小鼠脂肪干細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了小鼠脂肪干細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的鑒定方法，將小鼠脂肪干細(xì)胞在體外連續(xù)傳代，然后包括形態(tài)學(xué)的變化、增殖速度的激增、異常染色體的出現(xiàn)和比例的增加、DNA含量的降低以及表面分子的變化五個(gè)步驟。其中形態(tài)學(xué)和增殖速度的觀察與檢測(cè)可用于初步的判斷小鼠脂肪干細(xì)胞是否發(fā)生了轉(zhuǎn)化；染色體的核型分析從局部水平上來(lái)分析小鼠脂肪干細(xì)胞染色體是否異常，而DNA含量的分析則從整體水平上來(lái)檢測(cè)核物質(zhì)的量變，此二法最能說(shuō)明小鼠脂肪干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與否；小鼠脂肪轉(zhuǎn)化后，同時(shí)也引起小鼠脂肪干細(xì)胞典型分子的表達(dá)異常，包括CD44，CD105和Sca-1的變化，反而言之，后期研究中，也可以通過(guò)監(jiān)測(cè)這些表面分子的變化來(lái)判斷小鼠脂肪干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，此法則更為簡(jiǎn)單、直接與有效。
【專利說(shuō)明】小鼠脂肪干細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種小鼠脂肪干細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]脂肪干細(xì)胞具有多向分化的潛能，在體外可定向分化為脂肪、成骨、軟骨、肝臟、心肌細(xì)胞等，相比于骨髓干細(xì)胞，其具有取材容易、獲取量大等優(yōu)點(diǎn)，而且還具有免疫抑制的效應(yīng)，因此具有重要的意義。
[0003]小鼠作為一個(gè)重要的模式動(dòng)物，在基礎(chǔ)研究方面有著廣泛的應(yīng)用，但是脂肪干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，其生物學(xué)特性很容易發(fā)生改變，對(duì)于如何有效的鑒定小鼠脂肪干細(xì)胞是否發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化，目前還缺乏全面且典型的檢測(cè)指標(biāo)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種小鼠脂肪干細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的鑒定方法，為小鼠脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的鑒定提供全面，簡(jiǎn)單，有效的檢測(cè)指標(biāo)。
[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:小鼠脂肪干細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的鑒定方法，對(duì)小鼠脂肪干細(xì)胞分離與培養(yǎng)，將小鼠脂肪干細(xì)胞在體外連續(xù)傳代，同時(shí)進(jìn)行包括以下步驟的操作:
[0006](I)形態(tài)學(xué)觀察:分別觀察低代次正常細(xì)胞，初見衰老時(shí)的細(xì)胞和越過(guò)衰老后細(xì)胞的形態(tài)，從形態(tài)學(xué)上觀察越過(guò)衰老后細(xì)胞是否出現(xiàn)異常；
[0007](2)增殖速度檢測(cè):分別繪制低代次正常細(xì)胞，初見衰老時(shí)的細(xì)胞和越過(guò)衰老后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，計(jì)算各自的細(xì)胞倍增時(shí)間，從增殖速度的角度觀察越過(guò)衰老后細(xì)胞是否出現(xiàn)異常；
[0008](3)染色體形態(tài)與數(shù)量分析:分別對(duì)低代次的正常細(xì)胞和越過(guò)衰老后的細(xì)胞進(jìn)行低滲，固定和破核處理，釋放出染色體后，用Giemsa染色法，分別對(duì)這兩種細(xì)胞的染色體進(jìn)行染色，微鏡下統(tǒng)計(jì)每個(gè)細(xì)胞染色體的數(shù)量以及染色體的形態(tài)特征；
[0009](4)DNA的含量分析:分別消化低代次的正常細(xì)胞和越過(guò)衰老后的細(xì)胞，PI染色后，用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)這兩種細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，觀察越過(guò)衰老后的細(xì)胞的DNA含量是否有明顯的變化；
