專利名稱：一種以山葵根為外植體的山葵愈傷組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種山葵植物的組織培養(yǎng)方法，特別是涉及一種以山葵根為外植體的山葵愈傷組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
山葵(WasabijaponicaMatsum)又名山箭菜、山菜,為十字花科山箭菜屬多年生半陰生草本植物。山葵植物中含有一種芥子苷類的物質(zhì)，在植物體被磨碎時，該物質(zhì)在芥子苷酶的作用下水解形成異硫氰酸酯類化合物，其中尤以丙烯基異硫氰酸酯含量最高，約占89% 94% ;另外，山葵植物還含有大量的氨基酸和各種人體需要的微量元素。由于山葵含有豐富 的異硫氰酸酯類化合物和大量的人體需要的氨基酸和微量元素，因此山葵不僅具有強烈的辛辣味和特殊的香辛味，而且還具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗癌、抗氧化、抗血小板聚集等多種作用，是國際上公認的極為稀缺及珍貴的藥食同源植物，被稱為“綠色黃金”。隨著世界各地山葵消費市場的不斷擴大，山葵產(chǎn)品供不應(yīng)求，市場需求量越來越大。但由于山葵植物的生長發(fā)育對環(huán)境要求極為苛刻，僅適于在海拔高度為1000-2000米的高山地區(qū)種植，生育溫度超過30°C易發(fā)生軟腐病，但低于_3°C時又易受凍害；另外，山葵生長還要求有一些如山楊等適宜的伴生植物存在，并且一株山葵植物經(jīng)過18個月的栽種收獲的根莖一般不到200g。因此，靠自然生長的山葵產(chǎn)量較低，有必要通過組織培養(yǎng)的方式快速生產(chǎn)山葵植物，以滿足市場的需求。目前已有人對山葵植物的組織培養(yǎng)進行了研究，如王安虎的論文《山葵葉片愈傷組織誘導(dǎo)試驗》、張建佳的論文《山葵愈傷組織培養(yǎng)及其風味物質(zhì)的研究》和王健美的論文《山葵離體培養(yǎng)研究》等，但目前在山葵愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中所采用的外植體主要是山葵植物的葉、葉柄和芽，還未見以山葵根為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的報道。根據(jù)胡尚勤等人在《山葵中異硫氰酸酯的提取及其對流感病毒的作用》和王健美等人在《山葵組織培養(yǎng)及愈傷組織成分分析》的研究結(jié)果可知山葵植物的地下器官根和根莖中異硫氰酸酯的含量明顯高于地上部分的葉、葉柄和芽，因此以山葵根根為外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)，可獲得有效成分含量高的山葵培養(yǎng)物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一種以山葵根為外植體的山葵愈傷組織培養(yǎng)方法，該方法可成功誘導(dǎo)出有效成分含量高的愈傷組織，并能實現(xiàn)愈傷組織大規(guī)模的增殖生長。為達到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案由如下步驟構(gòu)成(I)外植體的處理取從山葵植株剪下的山葵根，用流水沖洗干凈后，放于濾紙上吸干表面水分，然后將其放在超凈工作臺上用濃度為O. 19Γ0. 15%的升汞消毒5lmin，再用無菌水沖洗2飛次后用已滅菌的濾紙吸干表面的水分；(2)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)將已消毒的山葵根切為l-2cm的長度，然后接入愈傷組織培養(yǎng)基 MS+6-BA0. 5 4. Omg · L 1+2, 4-D1. O 6. Omg · L ^IAAO. 5 3. Omg · L 1 中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度10 28°C，每天光照4 10小時，光照強度為600 12001x ；(3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將步驟(2)制得的愈傷組織轉(zhuǎn)接入愈傷組織增殖培養(yǎng)基 l/2MS+6-BA(Tl. Omg · 1^+2，4-D I. 0 4· Omg · Ι^+ΚΤΟ. 5 I. Omg · Γ1+ 硫代硫酸鈉
