毒性，而且不從已標記的細胞轉(zhuǎn)移到未標記的細胞，且熒光衰減慢，因此，DiI是一種可靠的熒光染料。1986年Honig等首先將DiI引入神經(jīng)系統(tǒng)的研究，成功地顯示了體外培養(yǎng)神經(jīng)元的胞體和突起。此后，DiI被廣泛應用于神經(jīng)通路的發(fā)育研究。Soriano等首先發(fā)現(xiàn)DiI亦可標記肝細胞，從肝實質(zhì)中辨別出被移植的肝細胞。國內(nèi)較少使用熒光染料DiI標記肝癌細胞進行示蹤研究。
上述原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法中，步驟[2]所述熒光染料DiI標記的細胞懸液的制備方法是收集胰蛋白酶消化后的熒光染料DiI標記的細胞，1000r/min離心3min，重復3次，每次均用37℃預溫基本培養(yǎng)液重懸；經(jīng)計數(shù)，存活率超過80％后，以基本培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1.0×108個/ml；于熒光顯微鏡激發(fā)光549nm下觀察，確定細胞被成功標記后，待用。
上述原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法中，步驟[3]所述直接移植人肝癌細胞懸液入鼠肝葉內(nèi)的方法是用食指與中指夾住乳鼠頸部，以固定住乳鼠的頭部，無名指與小指固定住小鼠尾部，此時小鼠腹部會完全曝露，可見位于小鼠胸廓下方的呈暗紅色的肝臟區(qū)域；無菌30-gauge 50-μl玻璃微量進樣器吸取步驟[2]熒光標記的人肝癌細胞懸液30μl，以30度的入針角度刺入小鼠肝葉內(nèi)，入針深度2mm～2.5mm，將人肝癌細胞由小鼠體外直接移植入小鼠肝葉內(nèi)，注射時間為2min/只～3min/只，出針后用酒精棉球迅速輕按注射部位1min～2min，之后，歸還母鼠，以常規(guī)方式飼養(yǎng)。
上述原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法中，步驟[4]所述模型鑒定采用如下鑒定手段(1)人肝癌細胞在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況-----熒光染料DiI標記技術(shù)結(jié)合活體成像系統(tǒng)；(2)人肝癌細胞的在荷瘤小鼠肝內(nèi)的定性，定位示蹤-----活體熒光染料DiI標記人肝癌細胞，荷瘤小鼠肝組織冰凍切片，熒光顯微鏡觀察；此法可直接區(qū)分移植的肝癌細胞與受體肝細胞，直觀的示蹤了移植肝癌細胞在小鼠肝內(nèi)的分布與存活狀況；(3)荷瘤小鼠肝臟病理學變化-----石蠟切片HE染色觀察；此法是目前臨床診斷肝癌的最佳指標，可直觀地反映肝臟病變狀態(tài)。；(4)荷瘤小鼠血清甲胎蛋白(AFP)表達變化的鑒定----定量ELISA檢測；血清AFP陽性被確定為診斷和發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌(HCC)的黃金指標。
本發(fā)明的有益效果針對現(xiàn)有小鼠肝癌模型存在的問題，經(jīng)過長時間的調(diào)研與實驗摸索，申請人了解到，普通昆明種小鼠與人類在遺傳學、病理學、生物學許多特性方面相似，而且適應力很強，價格便宜且具有較高的繁殖率及存活率，己被廣泛應用藥理學、毒理學等領(lǐng)域的研究，以及藥品、生物制品的生產(chǎn)與檢定。Martin Olsson等在1977年對27個不同種系小鼠的肝臟甲胎蛋白的表達特點進行的研究結(jié)果顯示，小鼠在出生后的一定時期內(nèi)肝臟仍有較高水平的AFP表達；研究表明AFP是維持肝癌惡性生長，逃避免疫系統(tǒng)攻擊的分子基礎之一，是小鼠胚胎時期及肝癌發(fā)生過程中高表達的標志性蛋白。