專利名稱：：紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：高山紅景天(RhodiolasachalinensisA.Bor)又叫庫頁紅景天，為景天科(Crassulaceae)紅景天屬(RhodiolaL.)多年生草本或亞灌木植物，是一種瀕危珍稀藥用植物，也是一種很有發(fā)展前途的環(huán)境適應(yīng)性藥物。我國已有悠久的紅景天應(yīng)用歷史。20世紀(jì)60年代起，紅景天開始得到前蘇聯(lián)科學(xué)家的極大重視，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅景天具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗輻射等功效，是一種具有良好發(fā)展前途的環(huán)境適應(yīng)性藥物。目前紅景天由于其自然生存環(huán)境惡劣，生長緩慢且年產(chǎn)量低，加上紅景天需求量的日益增大，使得原本就稀少的野生資源受到了前所未有的威脅。大量無限制的開發(fā)利用將使得紅景天這一瀕稀藥用植物物種近于滅絕，紅景天產(chǎn)區(qū)的生態(tài)環(huán)境不斷惡化。目前高山紅景天的細(xì)胞培養(yǎng)主要集中在愈傷組織誘導(dǎo)、基本培養(yǎng)條件篩選和理化因子的考查等方面，還沒有非生物誘導(dǎo)子對紅景天苷生物合成的調(diào)控以及代謝途徑關(guān)鍵酶做系統(tǒng)研究。國內(nèi)外已上市的紅景天類保健品及藥品均為天然提取的紅景天制劑，由于其具有很高的藥用價(jià)值，深受患者喜愛。然而由于其成分復(fù)雜，有效成分含量低，大大影響了該藥的臨床療效以及市場的進(jìn)一步擴(kuò)大。特別是天然紅景天已作為瀕臨滅絕的植物種受到世界以及我國政府的重點(diǎn)保護(hù)，嚴(yán)禁采摘。為此研究紅景天的替代產(chǎn)品，特別是如何提高紅景天中紅景天苷的含量顯得十分重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種繁殖速度快，紅景天苷含量高的紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無菌處理選擇68月份海拔2500m以上的野生高山紅景天新鮮植株，取其幼莖及葉片進(jìn)行清洗和無菌處理，制的0.30.5cm2大小的紅景天組織；b、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過無菌處理后的紅景天組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間124天，培養(yǎng)溫度1030。C，光照時(shí)間024小時(shí)/天，光照強(qiáng)度0100iimo1/m2s;所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖050g/L+瓊脂010g/L+a-萘乙酸0.15.Omg/L+6-節(jié)氨基嘌呤0.15.0mg/L+硝普鈉SNP1080iimol/L+硝酸銀AgN031080iimol/L，pH值為5.07.0;c、大規(guī)模培養(yǎng)選取經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的紫紅色愈傷組織，在大規(guī)模培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間1024天，培養(yǎng)溫度103(TC，光照時(shí)間024小時(shí)/天，光照強(qiáng)度03100iimol/m2s;所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖050g/L+瓊脂010g/L+a-萘乙酸0.15.Omg/L+6-節(jié)氨基嘌呤0.15.Omg/L+硝普鈉SNP1080iimol/L+硝酸銀AgN031080iimol/L，pH值為5.07.0。作為本發(fā)明紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法更優(yōu)化的技術(shù)方案，對培養(yǎng)基的配方比例和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化選擇。所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間1020天，培養(yǎng)溫度2025。C，光照時(shí)間816小時(shí)/天，光照強(qiáng)度5080iimol/m2*s;基本培養(yǎng)基MS+蔗糖2030g/L+瓊脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-節(jié)氨基嘌呤2.03.0mg/L+硝普鈉SNP4060iimol/L+硝酸銀AgN034060iimol/L，pH值為5.56.5;所述的大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間1220天，培養(yǎng)溫度2025。C，光照時(shí)間816小時(shí)/天，光照強(qiáng)度5080iimol/m2s;基本培養(yǎng)基MS+蔗糖2030g/L+瓊脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-芐氨基嘌呤2.03.Omg/L+硝普鈉SNP4060iimo1/L+硝酸銀AgN034060iimol/L，pH值為5.56.5。