[0010](5)表面分子的表達(dá):分別消化低代次的正常細(xì)胞和越過(guò)衰老后的細(xì)胞，分別用針對(duì)CD44，CD105和Sca-1的熒光抗體與細(xì)胞結(jié)合，再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)這兩種細(xì)胞中⑶44，⑶105和Sca-1的陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度，通過(guò)其變化來(lái)檢測(cè)小鼠脂肪干細(xì)胞是否發(fā)生了轉(zhuǎn)化。
[0011]作為優(yōu)選，上述小鼠脂肪干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)過(guò)程包括以下步驟:
[0012](6)取4周齡的ICR雄鼠，處死，對(duì)其全身消毒；
[0013](7)無(wú)菌條件下切取腹股溝處的脂肪組織，放入DMEM/F12中洗凈血污；
[0014](8)充分剪碎，加入消化液，37°C消化lh，消化液的組成成分為10%胎牛血清(FBS)，0.09%膠原酶 I，余量為 DMEM/F12 ；
[0015](9)消化完后，離心，棄掉上層成熟脂肪細(xì)胞和中層的消化液，再用DMEM/F12重懸底層的細(xì)胞；
[0016](10)將細(xì)胞懸液依次用孔徑為250 μ m和80 μ m的尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，收集濾液；
[0017](11)將最后得到的濾液離心，吸棄漂浮的脂肪細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)洗滌3遍，再用含20%胎牛血清，4ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子，50 μ g/ml維生素C的DMEM/F12中連續(xù)傳代。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:
[0019]提供了更全面的檢測(cè)小鼠脂肪干細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的指標(biāo)，研究人員可以根據(jù)實(shí)際條件選擇合適的指標(biāo)來(lái)鑒定細(xì)胞，以確保細(xì)胞的生物安全性和有效性。

【具體實(shí)施方式】
[0020]為了使本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0021]一、首先對(duì)小鼠脂肪干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)，包括以下步驟:
[0022](I)取4周齡的ICR雄鼠，處死，對(duì)其全身消毒；
[0023](2)無(wú)菌條件下切取腹股溝處的脂肪組織，放入DMEM/F12中洗凈血污；
[0024](3)充分剪碎，加入消化液，37°C消化lh，消化液的組成成分為10%胎牛血清(FBS)，0.09%膠原酶 I，余量為 DMEM/F12 ；
[0025](4)消化完后，離心，棄掉上層成熟脂肪細(xì)胞和中層的消化液，再用DMEM/F12重懸底層的細(xì)胞；
[0026](5)將細(xì)胞懸液依次用孔徑為250 μ m和80 μ m的尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，收集濾液；
[0027](6)將最后得到的濾液離心，吸棄漂浮的脂肪細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)洗滌3遍，再用含20%胎牛血清，4ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子，50 μ g/ml維生素C的DMEM/F12中連續(xù)傳代。
[0028]二、在上述小鼠脂肪干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將小鼠脂肪干細(xì)胞在體外連續(xù)傳代，同時(shí)進(jìn)行包括以下步驟的操作:
[0029](7)形態(tài)學(xué)觀察:
[0030]方法:將小鼠脂肪干細(xì)胞在體外連續(xù)傳代，分別觀察對(duì)比第3代(即低代次狀態(tài)良好時(shí)的小鼠脂肪干細(xì)胞)，第23代(即高代次衰老的小鼠脂肪干細(xì)胞)，第30代(即高代次越過(guò)衰老的小鼠脂肪干細(xì)胞)的形態(tài)特征。