因此推測，初生乳鼠的肝臟內(nèi)較高水平的AFP表達可能有利于小鼠肝臟移植的人肝癌細胞的存活，根據(jù)原位移植原理，構(gòu)建了人肝細胞癌小鼠原位移植性模型，它具有以下優(yōu)點(1)制作過程簡單易行，成功率高，動物價格便宜，容易獲得，能廣泛推廣應用；(2)本實驗選用3日齡的昆明種乳鼠作為荷瘤的受體，此時小鼠皮膚透明，肝重/體重比較大，在不用實施外科手術(shù)的前提下，提高了荷瘤注射的準確率，減少了以往因為麻醉及手術(shù)對小鼠機體的損傷，保證了實驗動物在荷瘤期間健康的生理狀態(tài)；(3)活體成像系統(tǒng)結(jié)合活體熒光染料DiI標記技術(shù)示蹤了移植入小鼠體內(nèi)的人肝癌細胞，對本發(fā)明的異種原位移植進行定位，定性研究，直觀，簡便，容易操作，國內(nèi)相關(guān)研究極少；(4)肝癌細胞在小鼠中的移植率與裸鼠接近，且生長期短，承受癌性腹水容量大，耐受力強，帶瘤生存時間較裸鼠延長1倍以上，同時，隨著小鼠的免疫系統(tǒng)的發(fā)育，不僅可以對肝癌細胞的生長進行實時觀測，而且也可研究肝癌細胞與小鼠免疫系統(tǒng)的相互作用，能夠非常真實地模擬人類體內(nèi)免疫耐受及抗腫瘤免疫的全過程；(5)以一種實施簡單，成功率高的方法，在正常的機體免疫環(huán)境下，構(gòu)建跨物種的小鼠原位移植性人肝癌模型，為免疫生物藥物的篩選及藥理的研究提供更為理想的操作平臺，至今尚無相關(guān)報道，具有理論和實踐上的創(chuàng)新性。


圖1.小鼠荷瘤第7天，肝臟外觀圖，荷瘤小鼠腹腔解剖觀察，肝葉上出現(xiàn)明顯的灰色腫瘤結(jié)節(jié)一處(約3cm×2cm)；圖2.人肝癌細胞在荷瘤小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況，活體成像系統(tǒng)結(jié)合熒光染料DiI標記技術(shù)，示蹤小鼠活體內(nèi)的人肝癌細胞在的轉(zhuǎn)移情況；圖3.荷瘤后，活體熒光染料DiI示蹤人肝癌細胞在小鼠肝內(nèi)的占位情況(×40)，A\B荷瘤60h冰凍切片顯示肝癌細胞在肝內(nèi)的占位情況，C\D荷瘤5d，冰凍切片顯示肝癌細胞在肝內(nèi)的占位情況，E\F荷瘤14d冰凍切片顯示肝癌細胞在肝內(nèi)的占位情況；圖4.荷瘤小鼠肝組織病理學檢查，A.荷瘤5天腫瘤組織石蠟切片，H-E染色結(jié)果(×40)，B.荷瘤14天腫瘤組織石蠟切片，H-E染色結(jié)果(×40)，1.1腫瘤中心位置的細胞核消失(×400)，1.2細胞形態(tài)呈條索狀(×400)，1.3腫瘤邊緣明顯的多倍細胞核(×400)；圖5.ELISA檢測荷瘤小鼠血清甲胎蛋白變化，檢測結(jié)果顯示，荷瘤3日小鼠血清甲胎蛋白水平明顯升高。
具體實施例方式
下面通過實施例證，對本發(fā)明進行進一步地詳細說明，應該理解的是，所述的實施例僅僅是用于說明而不是限制本發(fā)明。
實施例1DiI熒光染料標記人肝癌細胞HepG-2懸液的制備1、試驗器材熒光顯微鏡(NIKON ECLIPSE TE2000-U)；細胞培養(yǎng)箱(SANYO，2300TC)；0.22μm針頭式過濾器(美國MILLIPORE)；2、試驗試劑DMEM-H液體基本培養(yǎng)液(HyClone)；優(yōu)級胎牛血清(HyClone)；熒光染料DiI(AnaSpec，Inc.)；0.25％胰蛋白酶(SINGAMA)等。
3、試驗方法AFP陽性人肝癌細胞株HepG-2，購于中國科學院上海細胞生物學研究所，液氮保存，DMEM-H基本培養(yǎng)液，10％胎牛血清，37℃5％CO2恒溫培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)；0.25％無菌胰蛋白酶消化傳代。
