專(zhuān)利名稱(chēng)：：天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：天山雪蓮(SaussureainvolucrateKar.etKir.)屬被子植物門(mén)、雙子葉植物綱、菊目、菊科、菜薊族、鳳毛菊屬植物。早在八世紀(jì)藏族古代藥物文獻(xiàn)《月王藥診》中就有雪蓮的記載，后來(lái)在《西北域記》、《晶珠本草》、《蘭琉璃》、《本草綱目拾遺》等書(shū)目中均有記載。主要分布于我國(guó)新疆、青海、甘肅、云南和西藏等高寒地區(qū)，海拔24004100m雪線附近的巖石縫和懸崖峭壁之間，國(guó)外少有分布。雪蓮性溫，味微苦，入肝、脾、腎三經(jīng)，全草入藥，具有清熱解毒、活血化淤、抗炎鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)除濕、補(bǔ)腎壯陽(yáng)、調(diào)經(jīng)止血、收縮子宮等功能。天山雪蓮被新疆維吾爾族、哈薩克等少數(shù)民族譽(yù)為"西域奇花"和"百草之王"，它是我國(guó)珍稀名貴的民族藥材，已經(jīng)被列為國(guó)家珍稀瀕危二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。天山雪蓮含有豐富的生物活性成分、營(yíng)養(yǎng)成分和礦質(zhì)元素，藥用與食用價(jià)值非常高。近10年來(lái)，開(kāi)發(fā)利用天山雪蓮制成滋補(bǔ)品的熱潮一浪高過(guò)一浪，由雪蓮制成的藥品和保健品等產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外有著巨大的市場(chǎng)前景。但由于其特異的生長(zhǎng)環(huán)境，野生天山雪蓮生長(zhǎng)緩慢，由種子萌發(fā)到開(kāi)花結(jié)果需56年的時(shí)間，且種子的繁殖率很低，野生資源嚴(yán)重受限，再加上肆意盜采，使得野生天山雪蓮瀕臨滅絕。組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是解決天山雪蓮藥用資源的有效手段。國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了對(duì)野生天山雪蓮全面的研究，包括化學(xué)成分，藥理活性，人工種植等方面的研究。而天山雪蓮的細(xì)胞培養(yǎng)主要集中在愈傷組織誘導(dǎo)、基本培養(yǎng)條件篩選和理化因子的考查等方面。目前還沒(méi)有非生物誘導(dǎo)子對(duì)天山雪蓮培養(yǎng)物中紫丁香甘成分生物合成的調(diào)控做系統(tǒng)研究。天然天山雪蓮已作為瀕臨滅絕的植物種受到世界以及我國(guó)政府的重點(diǎn)保護(hù)，嚴(yán)禁采摘。為此研究天山雪蓮的替代產(chǎn)品，特別是如何提高天山雪蓮中紫丁香甘的含量顯得十分重要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種繁殖速度快，紫丁香苷量高的天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無(wú)菌處理選擇68月份海拔35004000m以上的野生天山雪蓮新鮮植株，取其幼莖及葉片進(jìn)行清洗和無(wú)菌處理，制的0.30.5cm2大小的天山雪蓮組織；b、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理后的天山雪蓮組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間124天，培養(yǎng)溫度1530°C，光照時(shí)間124小時(shí)/天，光照強(qiáng)度0100iimol/m2s;所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖050g/L+瓊脂010g/L+a-萘乙酸0.15.Omg/L+6-節(jié)氨基嘌呤0.15.Omg/L，pH值為5.07.0;c、大規(guī)模培養(yǎng)選取經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的紫綠色愈傷組織，在大規(guī)模培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間1024天，培養(yǎng)溫度103(TC，光照時(shí)間024小時(shí)/天，光照強(qiáng)度0100iimol/m2s;所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖050g/L+瓊脂010g/L+a-萘乙酸0.15.Omg/L+6-節(jié)氨基嘌呤O.15.Omg/L，pH值為5.07.0;在大規(guī)模培養(yǎng)的020天內(nèi)往大規(guī)模培養(yǎng)基中加入非生物誘導(dǎo)子硝普鈉(SNP)、茉莉酸甲酯(MJ)和水楊酸(SA)，其中，SNP10100iimol/L+MJ10100iimol/L+SA10100iimol/L。作為本發(fā)明天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)方法更優(yōu)化的技術(shù)方案，對(duì)培養(yǎng)基的配方比例和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化選擇。所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間1520天，培養(yǎng)溫度2025。C，光照時(shí)間820小時(shí)/天，光照強(qiáng)度6080iimol/m2s;基本培養(yǎng)基MS+蔗糖2030g/L+瓊脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-節(jié)氨基嘌呤2.03.Omg/L，pH值為5.56.5;所述的大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間1520天，培養(yǎng)溫度2025。