[0031]結(jié)果:發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在第3代的時(shí)立體感很強(qiáng)，細(xì)胞很細(xì)小飽滿，典型的成纖維狀，說(shuō)明其狀態(tài)良好；待其生長(zhǎng)至23代時(shí)，細(xì)胞逐漸拉長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)部分顯得寬大，立體感變?nèi)?，?xì)胞界限不清晰，說(shuō)明細(xì)胞狀態(tài)變差；再待其傳至第30代，細(xì)胞密度較稀時(shí)，細(xì)胞形態(tài)已明顯發(fā)生了改變，呈現(xiàn)出細(xì)長(zhǎng)的神經(jīng)細(xì)胞樣，待其長(zhǎng)滿后，則成鋪路石狀，細(xì)胞立體感非常強(qiáng)，細(xì)胞間的界限非常明顯，說(shuō)明其狀態(tài)非常好。
[0032] 細(xì)胞在體外隨著細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，細(xì)胞會(huì)逐漸衰老直至死亡，此為正?，F(xiàn)象，但是小鼠脂肪干細(xì)胞在傳代過(guò)程中呈現(xiàn)的則是先衰老，狀態(tài)變差，隨著進(jìn)一步的傳代，其又逆轉(zhuǎn)到良好的狀態(tài)，通過(guò)此非正常的變化，可以初步判斷小鼠脂肪干細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化。
[0033](8)增殖速度檢測(cè):
[0034]方法:將第3代(即低代次狀態(tài)良好的小鼠脂肪干細(xì)胞)和第30代(即越過(guò)衰老后的的小鼠脂肪干細(xì)胞)分別接種到24孔板中，每孔I萬(wàn)細(xì)胞。24h后對(duì)每組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每天3孔，連計(jì)數(shù)8天，繪制生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算三組細(xì)胞的倍增時(shí)，以確定其增長(zhǎng)速度。
[0035]結(jié)果:第3代的細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞倍增的時(shí)間為24.2±0.91h ;當(dāng)細(xì)胞傳至第16代時(shí)，倍增時(shí)間延長(zhǎng)為36.1±1.81h，說(shuō)明其增殖速度變慢；待其再傳至30代時(shí)，細(xì)胞的倍增時(shí)間為16.2±0.46h，且比第三代的還要短，說(shuō)明其增殖速度比第3代的還要快。
[0036]細(xì)胞隨著代次的增加會(huì)逐漸衰老，表現(xiàn)在增殖速率上則是生長(zhǎng)速度的降低。但是小鼠脂肪干細(xì)胞隨著代次的進(jìn)一步增加，反而增殖速度會(huì)進(jìn)一步的提高，預(yù)示著細(xì)胞可能出現(xiàn)了異常，亦可作為一個(gè)初步判斷細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的指標(biāo)。
[0037](9)染色體核型分析
[0038]方法:分別將第3代(即低代次狀態(tài)良好的小鼠脂肪干細(xì)胞)和第30代(即越過(guò)衰老后的的小鼠脂肪干細(xì)胞)用0.1 μ g/ml秋水仙素37度處理2小時(shí)，再用胰酶消化細(xì)胞，然后用0.075M KCL37度低滲處理細(xì)胞30min。低滲結(jié)束后，1200rpm離心1min細(xì)胞，再棄去上清液，加入4ml的固定液固定30min，重復(fù)2次。最后一次離心后棄上清，滴片，最后Giemsa染色,顯微鏡下觀察。
[0039]結(jié)果:發(fā)現(xiàn)細(xì)胞傳至30代，小鼠脂肪干細(xì)胞的染色體出現(xiàn)了單倍體，三倍體，斷裂和融合這些異常的核型，且這些異常染色體的比例將近95%。而第三代的脂肪干細(xì)胞核型基本正常，且異常染色體的比例僅為8%，由此可以從局部水平上說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化。
[0040](10) DNA 含量分析
[0041]方法:分別消化第3代(即低代次狀態(tài)良好的小鼠脂肪干細(xì)胞)、第16代(初見衰老后的小鼠脂肪干細(xì)胞)和第30代(即越過(guò)衰老后的的小鼠脂肪干細(xì)胞)，用碘化丙啶染色15min，使其與DNA充分結(jié)合；之后再用I %的多聚甲醛固定15min以固定細(xì)胞的形態(tài)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞的DNA含量。
[0042]結(jié)果:相比于第3代的小鼠脂肪干細(xì)胞，第30代細(xì)胞的DNA指數(shù)僅為0.84，顯著的低于第3代的細(xì)胞，說(shuō)明第30代的細(xì)胞的DNA含量已經(jīng)明顯的減少，從而在DNA整體水平上確定小鼠脂肪干細(xì)胞確實(shí)已經(jīng)發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化。