無水乙醇溶解熒光染料DiI至2.0mg/ml；0.22μm的一次性過濾器過濾除菌后，室溫密閉避光保存；使用前用10％胎牛血清DMEM基本培養(yǎng)液稀釋熒光染料至20μg/ml的終濃度，與貼壁的人肝癌細胞37℃孵箱內(nèi)共孵45min，每隔10min混勻一次。0.25％無菌胰蛋白酶消化，收集標記后的人肝癌細胞，1000r/min×3min離心3次，每次均用37℃預溫基本培養(yǎng)液重懸；經(jīng)臺盼藍染色計數(shù)，存活率超過80％后，基本培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1.0×108個/ml；于熒光顯微鏡激發(fā)光549nm觀察下，確定細胞被成功標記后，待用。
實施例2原位移植性人肝癌細胞HepG-2小鼠模型的構(gòu)建1、試驗材料30-gauge 50-μl玻璃微量進樣器(上海高欣玻璃儀器廠)；DiI熒光染料標記的人肝癌細胞HepG-2懸液，冰凍切片機(MICROM HM 550)；AO 820切片機(American OpticalCorporration)；石蠟(sangon)等；2、試驗動物昆明種孕鼠，購于山東大學實驗動物中心，于SPF清潔級實驗動物房內(nèi)適應飼養(yǎng)，并待其生產(chǎn)，取出生后3日齡乳鼠為荷瘤受體，雌雄均有，平均體重為1.9g。
3、試驗方法1)取3日齡昆明種乳鼠，腹部皮膚用酒精消毒。
2)用食指與中指夾住小鼠頸部，以固定住乳鼠的頭部，用力要輕，以防小鼠窒息，無名指與小指固定住小鼠尾部，使小鼠身體輕微后彎，此時小鼠腹部會完全曝露，可見位于小鼠胸廓下方的大部分呈暗紅色的肝臟區(qū)域。
3)取無菌30-gauge 50-μl玻璃微量進樣器吸取熒光標記的HepG-2細胞懸液30μ1，以30度的入針角度刺入小鼠肝葉內(nèi)，入針深度2mm，此時小鼠肝臟稚嫩，容易扎穿，而導致細胞懸液的損失。
4)將人肝癌細胞懸液緩慢的注射入小鼠肝葉內(nèi)，注射時間為2min/只，出針后用無菌酒精棉球迅速輕按注射部位1min，以防止細胞懸液的滲出，如果注射位置準確的定位于肝葉，乳鼠不會劇烈掙扎，基本上無血液滲出。
5)整個操作過程，須確保操作人員不要直接用手觸碰乳鼠皮膚，以確保母鼠對荷瘤后幼鼠的識別。
6)歸還母鼠哺育，保證飼養(yǎng)環(huán)境的清潔，隨時觀察荷瘤乳鼠的生存狀態(tài)。
7)荷瘤60h后，每隔48h，活體成像檢測一次；尾靜脈取血，4℃靜置，隔日分離血清，-80℃保存待用；取荷瘤小鼠以10g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉，解剖觀察；取癌灶及癌周組織做冰凍切片，于熒光顯微鏡激發(fā)光549nm下觀察；部分組織用40g/L中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下常規(guī)病理組織學觀察。
4、試驗結(jié)果1)荷瘤期間，腫瘤的生長對荷瘤小鼠的生存狀態(tài)無顯著影響，無自然死亡現(xiàn)象。
2)解剖觀察，可見小鼠肝葉有1～2個明顯的形似赤豆的結(jié)節(jié)(見圖1)，與周邊組織界面清晰，呈灰白色；腫瘤周圍組織正常，成瘤率近100％。
3)活體成像顯示人肝癌細胞在小鼠肝內(nèi)位置，無自發(fā)轉(zhuǎn)移及消退現(xiàn)象發(fā)生(見圖2)。
4)DiI染色的陽性細胞在激發(fā)光549nm下顯示紅色熒光，細胞均勻著色，不能區(qū)分胞核與胞質(zhì)，冰凍切片結(jié)果顯示，腫瘤細胞在肝內(nèi)的占位比較穩(wěn)定，熒光強度未見明顯減弱(見圖3)。
5)H-E病理切片檢查顯示，腫瘤組織有完整薄膜包被，與正常肝組織之間界限分明，細胞形態(tài)不規(guī)則，呈長條狀，有腫瘤結(jié)節(jié)，于荷瘤后第7d開始，腫瘤中間出現(xiàn)干酪樣壞死，隨著小鼠的生長，壞死區(qū)域無明顯增大，其生長行為與肝癌相似，適于人肝癌相關(guān)的醫(yī)學及生物學實驗性研究(見圖4)。
