專利名稱：用于體外測(cè)試化學(xué)物質(zhì)的發(fā)育毒性和胚胎毒性的蛋白生物標(biāo)志物的制作方法
用于體外測(cè)試化學(xué)物質(zhì)的發(fā)育毒性和胚胎毒性的蛋白生物
標(biāo)志物
背景技術(shù)：
目前化學(xué)物質(zhì)的毒理學(xué)檢測(cè)主要是在體內(nèi)完成的，其使用多種動(dòng)物物種并且另外 考慮人類臨床、生物化學(xué)、病理學(xué)和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。在過(guò)去數(shù)年中，越來(lái)越清楚地發(fā)現(xiàn)，某些 物質(zhì)對(duì)于兒童的危害性特別高，因此，發(fā)育中的人類腦的特定易攻擊點(diǎn)是研究焦點(diǎn)。同時(shí)， 推薦對(duì)具有已知的神經(jīng)毒性或致畸(特別是神經(jīng)致畸)風(fēng)險(xiǎn)的物質(zhì)進(jìn)行額外的胚胎毒性測(cè) 試。此外，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(EPA)要求對(duì)殺蟲劑進(jìn)行胚胎毒性測(cè)試。如果某物質(zhì)用作藥物， 貝Ij要求進(jìn)行另夕卜的測(cè)試(S7ASafety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals, Guidelinesof the International Conference on Harmonization, ICH, 2001)。化學(xué)物質(zhì)的發(fā)育神經(jīng)毒性研究受到US EPA的指南(測(cè)試指南870. 63000)和OE⑶ 的指南草案(0ECD指南426)的指引。根據(jù)這些指南進(jìn)行的體內(nèi)研究包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(通常 是大鼠)的腦的形態(tài)學(xué)研究、成套的行為測(cè)試、年幼動(dòng)物(直至成年期)的發(fā)育研究、神經(jīng) 膠質(zhì)增生和細(xì)胞毒性的生物標(biāo)志物的測(cè)定，以及另外的生物標(biāo)志物的研究。這些毒性測(cè)試 需要大量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)于每種物質(zhì)，在3-4個(gè)月的時(shí)間內(nèi)將消耗大約140只母代動(dòng)物及其 1000只后代。由于技術(shù)和物流上的需要，這些體內(nèi)測(cè)試的人力和成本耗費(fèi)非常高。然而，關(guān) 鍵一點(diǎn)是，在相應(yīng)的指南和動(dòng)物中，沒(méi)有清楚的定義可信賴的和明確的末端點(diǎn)。目前的測(cè)試 是否真能預(yù)測(cè)人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和相關(guān)毒性，是不確定的。在美國(guó)，這種情況已經(jīng)引 起動(dòng)物權(quán)利和保護(hù)組織例如PETA的請(qǐng)?jiān)?，?qǐng)求廢除指南OPPTS 870. 6300。目前，在歐洲市場(chǎng)上有大約100，000種化學(xué)物質(zhì)。但是，這些物質(zhì)中僅有一少部分 的可靠的毒理學(xué)數(shù)據(jù)是可以獲得的。尤其是那些在1981年以前上市的化學(xué)物質(zhì)，缺少安全 性數(shù)據(jù)。因此，不能全面評(píng)估對(duì)雇員、消費(fèi)者和環(huán)境的危險(xiǎn)。為了改善這種不令人滿意的狀 況，歐盟委員會(huì)(European Commission)提出了所謂的REACH概念，即化學(xué)物質(zhì)的注冊(cè)、評(píng) 價(jià)禾口認(rèn)證(Registration, Evaluation andAuthorization of Chemicals)。REACH 的目標(biāo) 是系統(tǒng)地評(píng)價(jià)生產(chǎn)、使用或進(jìn)口的數(shù)量在每年1頓以上的化學(xué)物質(zhì)的危險(xiǎn)?；瘜W(xué)物質(zhì)的安 全性證明的負(fù)擔(dān)將落在生產(chǎn)者和制作者身上。關(guān)于歐洲的REACH立法和美國(guó)及日本的相似 發(fā)展(Schrattenholz和Klemm，2006和2007)，似乎測(cè)試化學(xué)物質(zhì)的發(fā)育神經(jīng)毒性的需要將 導(dǎo)致在可預(yù)見的將來(lái)測(cè)試動(dòng)物消耗的大規(guī)模增長(zhǎng)。在這個(gè)背景下，毒性相關(guān)篩選的高度預(yù)測(cè)性的、省時(shí)的體外測(cè)試法的開發(fā)變得日 益重要。細(xì)胞培養(yǎng)模型將作為高度爭(zhēng)議性的、有問(wèn)題的、有時(shí)令人討厭的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的替代 品。