[0043](11)表面分子的分析
[0044]方法:用tryple分別消化第3代(即低代次狀態(tài)良好的小鼠脂肪干細(xì)胞)和第30代(即越過(guò)衰老后的的小鼠脂肪干細(xì)胞)，分別用⑶44，⑶105和Sca-1的熒光直標(biāo)單抗與之冰上共孵育30min，使抗體與細(xì)胞充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的杜氏磷酸鹽緩沖液洗漆3遍,充分洗去未結(jié)合的抗體。最后一次洗漆離心后,用1%的多聚甲醒固定30min,再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)這兩種代次細(xì)胞⑶44，⑶105和Sca-1的表達(dá)情況。
[0045] 結(jié)果:與第3代的小鼠脂肪干細(xì)胞相比，細(xì)胞傳至30代。⑶44表達(dá)的陽(yáng)性率不會(huì)有明顯的改變，但是Sca-1的表達(dá)率會(huì)極顯著的升高，而CD105則完全不表達(dá)。對(duì)于陽(yáng)性表達(dá)的⑶44與Sca-1，與第三代的小鼠脂肪干細(xì)胞相比，第30代的細(xì)胞⑶44的平均表達(dá)水平極顯著的降低，而Sca-1的平均表達(dá)水平則極顯著的升高。因此可以Sca-1陽(yáng)性率及陽(yáng)性表達(dá)水平的顯著升高，⑶44平均表達(dá)水平的降低，以及⑶105表達(dá)的消失為指標(biāo)來(lái)確定細(xì)胞發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化。
[0046]本實(shí)施例所述的小鼠脂肪干細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的鑒定方法具有以下特點(diǎn):
[0047]1.從小鼠脂肪干細(xì)胞的狀態(tài)的由好變差，然后再變好的異常變化來(lái)判斷小鼠脂肪干細(xì)胞發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化。
[0048]2.從小鼠脂肪干細(xì)胞的增殖速度由快變慢，再顯著加快的異常變化來(lái)判斷小鼠脂肪干細(xì)胞發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化。
[0049]3.通過(guò)染色體的核型分析，觀察染色體的異常變化，從局部水平上來(lái)判斷小鼠脂肪干細(xì)胞發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化。
[0050]4.通過(guò)DNA含量的分析，從整體水平上判斷小鼠脂肪干細(xì)胞發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化。[0051 ] 5.通過(guò)⑶44陽(yáng)性的小鼠脂肪干細(xì)胞⑶44平均表達(dá)水平的顯著降低來(lái)判斷小鼠脂肪干細(xì)胞發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化。
[0052]6.通過(guò)小鼠脂肪干細(xì)胞Sca-1的陽(yáng)性率降低來(lái)判斷小鼠脂肪干細(xì)胞發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化。
[0053]7.通過(guò)Sca-1陽(yáng)性的小鼠脂肪干細(xì)胞Sca-1平均表達(dá)水平的顯著升高來(lái)判斷小鼠脂肪干細(xì)胞發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化。
[0054]8.通過(guò)小鼠脂肪干細(xì)胞⑶105表達(dá)的消失來(lái)判斷小鼠脂肪干細(xì)胞發(fā)生了自發(fā)轉(zhuǎn)化。
[0055]本實(shí)施例建立了一套全面檢測(cè)小鼠脂肪干細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的方法，包括形態(tài)學(xué)的變化，增殖速度的激增，異常染色體的出現(xiàn)和比例的增加，DNA含量的降低以及表面分子的變化。其中形態(tài)學(xué)和增殖速度的觀察與檢測(cè)可用于初步的判斷小鼠脂肪干細(xì)胞是否發(fā)生了轉(zhuǎn)化，操作起來(lái)簡(jiǎn)單易行；染色體的核型分析從局部水平上來(lái)分析小鼠脂肪干細(xì)胞染色體是否異常，而DNA含量的分析則從整體水平上來(lái)檢測(cè)核物質(zhì)的量變，此二法操作起來(lái)較復(fù)雜，卻最能說(shuō)明小鼠脂肪干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與否。小鼠脂肪轉(zhuǎn)化后，同時(shí)也引起小鼠脂肪干細(xì)胞典型分子的表達(dá)異常，包括⑶44，⑶105和Sca-1的變化，反而言之，后期研究中，也可以通過(guò)監(jiān)測(cè)這些表面分子的變化來(lái)判斷小鼠脂肪干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，此法則更為簡(jiǎn)單，直接與有效。