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入非生物誘導(dǎo)子是本發(fā)明的重點(diǎn)內(nèi)容，其中所述的非生物誘導(dǎo)子包括硝普鈉SNP和硝酸銀AgN03。非生物誘導(dǎo)子硝普鈉SNP和硝酸銀AgN03的制備方法是將硝普鈉SNP用二甲基亞砜匿SO溶解，經(jīng)0.22m濾膜過濾制的一氧化氮NO的供體；將AgN03用蒸餾水溶解經(jīng)0.22iim濾膜過濾制的AgN03誘導(dǎo)子。非生物誘導(dǎo)子可以直接加入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，也可以在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)過程的不同時(shí)期添加到培養(yǎng)基中。植物體的的無菌處理是本發(fā)明的技術(shù)環(huán)節(jié)，無菌處理的方法包括如下步驟a)將選取的植物體用水清洗泥土，再浸泡于蒸餾水中；b)將清洗的植物體用7080%的酒精浸泡1020秒進(jìn)行表面滅菌；c)將經(jīng)過酒精滅菌的植物體置于0.050.2%氯化汞溶液中浸泡36分鐘，浸泡過程中不斷輕輕攪拌使植物體表面充分接觸到氯化汞溶液；d)將經(jīng)過氯化汞溶液浸泡滅菌的植物體用高溫滅菌處理的蒸餾水漂洗36遍，將植物體表面粘附的氯化汞溶液漂洗干凈，再將植物體用無菌濾紙吸干水分；e)用無菌剪刀將葉片剪成0.30.5cm2大小，無菌條件下，將上述表面滅菌處理的材料，每瓶接種5塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于該方法易操作，有效成分含量高，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，可以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)。用本發(fā)明方法培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紅景天苷，不變性、含量高、成本低、周期短、極具市場競爭力。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:一種紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無菌處理a)選擇7月份海拔2500m以上的野生高山紅景天新鮮植株，用水清洗泥土，再浸泡于蒸餾水中，置于超凈工作臺內(nèi)待用；b)將清洗的植物體取出放入無菌空瓶，用75%的酒精浸泡15秒進(jìn)行表面滅菌；c)將經(jīng)過酒精滅菌的植物體置于0.1%氯化汞溶液中浸泡5分鐘，浸泡過程中不斷輕輕攪拌使植物體表面充分接觸到氯化汞溶液；d)將經(jīng)過氯化汞溶液浸泡滅菌的植物體用高溫滅菌處理的蒸餾水漂洗5遍，將植物體表面粘附的氯化汞溶液漂洗干凈，再將植物體用無菌濾紙吸干水分；e)用無菌剪刀將葉片剪成O.30.5cm2大小，無菌條件下，將上述表面滅菌處理的材料，每瓶接種5塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；b、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過無菌處理后的紅景天組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間12天，培養(yǎng)溫度22t:，光照時(shí)間6小時(shí)/天，光照強(qiáng)度50mol/m2s;所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖18g/L+瓊脂5g/L+a-萘乙酸3mg/L+6_芐氨基嘌呤3mg/L+石肖普納SNP20iimol/L+石肖酸銀AgN0330iimol/L，pH值為6;其中，硝普鈉SNP和硝酸銀AgN03是非生物誘導(dǎo)子，非生物誘導(dǎo)子的制備方法是將硝普鈉SNP用二甲基亞砜匿SO溶解，經(jīng)0.22m濾膜過濾制的一氧化氮NO的供體，將AgN03用蒸餾水溶解經(jīng)0.22m濾膜過濾制的AgN03誘導(dǎo)子；將制得的兩種非生物誘導(dǎo)子直接加入到滅菌后的培養(yǎng)基中；c、大規(guī)模培養(yǎng)選取經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的紫紅色愈傷組織，在大規(guī)模培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間18天，培養(yǎng)溫度22t:，光照時(shí)間6小時(shí)/天，光照強(qiáng)度40iimol/m2s;所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖15g/L+瓊脂4.5g/L+a-萘乙酸3!^/1+6-芐氨基嘌呤4mg/L+硝普鈉SNP40iimol/L+硝酸銀AgN0350iimol/L，pH值為6。