6)荷瘤3d后，小鼠血清的甲胎蛋白水平出現(xiàn)明顯升高(見圖5)，符合人肝癌發(fā)生過程中的常規(guī)病理檢查指標及特點(檢測詳見實施例3)。
試驗證實本發(fā)明所述方法可以成功的構(gòu)建人肝癌小鼠原位移植性模型。
該模型建立在正常的免疫系統(tǒng)之上，利用動物體內(nèi)AFP的免疫抑制作用，基本避免了免疫排斥的發(fā)生，理想地重現(xiàn)了肝癌細胞在肝內(nèi)的生物學特性。
實施例3ELISA檢測荷瘤小鼠血清甲胎蛋白濃度變化1.試驗材料荷瘤小鼠血清；甲胎蛋白酶免試劑盒(BioCheck，Inc)；甲胎蛋白抗體(LABVISON)2.試驗方法(1)配制工作用洗滌液濃縮洗滌液20ml/瓶，用蒸餾水1∶20稀釋后使用；(2)加樣設空白對照1孔，陰、陽性對照各2孔，分別加陰、陽性對照各50μl和50μl待測樣本于相應孔內(nèi)；(3)加酶除空白對照孔外，每孔加1滴(50μl)酶標記物，輕輕振蕩，用透明膠條將板孔封好；(4)溫育37℃水浴30min；(5)洗滌扣去孔內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置20s，除去洗滌液，重復4次后在吸水紙上拍干；(6)顯色每孔加入底物液A、B各1滴，輕輕振蕩封板后，置37℃水浴15分鐘；(7)結(jié)果判定每孔加終止液1滴，用酶標儀檢測(波長450nm)各孔OD值(空白孔調(diào)零)。
3.試驗結(jié)果檢測到荷瘤后第3d小鼠血清甲胎蛋白表達水平明顯升高(見圖6)。
實施例4原位移植性人肝癌細胞SK-Hep-1小鼠模型的構(gòu)建1、試驗材料30-gauge 50-μl玻璃微量進樣器(上海高欣玻璃儀器廠)； DiI熒光染料標記SK-Hep-1肝癌細胞懸液(0.5×106個/ml)2、試驗動物昆明種孕鼠，購于山東大學實驗動物中心，于SPF清潔級實驗動物房內(nèi)適應飼養(yǎng)，待其生產(chǎn)。
3、試驗方法1)取3日齡的昆明種乳鼠，腹部皮膚用酒精消毒。
2)用食指與中指夾住小鼠頸部，以固定住乳鼠的頭部，用力要輕，以防小鼠窒息，無名指與小指固定住小鼠尾部，使小鼠身體輕微后彎，此時小鼠腹部會完全曝露，可見位于小鼠胸廓下方的大部分肝臟區(qū)域，呈暗紅色。
3)取無菌30-gauge 50-μl玻璃微量進樣器吸取DiI熒光染料標記人肝癌SK-Hep-1細胞懸液20μl，以30度的入針角度刺入，從皮膚外部直接扎入小鼠肝葉，入針深度2.5ml即可，此時小鼠肝臟稚嫩，容易扎穿，而導致腫瘤細胞懸液的損失。
4)將熒光染料標記后的人肝癌SK-Hep-1細胞懸液緩慢的注射入小鼠肝內(nèi)，注射時間為2min/只，出針后用無菌酒精棉球迅速輕按注射部位1min，以防止細胞懸液的滲出，注如果注射位置準確的定位于肝葉，乳鼠不會劇烈掙扎，基本上無血液滲出。
5)歸還母鼠哺育，保證飼養(yǎng)環(huán)境的清潔。
6)整個操作過程，請確保操作人員不要直接用手觸碰乳鼠皮膚，以確保母鼠對荷瘤后幼鼠的識別。
7)荷瘤60h后，每隔48h，活體成像檢測一次；尾靜脈取血，4℃靜置，隔日分離血清，-80℃保存待用；取荷瘤小鼠以10g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉，解剖觀察；取癌灶及癌周組織做冰凍切片，于熒光顯微鏡激發(fā)光549nm下觀察；部分組織用40g幾中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下常規(guī)病理組織學觀察。
4、試驗結(jié)果荷瘤48h后，解剖觀察，由于荷瘤細胞濃度過低，荷瘤成功率明顯降低至0.5％，荷瘤成功的小鼠，基本狀況同實施例2。