[0056]以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.小鼠脂肪干細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化的鑒定方法，其特征在于:對(duì)小鼠脂肪干細(xì)胞分離與培養(yǎng)，將小鼠脂肪干細(xì)胞在體外連續(xù)傳代，同時(shí)進(jìn)行包括以下步驟的操作: (1)形態(tài)學(xué)觀察:分別觀察低代次正常細(xì)胞，初見衰老時(shí)的細(xì)胞和越過(guò)衰老后細(xì)胞的形態(tài)，從形態(tài)學(xué)上觀察越過(guò)衰老后細(xì)胞是否出現(xiàn)異常； (2)增殖速度檢測(cè):分別繪制低代次正常細(xì)胞，初見衰老時(shí)的細(xì)胞和越過(guò)衰老后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，計(jì)算各自的細(xì)胞倍增時(shí)間，從增殖速度的角度觀察越過(guò)衰老后細(xì)胞是否出現(xiàn)異常； (3)染色體形態(tài)與數(shù)量分析:分別對(duì)低代次的正常細(xì)胞和越過(guò)衰老后的細(xì)胞進(jìn)行低滲，固定和破核處理，釋放出染色體后，用Giemsa染色法，分別對(duì)這兩種細(xì)胞的染色體進(jìn)行染色，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)每個(gè)細(xì)胞染色體的數(shù)量以及染色體的形態(tài)特征； (4)DNA的含量分析:分別消化低代次的正常細(xì)胞和越過(guò)衰老后的細(xì)胞，PI染色后，用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)這兩種細(xì)胞內(nèi)DNA的含量，觀察越過(guò)衰老后的細(xì)胞的DNA含量是否有明顯的變化； (5)表面分子的表達(dá):分別消化低代次的正常細(xì)胞和越過(guò)衰老后的細(xì)胞，分別用針對(duì)⑶44，⑶105和Sca-1的熒光抗體與細(xì)胞結(jié)合，再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)這兩種細(xì)胞中⑶44，⑶105和Sca-1的陽(yáng)性率和表達(dá)強(qiáng)度，通過(guò)其變化來(lái)檢測(cè)小鼠脂肪干細(xì)胞是否發(fā)生了轉(zhuǎn)化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于:所述小鼠脂肪干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)包括以下步驟: (6)取4周齡的ICR雄鼠，處死，對(duì)其全身消毒； (7)無(wú)菌條件下切取腹股溝處的脂肪組織，放入DMEM/F12中洗凈血污； (8)充分剪碎，加入消化液，37°C消化lh，消化液的組成成分為10%胎牛血清(FBS)，.0.09%膠原酶I，余量為DMEM/F12 ； (9)消化完后，離心，棄掉上層成熟脂肪細(xì)胞和中層的消化液，再用DMEM/F12重懸底層的細(xì)胞； (10)將細(xì)胞懸液依次用孔徑為250μ m和80 μ m的尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，收集濾液； (11)將最后得到的濾液離心，吸棄漂浮的脂肪細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)洗滌3遍，再用含20%胎牛血清，4ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子，50μδ/πι1維生素C的DMEM/F12中連續(xù)傳代。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104073466SQ201410000495
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】張運(yùn)海, 魏超, 李運(yùn)生, 章孝榮, 方富貴, 張鵬飛, 李俠, 姜少帥, 韓菲, 宋丹丹, 劉通 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)