C，光照時(shí)間820小時(shí)/天，光照強(qiáng)度6080iimol/m2s;基本培養(yǎng)基MS+蔗糖2030g/L+瓊脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-芐氨基嘌呤2.03.Omg/L;在大規(guī)模培養(yǎng)的020天內(nèi)往培養(yǎng)基中加入非生物誘導(dǎo)子，SNP4060iimol/L+MJ4060iimol/L+SA4060iimo1/L。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入非生物誘導(dǎo)子是本發(fā)明的重點(diǎn)內(nèi)容，其中所述的非生物誘導(dǎo)子包括SNP、MJ和SA，非生物誘導(dǎo)子的制備方法是將SNP用二甲基亞砜匿SO溶解，經(jīng)0.22iim濾膜過(guò)濾制的一氧化氮NO的供體；將MJ和SA用蒸餾水溶解經(jīng)0.22ym濾膜過(guò)濾制的MJ和SA誘導(dǎo)子。非生物誘導(dǎo)子可以直接加入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，也可以在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程的不同時(shí)期添加到培養(yǎng)基中。植物體的的無(wú)菌處理是本發(fā)明的技術(shù)環(huán)節(jié)，無(wú)菌處理的方法包括如下步驟a)將選取的幼莖及葉片用水清洗泥土，再浸泡于蒸餾水中；b)將清洗的幼莖及葉片用7080%的酒精浸泡1020秒進(jìn)行表面滅菌；c)將經(jīng)過(guò)酒精滅菌的幼莖及葉片置于0.050.2%氯化汞溶液中浸泡36分鐘，浸泡過(guò)程中不斷輕輕攪拌使植物體表面充分接觸到氯化汞溶液；d)將經(jīng)過(guò)氯化汞溶液浸泡滅菌的植物體用高溫滅菌處理的蒸餾水漂洗36遍，將植物體表面粘附的氯化汞溶液漂洗干凈，再將植物體用無(wú)菌濾紙吸干水分；e)用無(wú)菌剪刀將幼莖及葉片剪成0.30.5cm2大小，無(wú)菌條件下，將上述表面滅菌處理的材料，每瓶5塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于該方法容易操作，有效成分紫丁香甘含量高，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，可以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)。用本發(fā)明方法培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)天山雪蓮，不變性、含量高、成本低、周期短、極具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1:一種天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無(wú)菌處理a)選擇7月份海拔3500m以上的野生天山雪蓮新鮮植株的幼莖及葉片用水清洗泥土，再浸泡于蒸餾水中；b)將清洗的幼莖及葉片用75%的酒精浸泡15秒進(jìn)行表面滅菌；c)將經(jīng)過(guò)酒精滅菌的幼莖及葉片置于O.1%氯化汞溶液中浸泡5分鐘，浸泡過(guò)程中不斷輕輕攪拌使植物體表面充分接觸到氯化汞溶液；d)將經(jīng)過(guò)氯化汞溶液浸泡滅菌的植物體用高溫滅菌處理的蒸餾水漂洗5遍，將植物體表面粘附的氯化汞溶液漂洗干凈，再將植物體用無(wú)菌濾紙吸干水分；e)用無(wú)菌剪刀將幼莖及葉片剪成O.30.5cm2大小，無(wú)菌條件下，將上述表面滅菌處理的材料，每瓶接種5塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。b、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理后的天山雪蓮組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間16天，培養(yǎng)溫度22t:，光照時(shí)間8小時(shí)/天，光照強(qiáng)度60iimol/m2s;所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L+a-萘乙酸3mg/L+6_芐氨基嘌呤2mg/L，pH值為6.0;c、大規(guī)模培養(yǎng)選取經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的紫綠色愈傷組織，在大規(guī)模培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間20天，培養(yǎng)溫度22t:，光照時(shí)間10小時(shí)/天，光照強(qiáng)度60iimol/m2s;所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖30g/L+瓊脂4.5g/L+a-萘乙酸3mg/L+6_芐氨基嘌呤2mg/L，pH值為5.0;在大規(guī)模培養(yǎng)的第6天往大規(guī)模培養(yǎng)基中加入SNP50ymol/L，在大規(guī)模培養(yǎng)的第10天往培養(yǎng)基中加入MJ50iimol/L和SA45ymol/L。實(shí)施例2:—種天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無(wú)菌處理a)選擇8月份海拔3800m以上的野生天山雪蓮新鮮植株的幼莖及葉片用水清洗泥土，再浸泡于蒸餾水中；b)將清洗的幼莖及葉片用78%的酒精浸泡12秒進(jìn)行表面滅菌；c)將經(jīng)過(guò)酒精滅菌的幼莖及葉片置于0.12%氯化滎溶液中浸泡4分鐘，浸泡過(guò)程中不斷輕輕攪拌使植物體表面充分接觸到氯化汞溶液；d)將經(jīng)過(guò)氯化汞溶液浸泡滅菌的植物體用高溫滅菌處理的蒸餾水漂洗5遍，將植物體表面粘附的氯化汞溶液漂洗干凈，再將植物體用無(wú)菌濾紙吸干水分；e)用無(wú)菌剪刀將幼莖及葉片剪成O.30.5cm2大小，無(wú)菌條件下，將上述表面滅菌處理的材料，每瓶接種5塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。