目標(biāo)是取代目前評(píng)估神經(jīng)毒性、尤其是神經(jīng)發(fā)育毒性的法令所需要的動(dòng)物測(cè)試，這些動(dòng) 物測(cè)試成本非常高且非常耗時(shí)。體外模型已經(jīng)在藥理學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用了數(shù)年。很多目前的體外檢驗(yàn)涉及分化模型，其 使用胚胎干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞測(cè)試(EST)顯示出很有前景的結(jié)果，該測(cè)試能夠區(qū)分強(qiáng)烈致 畸的、中等的或無(wú)胚胎毒性的化合物(Spielmarm等人，1997)。EST利用小鼠胚胎干細(xì)胞在 培養(yǎng)物中分化的潛力，從而在體外測(cè)試胚胎毒性。該模型有局限性，部分原因是，僅僅對(duì)那 些破壞心臟分化的化合物定義了毒理學(xué)末端點(diǎn)。
因此，本領(lǐng)域需要一種改進(jìn)的體外方法，用于可靠地確定化學(xué)物質(zhì)和藥物的毒性。 特別地，本領(lǐng)域需要提供新型的、快速的和智能的體外測(cè)試策略以測(cè)定發(fā)育毒性。本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于體外篩選化學(xué)物質(zhì)的毒性、尤其是發(fā)育毒性的方法和試 劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，特異性蛋白生物標(biāo)志物是化學(xué)和藥物化合物的發(fā)育毒性的診斷。 物質(zhì)對(duì)這些生物標(biāo)志物的影響是該物質(zhì)的發(fā)育毒性的預(yù)測(cè)。所述影響可以這樣測(cè)定將其 中產(chǎn)生至少一種蛋白生物標(biāo)志物的細(xì)胞樣品與物質(zhì)接觸，并測(cè)定由于暴露于該物質(zhì)造成的 該細(xì)胞樣品中所述蛋白生物標(biāo)志物的變化。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于測(cè)定物質(zhì)的發(fā)育毒性的體外方法，其包括以下步 驟⑴將細(xì)胞樣品暴露于該物質(zhì)；和(ii)測(cè)定由于暴露于該物質(zhì)造成的該細(xì)胞樣品中一種或多種蛋白生物標(biāo)志物的變化。本發(fā)明的“蛋白生物標(biāo)志物”選自熱休克蛋白β -1 (HspBl)、Ras-GTP酶-活化 蛋白SH3-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(G!3BP)、Ran結(jié)合蛋白5 (RanBP5)、鈣網(wǎng)蛋白(Calr)、二氫嘧啶 酶-樣2(DRP2)、應(yīng)激誘導(dǎo)的磷蛋白1 (STIPl)、Uhf2蛋白(U2AF)、鈣結(jié)合蛋白39，同種型 CRA_b (Cab39)、含有NmrA-樣家族結(jié)構(gòu)域的1 (NMRLl)，及其翻譯后同種型。本發(fā)明的生物標(biāo)志物是熟知的蛋白。這些蛋白的通常命名總結(jié)于表1。表 權(quán)利要求
1.用于測(cè)定物質(zhì)的發(fā)育毒性的體外方法，其包括以下步驟 (i)將細(xì)胞樣品暴露于該物質(zhì)；和( )測(cè)定由于暴露于該物質(zhì)造成的該細(xì)胞樣品中一種或多種蛋白生物標(biāo)志物的變化， 其中所述蛋白生物標(biāo)志物選自熱休克蛋白β-1 (HspBl)、Ras-GTP酶-活化蛋白 SH3-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(G3BP)、Ran結(jié)合蛋白5(RanBP5)、鈣網(wǎng)蛋白(Calr)、二氫嘧啶酶-樣 2(DRP2)、應(yīng)激誘導(dǎo)的磷蛋白1 (STIPl)、Uhf2蛋白(U2AF)、鈣結(jié)合蛋白39，同種型CRA_ b (Cab39)、含有NmrA-樣家族結(jié)構(gòu)域的1 (NMRLl)、及其翻譯后同種型。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞樣品選自器官樣品、組織、體液、細(xì)胞和細(xì)胞裂解物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞樣品包括脊椎動(dòng)物細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞例 如人類細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞樣品包括干細(xì)胞，特別是全能的、多能的、多潛能 的和/或寡能的干細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1的方法，其用于測(cè)定胚胎毒性，其中所述細(xì)胞樣品包括胚胎干細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(ii)包括定性或定量測(cè)定一種或多種生物標(biāo)志物。