實施例5原位移植性人肝癌Bel-7402小鼠模型的構(gòu)建1、試驗材料30-gauge 50-μl玻璃微量進樣器(上海高欣玻璃儀器廠)；DiI熒光染料標記的人肝癌細胞Bel-7402懸液(1.0×107個/ml)；2、試驗動物昆明種孕鼠，購于山東大學實驗動物中心，于SPF清潔級實驗動物房內(nèi)適應飼養(yǎng)，取出生后3d小鼠為荷瘤受體，雌雄均有，平均體重為1.9g。
3、試驗方法1)取3日齡昆明種乳鼠，腹部皮膚用酒精消毒。
2)用食指與中指夾住小鼠頸部，以固定住乳鼠的頭部，用力要輕，以防小鼠窒息，無名指與小指固定住小鼠尾部，使小鼠身體輕微后彎，此時小鼠腹部會完全曝露，可見位于小鼠胸廓下方的大部分呈暗紅色的肝臟區(qū)域。
3)取無菌30-gauge 50-μl玻璃微量進樣器吸取HepG-2細胞懸液10μl，以30度的進針角度，從皮膚外部直接扎入小鼠肝葉，入針深度2ml即可，此時小鼠肝臟稚嫩，容易扎穿，而導致細胞懸液的損失。
4)將細胞懸液緩慢的注射入小鼠肝內(nèi)，注射時間為2min/只，出針后用無菌酒精棉球迅速輕按注射部位1min，以防止細胞懸液的滲出，如果注射位置準確的定位于肝葉，乳鼠不會劇烈掙扎，基本上無血液滲出。
5)整個操作過程，請確保操作人員不要直接用手觸碰乳鼠皮膚，以確保母鼠對荷瘤后幼鼠的識別。
6)歸還母鼠哺育，保證飼養(yǎng)環(huán)境的清潔，隨時觀察乳鼠的生存狀態(tài)。
7)荷瘤60h后，每隔48h，活體成像檢測一次；尾靜脈取血，4℃靜置，隔日分離血清，-80℃保存待用；取荷瘤小鼠以10g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉，解剖觀察；取肉眼可見癌灶及癌周組織冰凍切片，于熒光顯微鏡激發(fā)光549nm觀察下；部分組織用40g/L中性福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下常規(guī)病理組織學觀察。
4、試驗結(jié)果由于荷瘤細胞懸液體積過低，荷瘤成功率明顯降低至1％，荷瘤成功的小鼠基本狀況同實施例2。
權(quán)利要求
1.一種原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法，步驟是[1]人肝癌細胞株的培養(yǎng)選人肝癌細胞株常規(guī)傳代培養(yǎng)，備用；[2]熒光染料DiI標記的人肝癌細胞懸液的制備選取上述對數(shù)生長期的人肝癌細胞株之一，與20μg/ml活體熒光染料DiI在37℃～38℃下共孵30min～60min，之后，0.25％無菌胰蛋白酶消化，以基本培養(yǎng)液收集細胞并調(diào)整細胞懸液濃度至0.5×106個/ml～1.0×109個/ml；[3]原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型選用昆明種三日齡乳鼠，腹部皮膚消毒后，利用無菌30-gauge50-μl玻璃微量進樣器，將10μl～50μl上述DiI標記的人肝癌細胞懸液，直接移植入乳鼠肝葉內(nèi)，建立人肝癌小鼠原位移植性模型；[4]模型鑒定。
2.如權(quán)利要求1所述原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法，其特征是，步驟[1]所述人肝癌細胞是HepG-2、Bel-7402、SK-Hep-1之一；培養(yǎng)方法是胎牛血清濃度為10％的細胞培養(yǎng)液，37℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)，其中人肝癌細胞株HepG-2、SK-Hep-1選用DMEM-H基本培養(yǎng)液；Bel-7402選用RPMI1640基本培養(yǎng)液。