實(shí)施例2:—種紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無菌處理a)選擇8月份海拔2500m以上的野生高山紅景天新鮮植株，用水清洗泥土，再浸泡于蒸餾水中，置于超凈工作臺內(nèi)待用；b)將清洗的植物體取出放入無菌空瓶，用75%酒精中浸泡15秒進(jìn)行表面滅菌；c)將經(jīng)過酒精滅菌的植物體置于0.1%氯化汞溶液中浸泡5分鐘，浸泡過程中不斷輕輕攪拌使植物體表面充分接觸到氯化汞溶液；d)將經(jīng)過氯化汞溶液浸泡滅菌的植物體用高溫滅菌處理的蒸餾水漂洗5遍，將植物體表面粘附的氯化汞溶液漂洗干凈，再將植物體用無菌濾紙吸干水分；e)用無菌剪刀將葉片剪成O.30.5cm2大小，無菌條件下，將上述表面滅菌處理的材料，每瓶接種5塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；b、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過無菌處理后的紅景天組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間8天，培養(yǎng)溫度2(TC，光照時(shí)間8小時(shí)/天，光照強(qiáng)度40Pmol/m2S;所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖20g/L+瓊脂4.5g/L+a-萘乙酸2mg/L+6_芐氨基嘌呤2mg/L+石肖普納SNP30iimol/L+石肖酸銀AgN0340iimol/L，pH值為6;其中，硝普鈉SNP和硝酸銀AgN03是非生物誘導(dǎo)子，非生物誘導(dǎo)子的制備方法是將硝普鈉SNP用二甲基亞砜匿SO溶解，經(jīng)0.22m濾膜過濾制的一氧化氮NO的供體，在第6天加入到培養(yǎng)基中；將AgN03用蒸餾水溶解經(jīng)0.22m濾膜過濾制的AgN03誘導(dǎo)子，在第7天加入到培養(yǎng)基中；c、大規(guī)模培養(yǎng)選取經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的紫紅色愈傷組織，在大規(guī)模培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間20天，培養(yǎng)溫度23°C，光照時(shí)間8小時(shí)/天，光照強(qiáng)度50mol/m2s;所述的5大規(guī)模培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖20g/L+瓊脂4g/L+a-萘乙酸4!^/1+6-芐氨基嘌呤3mg/L+石肖普納SNP45iimol/L+石肖酸銀AgN0355iimol/L，pH值為6。實(shí)施例3:對野生紅景天、實(shí)施例1和實(shí)施例2培養(yǎng)得到的愈傷組織進(jìn)行檢測。運(yùn)用HPLC色譜檢測法在色譜柱為DiamonsilODSC-18烷基硅膠柱、流動(dòng)相為4.6mmX250mm、甲醇水為1:2035:100、紫外檢測波長為275nm、柱溫為104(TC、進(jìn)樣量為15y1、流速為0.12.0m1/分鐘的條件下檢測紅景天苷的含量。檢測方法包括如下步驟a)紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品購自遼寧省藥檢所(編號110818)。精密稱取紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品5.Omg于10ml容量瓶中，流動(dòng)相溶解，配成0.5mg/L的對照品儲備液；b)紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取上述儲備液O.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.OOml置于5ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，取稀釋液各5iU進(jìn)樣。以紅景天苷濃度(C)對峰面積(A)做線性回歸?；貧w方程為C=AX7X10-7+0.004，R2=0.9993;c)紅景天苷含量檢測干燥至恒重的細(xì)胞粉末，過三號篩(50目)后，稱取0.lg，用10ml蒸餾水浸提24小時(shí)，超聲30分鐘，4000rpm離心15分鐘，移出上清，濾渣再加10ml蒸餾水超聲30分鐘，4000rpm離心15分鐘，移出上清，將兩次上清合并，定容至25ml。從中取10ml提取液于6(TC下蒸干水分，再用2ml流動(dòng)相溶解，過O.45Pm濾膜后，再用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行含量測定。所得供試品分別于0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、7小時(shí)進(jìn)樣，讀取峰面積，計(jì)算RSD。通過代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品紅景天苷的含量。表一不同形態(tài)愈傷細(xì)胞生長和紅景天苷含量比較接種量愈傷組織鮮比生長速率紅景天苷含量愈傷組織形態(tài)，(gFW/瓶)重(g/瓶)(cT1)(mg/g)綠色松軟1.02.610.0642.02紫紅色致密1.03.570.0858.81黃色松軟1.02.920.0711.25由表一可知本方法培育出的紅景天不同形態(tài)愈傷細(xì)胞生長量和紅景天苷含量紫紅色致密的愈傷組織最好。表二野生高山紅景天與高山紅景天培養(yǎng)物兩個(gè)實(shí)施例樣品中紅景天苷產(chǎn)量的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表二可知本方法培育出的紅景天的紅景天苷含量明顯高于野生高山紅景天c權(quán)利要求一種紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無菌處理選擇6～8月份海拔2500m以上的野生高山紅景天新鮮植株，取其幼莖及葉片進(jìn)行清洗和無菌處理，制的0.3～0.5cm2大小的紅景天組織；b、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過無菌處理后的紅景天組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間1～24天