O.5^4. Og · Γ1中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度10 28°C，每天光照6 12小時、光照強度為800 15001x ；上述所有培養(yǎng)基的pH值為5. 6 6. 5、蔗糖15 30g .L-1、瓊脂5. O 6. Og .L-1。上述步驟(3)中所述愈傷組織為顏色為黃綠色的愈傷組織。本發(fā)明以山葵植物根為外植體培養(yǎng)出的愈傷組織有效成分含量高，采用有效成分含量高的山葵培養(yǎng)物制得的下游產(chǎn)品其功效性更強，口感也更好。
本發(fā)明方法具有生長周期短，繁殖率高等優(yōu)點，并能有效擺脫災(zāi)害性氣候?qū)ι娇参锷L的不利影響，使山葵植物可進行周年培養(yǎng)生產(chǎn)，從而能有效解決山葵植物資源短缺問題，滿足市場對山葵產(chǎn)品的需求。
具體實施例方式實施例I(I)外植體的處理取無染菌、生長健康的山葵植株，剪下其根，將山葵根用流水沖洗干凈后，放于濾紙上吸干表面水分，然后將其放在超凈工作臺上用濃度為O. 1%的升汞消毒7min,再用無菌水沖洗5次后用已滅菌的濾紙吸干表面的水分；(2)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)將已消毒的山葵根切為I. 5cm的長度，然后以平放方式(不插入培養(yǎng)基、平放在培養(yǎng)基表面)接入愈傷組織培養(yǎng)基MS+6-BA1. Omg -L^+2, 4-D4. Omg ·Γ1+ΙΑΑ2. Omg -Γ1中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度18°C，每天光照8小時，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計其愈傷組織誘導(dǎo)率為92% ;觀察到愈傷組織最先產(chǎn)生于根兩端的切口處，先是產(chǎn)生黃綠色的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間的增長，還可產(chǎn)生黃白色的愈傷組織；(3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)選取步驟(2)制得的顏色為黃綠色的愈傷組織轉(zhuǎn)接入愈傷組織增殖培養(yǎng)基 1/2MS+6-BA0. 5mg · L_1+2, 4-D3. Omg · Γ'+ΚΤΟ. 5mg · Γ1+ 硫代硫酸鈉
2.Og-Γ1中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度18°C，每天光照10小時、光照強度為12001x，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計愈傷組織可增殖2. 34倍；上述所有培養(yǎng)基的pH值為6. O、蔗糖25g · L'瓊脂5. 5g · L'實施例2(I)外植體的處理取無染菌、生長健康的山葵植株，剪下其根，將山葵根用流水沖洗干凈后，放于濾紙上吸干表面水分，然后將其放在超凈工作臺上用濃度為0. 1%的升汞消毒8min,再用無菌水沖洗5次后用已滅菌的濾紙吸干表面的水分；(2)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)將已消毒的山葵根切為2cm的長度，然后以插入方式接入愈傷組織培養(yǎng)基MS+6-BA3. Omg · L_1+2, 4-D2. Omg · Γ'+ΙΑΑΙ. Omg · Γ1中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25°C，每天光照6小時，光照強度為15001x，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計其愈傷組織誘導(dǎo)率為87%，觀察到愈傷組織主要產(chǎn)生于根切口處的游離端；(3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)選取步驟(2)制得的顏色為黃綠色的愈傷組織轉(zhuǎn)接入愈傷組織增殖培養(yǎng)基 1/2MS+6-BA1. Omg · L^+2, 4-D I. 5mg · Γ'+ΚΤΟ. 5mg · L—1+ 硫代硫酸鈉3.Sg-T1中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25°C，每天光照10小時、光照強度為12001x，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計愈傷組織可增殖2. 15倍；上述所有培養(yǎng)基的pH值為6. O、蔗糖25g · L_\瓊脂5. 5g · L'實施例3(I)外植體的處理取無染菌、生長健康的山葵植株，剪下其根，將山葵根用流水沖洗干凈后，放于濾紙上吸干表面水分，然后將其放在超凈工作臺上用濃度為O. 