3.如權(quán)利要求1所述原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法，其特征是，步驟[2]所述活體熒光染料DiI標記人肝癌細胞的方法是活體熒光染料DiI使用前用無水乙醇溶解至2.0mg/ml，0.22μm的一次性過濾器過濾除菌后，室溫密閉避光保存，備用；10％血清培養(yǎng)液將上述熒光染料DiI稀釋至20μg/ml的終濃度，與對數(shù)生長期的貼壁人肝癌細胞于37℃孵箱內(nèi)共孵45min，每隔10min將熒光染液搖勻一次，肝癌細胞即被熒光染料DiI完全標記。
4.如權(quán)利要求1所述原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法，其特征是，步驟[2]所述熒光染料DiI標記的細胞懸液的制備方法是收集胰蛋白酶消化后的熒光染料DiI標記的細胞，1000r/min離心3min，重復3次，每次均用37℃預溫基本培養(yǎng)液重懸；經(jīng)計數(shù)，存活率超過80％后，以基本培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1.0×108個/ml；于熒光顯微鏡激發(fā)光549nm下觀察，確定細胞被成功標記后，待用。
5.如權(quán)利要求1所述原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法，其特征是，步驟[3]所述直接移植人肝癌細胞懸液入乳鼠肝葉的方法是用食指與中指夾住乳鼠頸部，以固定住乳鼠的頭部，無名指與小指固定住小鼠尾部，此時小鼠腹部會完全曝露，可見位于小鼠胸廓下方的呈暗紅色的肝臟區(qū)域；無菌30-gauge 50-μl玻璃微量進樣器吸取步驟[2]熒光標記的人肝癌細胞懸液30μl，以30度的入針角度刺入小鼠肝葉內(nèi)，入針深度2mm～2.5mm，將人肝癌細胞由小鼠體外直接移植入小鼠肝葉內(nèi)，注射時間為2min/只～3min/只，出針后用酒精棉球迅速輕按注射部位1min～2min，之后歸還母鼠，以常規(guī)方式飼養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求1所述原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法，其特征是，步驟[4]所述模型鑒定采用如下手段(1)人肝癌細胞在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況-----熒光染料DiI標記技術(shù)結(jié)合活體成像系統(tǒng)；(2)人肝癌細胞的在荷瘤小鼠肝內(nèi)的定性，定位示蹤-----活體熒光染料DiI標記人肝癌細胞，冰凍切片，熒光顯微鏡觀察；(3)荷瘤小鼠肝臟病理學變化-----石蠟切片HE染色觀察；(4)荷瘤小鼠血清甲胎蛋白表達變化的鑒定----定量ELISA測定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種原位移植構(gòu)建人類肝癌小鼠模型的方法，即利用具有正常免疫功能的昆明種乳鼠作為荷瘤受體，于小鼠體外向鼠肝葉內(nèi)直接注射人肝癌細胞懸液，建立人肝癌細胞原位移植性荷瘤模型。本發(fā)明方法實施簡單，成功率高，基于本發(fā)明，可以在小鼠正常的機體免疫環(huán)境下，實時監(jiān)測肝癌細胞與小鼠免疫系統(tǒng)的相互作用，能夠非常真實地模擬人類體內(nèi)免疫耐受及抗腫瘤免疫的全過程，為免疫生物學藥物的篩選及藥理的研究提供更為理想的操作平臺。
文檔編號C12N5/08GK101020066SQ200710013248
公開日2007年8月22日 申請日期2007年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月19日
發(fā)明者白增亮, 王澤 , 張敬平 申請人:山東大學