，培養(yǎng)溫度10～30℃，光照時(shí)間0～24小時(shí)/天，光照強(qiáng)度0～100μmol/m2·s；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖0～50g/L+瓊脂0～10g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-芐氨基嘌呤0.1～5.0mg/L+硝普鈉SNP10～80μmol/L+硝酸銀AgNO310～80μmol/L，pH值為5.0～7.0；c、大規(guī)模培養(yǎng)選取經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的紫紅色愈傷組織，在大規(guī)模培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間10～24天，培養(yǎng)溫度10～30℃，光照時(shí)間0～24小時(shí)/天，光照強(qiáng)度0～100μmol/m2·s；所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖0～50g/L+瓊脂0～10g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-芐氨基嘌呤0.1～5.0mg/L+硝普鈉SNP10～80μmol/L+硝酸銀AgNO310～80μmol/L，pH值為5.0～7.0。2.按照權(quán)利要求1所述的紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間1020天，培養(yǎng)溫度2025。C，光照時(shí)間816小時(shí)/天，光照強(qiáng)度5080iimol/m2*s;基本培養(yǎng)基MS+蔗糖2030g/L+瓊脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-節(jié)氨基嘌呤2.03.0mg/L+硝普鈉SNP4060iimol/L+硝酸銀AgN034060iimol/L，pH值為5.56.5;所述的大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間1220天，培養(yǎng)溫度2025°C，光照時(shí)間816小時(shí)/天，光照強(qiáng)度5080iimol/m2s;基本培養(yǎng)基MS+蔗糖2030g/L+瓊脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-節(jié)氨基嘌呤2.03.0mg/L+硝普鈉SNP1080iimol/L+石肖酸銀AgN031080iimol/L，pH值為5.56.5。3.按照權(quán)利要求1或2所述的紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法，其特征在于非生物誘導(dǎo)子硝普鈉SNP和硝酸銀AgN03的制備方法是將硝普鈉SNP用二甲基亞砜匿S0溶解，經(jīng)0.22iim濾膜過濾制的一氧化氮NO的供體；將AgN03用蒸餾水溶解經(jīng)0.22ym濾膜過濾制的Ag冊3誘導(dǎo)子。4.按照權(quán)利要求1或2所述的紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法，其特征在于植物體的無菌處理方法包括如下步驟a)將選取的植物體用水清洗泥土，再浸泡于蒸餾水中；b)將清洗的植物體用7080%的酒精浸泡1020秒進(jìn)行表面滅菌；c)將經(jīng)過酒精滅菌的植物體置于0.050.2%氯化滎溶液中浸泡36分鐘，浸泡過程中不斷輕輕攪拌使植物體表面充分接觸到氯化汞溶液；d)將經(jīng)過氯化汞溶液浸泡滅菌的植物體用高溫滅菌處理的蒸餾水漂洗36遍，將植物體表面粘附的氯化汞溶液漂洗干凈，再將植物體用無菌濾紙吸干水分；e)用無菌剪刀將葉片剪成0.30.5cm2大小，無菌條件下，將上述表面滅菌處理的材料，每瓶接種5塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。全文摘要本發(fā)明公開了一種紅景天愈傷組織培養(yǎng)方法，它包括如下步驟植物體的選擇及無菌處理、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)和大規(guī)模培養(yǎng)三個(gè)環(huán)節(jié)，其核心技術(shù)是愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，是在基本培養(yǎng)基MS+蔗糖0～50g/L+瓊脂0～10g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-芐氨基嘌呤0.1～5.0mg/L的基礎(chǔ)上，加入非生物誘導(dǎo)子硝普鈉SNP和硝酸銀AgNO3，其中硝普鈉SNP10～80μmol/L+硝酸銀AgNO310～80μmol/L。該方法易操作，有效成分含量高，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，可達(dá)到產(chǎn)業(yè)化水平。用本發(fā)明方法培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紅景天苷，不變性、含量高、成本低、周期短、極具市場競爭力。文檔編號A01H4/00GK101773070SQ20101000076公開日2010年7月14日申請日期2010年1月19日優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日發(fā)明者賈景明申請人:煙臺匯鵬生物科技有限公司