7.權(quán)利要求1的方法，其中持續(xù)測(cè)定細(xì)胞樣品中一種或多種蛋白生物標(biāo)志物的變化。
8.權(quán)利要求1的方法，其中一種或多種生物標(biāo)志物的測(cè)定包括免疫學(xué)測(cè)定、活性測(cè)定 和/或分子測(cè)定。
9.權(quán)利要求1的方法，其中一種或多種生物標(biāo)志物的測(cè)定包括熒光檢測(cè)。
10.權(quán)利要求1的方法，還包括測(cè)定至少一種另外的蛋白生物標(biāo)志物，所述另外的蛋白 生物標(biāo)志物選自熱休克蛋白8 (HSP8)、應(yīng)激誘導(dǎo)的磷蛋白1 (P-同種型2) ,Fascin同源物1， 肌動(dòng)蛋白集束蛋白(Fscnl)、核不均一核糖核蛋白A/B同種型2，及其翻譯后同種型。
11.一種或多種蛋白用作測(cè)定物質(zhì)的發(fā)育毒性的生物標(biāo)志物的用途，所述蛋白選自熱 休克蛋白β-I(HspBl)、Ras-GTP酶-活化蛋白SH3-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(G!3BP)、Ran結(jié)合蛋白 5 (RanBP5)、鈣網(wǎng)蛋白(Calr)，二氫嘧啶酶-樣2 (DRP2)、應(yīng)激誘導(dǎo)的磷蛋白1 (STIPl) ,U2af2 蛋白(U2AF)、鈣結(jié)合蛋白39，同種型CRA_b(Cab39)、含有NmrA-樣家族結(jié)構(gòu)域的1(匪RL1)、 熱休克蛋白8 (HSP8) ,Fascin同源物1，肌動(dòng)蛋白集束蛋白(Fscnl)、核不均一核糖核蛋白A/ B 同種型 2 (hnRNP)。
12.權(quán)利要求11的用途，用于測(cè)定胚胎毒性。
13.用于測(cè)定物質(zhì)的發(fā)育毒性的試劑盒，其包括 一種或多種細(xì)胞樣品，和用于測(cè)定一種或多種蛋白生物標(biāo)志物的工具，所述蛋白生物標(biāo)志物選自熱休克蛋 白β -1 (HspBl)、Ras-GTP酶-活化蛋白SH3-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白(G!3BP)、Ran結(jié)合蛋白 5 (RanBP5)、鈣網(wǎng)蛋白(Calr)、二氫嘧啶酶-樣2 (DRP2)、應(yīng)激誘導(dǎo)的磷蛋白1 (STIPl) ,U2af2 蛋白(U2AF)、鈣結(jié)合蛋白39，同種型CRA_b (Cab39)、含有NmrA-樣家族結(jié)構(gòu)域的1 (NMRLl)、 及其翻譯后同種型、熱休克蛋白8(HSP8)、!^scin同源物1，肌動(dòng)蛋白集束蛋白(Fscnl)JS 不均一核糖核蛋白A/B同種型2 (hnRNP)。
14.權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述細(xì)胞樣品包括胚胎干細(xì)胞，特別是人類胚胎干細(xì)胞。
15.權(quán)利要求13的試劑盒，還包括用于確定至少一種另外的蛋白生物標(biāo)志物的工具， 所述另外的蛋白生物標(biāo)志物選自熱休克蛋白8(HSP8)、FaSCin同源物1，肌動(dòng)蛋白集束蛋白 (Fscnl)、核不均一核糖核蛋白A/B同種型2(hnRNP)。
全文摘要
目前化學(xué)物質(zhì)的毒理學(xué)檢測(cè)主要是在體內(nèi)完成的，其使用多種動(dòng)物物種并且考慮人類臨床、生物化學(xué)、病理學(xué)和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。在過(guò)去數(shù)年中，越來(lái)越清楚地發(fā)現(xiàn)，某些物質(zhì)對(duì)于兒童的危害性特別高，因此，發(fā)育中的人類大腦的特定易攻擊點(diǎn)是研究焦點(diǎn)。同時(shí)，推薦對(duì)具有已知的神經(jīng)毒性或致畸(特別是神經(jīng)致畸)風(fēng)險(xiǎn)的物質(zhì)進(jìn)行額外的胚胎毒性測(cè)試。此外，美國(guó)環(huán)保局(EPA)要求對(duì)殺蟲劑進(jìn)行胚胎毒性測(cè)試。如果某物質(zhì)用作藥物，則要求進(jìn)行另外的測(cè)試(S7A SafetyPharmacology Studies for Human Pharmaceuticals，Guidelines of theInternational Conference on Harmonization，ICH，2001)。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102089658SQ200980126483
公開日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月4日
發(fā)明者A·施拉藤霍爾茨 申請(qǐng)人:普羅迪奧塞斯股份公司