15%的升汞消毒5min，再用無菌水沖洗4次后用已滅菌的濾紙吸干表面的水分；(2)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)將已消毒的山葵根切為I. 5cm的長度，然后以平放方式接入愈傷組織培養(yǎng)基MS+6-BA1. 5mg · L_1+2, 4-D5. Omg · L_1+IAA2. 5mg · Γ1中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 溫度20°C，每天光照10小時，光照強度為ΙΟΟΟΙχ，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計其愈傷組織誘導(dǎo)率為90% ；
(3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將步驟(2)制得的愈傷組織轉(zhuǎn)接入愈傷組織增殖培養(yǎng)基1/2MS+2, 4-D3. Omg · Γ'+ΚΤΟ. 8mg · Γ1+硫代硫酸鈉2. 5g · Γ1中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20°C，每天光照10小時、光照強度為12001x，培養(yǎng)30天后統(tǒng)計愈傷組織可增殖
I.96 倍；上述所有培養(yǎng)基的pH值為6. 5、蔗糖25g · L—1、瓊脂5. 5g · L—1。比較實施例將實施例I步驟(3)中的愈傷組織增殖培養(yǎng)基中的硫代硫酸鈉去掉，改為1/2MS+6-BAO. 5mg ·Ι^+2，4-D3. Omg Γ'+ΚΤΟ. 5mg .171,其它步驟同實施例1，在培養(yǎng)30天后愈傷組織增殖I. 74倍，并且增殖的愈傷組織出現(xiàn)了較嚴重的褐變，由此說明適當濃度的硫代硫酸鈉可有效提高其愈傷組織的增殖倍數(shù)，并能有效抑制山葵愈傷組織產(chǎn)生褐變。
權(quán)利要求
1.一種以山葵根為外植體的山葵愈傷組織培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟 (1)外植體的處理取從山葵植株剪下的山葵根，用流水沖洗干凈后，放于濾紙上吸干表面水分，然后將其放在超凈工作臺上用濃度為O. I 9Γ0. 15%的升汞消毒5 8 min，再用無菌水沖洗2飛次后用已滅菌的濾紙吸干表面的水分； (2)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)將已消毒的山葵根切為l-2cm的長度，然后接入愈傷組織培養(yǎng)基 MS+6-BA0. 5 4. O mg · L l+2, 4-D I. O 6· O mg · L :+IAA 0. 5 3. O mg · L 1 中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度10 28°C，每天光照4 10小時，光照強度為600 1200Ix ； (3)愈傷組織的增殖培養(yǎng)將步驟(2)制得的愈傷組織轉(zhuǎn)接入愈傷組織增殖培養(yǎng)基1/2MS+6-BA (Tl. O mg · L-1 +2，4-D I. 0 4· O mg · L_1+KT 0. 5 I. 0 mg · L-1+ 硫代硫酸鈉0.5^4. 0 g-Γ1中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度10 28°C，每天光照6 12小時、光照強度為800 1500 Ix ； 上述所有培養(yǎng)基的PH值為5. 6 6. 5、蔗糖15 30 g · L—1、瓊脂5. O 6. O g · L—1。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種以山葵根為外植體的山葵愈傷組織培養(yǎng)方法,其特征在于步驟(3)中所述愈傷組織為顏色為黃綠色的愈傷組織。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以山葵根為外植體的山葵愈傷組織培養(yǎng)方法，該方法通過將山葵根作為外植體接入愈傷組織培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出了有效成分含量高的山葵愈傷組織，從而可有效解決山葵植物資源短缺問題，滿足市場對山葵產(chǎn)品的需求，也使所制得的山葵下游產(chǎn)品其功效性更強，口感更好。
文檔編號A01H4/00GK102823491SQ201210277158
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者王躍華, 任三軍, 趙鋼, 孫雁霞, 劉洪明, 李亞梅, 李琴, 馮玉藝, 任強 申請人:成都大學