b、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理后的天山雪蓮組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間20天，培養(yǎng)溫度2(TC，光照時(shí)間12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度80iimol/m2s;所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖28g/L+瓊脂4.5g/L+a-萘乙酸2mg/L+6_芐氨基嘌呤3mg/L，pH值為6.0;c、大規(guī)模培養(yǎng)選取經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的紫綠色愈傷組織，在大規(guī)模培養(yǎng)基中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間18天，培養(yǎng)溫度23t:，光照時(shí)間8小時(shí)/天，光照強(qiáng)度80iimol/m2s;所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖20g/L+瓊脂5g/L+a-萘乙酸2mg/L+6_芐氨基嘌呤3mg/L，pH值為6.0;在滅菌后的大規(guī)模培養(yǎng)中直接加入非生物誘導(dǎo)子SNP40ymol/L、MJ50limol/L、SA55iimol/L。實(shí)施例3:對(duì)野生天山雪蓮、實(shí)施例1和實(shí)施例2培養(yǎng)得到的愈傷組織進(jìn)行檢測(cè)。運(yùn)用HPLC色譜檢測(cè)法在色譜柱為DiamonsilODSC-18烷基硅膠柱(4.6mmX250mm);流動(dòng)相甲醇-水(20:80);紫外檢測(cè)波長(zhǎng):262nm;柱溫:40。C;進(jìn)樣量:10;流速1.0ml/分鐘的條件下檢測(cè)紫丁香甘的含量。a)紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱(chēng)取紫丁香甘標(biāo)準(zhǔn)品2.9mg于10ml容量瓶中，流動(dòng)相溶解，配成290iigmL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。b)紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取上述儲(chǔ)備液0.05、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00ml置于5ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，取稀釋液各5進(jìn)樣。以峰面積(A)對(duì)紫丁香苷濃度(C)做線性回歸?；貧w方程為A=29274C+21998,R2=0.999。c)紫丁香苷含量檢測(cè)精密稱(chēng)取0.lg干燥至恒重過(guò)三號(hào)篩(50目)后的細(xì)胞粉末，置具賽試管中，精密加入甲醇lOml，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率250W，頻率33kHz)30分鐘，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減輕的重量，搖勻，離心，濾過(guò)，取續(xù)濾液，從中取10ml提取液于6(TC下蒸干水分，再用2ml流動(dòng)相溶解，過(guò)0.45m濾膜后，再用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行含量測(cè)定。所得供試品分別于0h、2h、4h、7h進(jìn)樣，讀取峰面積，計(jì)算RSD。通過(guò)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品紫丁香甘的含量，結(jié)果見(jiàn)表一。表一野生高山天山雪蓮與兩個(gè)實(shí)施例培養(yǎng)的愈傷組織樣品中紫丁香苷產(chǎn)量的比較品種紫丁香苷含量(mg/g)野生高山天山雪蓮0.57實(shí)施例l愈傷組織樣品10.46實(shí)施例2愈傷組織樣品10.48由表一可知本方法培育出的天山雪蓮愈傷組織的紫丁香苷含量明顯高于野生高山天山雪蓮。實(shí)施例4:對(duì)不同形態(tài)愈傷組織測(cè)量其鮮重，并采用實(shí)施例3的檢測(cè)方法，測(cè)定不同形態(tài)愈傷組織中紫丁香甘含量，結(jié)果見(jiàn)表二。表二不同形態(tài)愈傷細(xì)胞生長(zhǎng)和紫丁香甘含量比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表二可知本方法培育出的天山雪蓮不同形態(tài)愈傷細(xì)胞生長(zhǎng)量和紫丁香苷含量綠色致密的愈傷組織最好。權(quán)利要求一種天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無(wú)菌處理選擇6～8月份海拔3500～4000m以上的野生天山雪蓮新鮮植株，取其幼莖及葉片進(jìn)行清洗和無(wú)菌處理，制的0.3～0.5cm2大小的天山雪蓮組織；b、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)無(wú)菌處理后的天山雪蓮組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間1～24天，培養(yǎng)溫度15～30℃，光照時(shí)間1～24小時(shí)/天，光照強(qiáng)度0～100μmol/m2·s；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖0～50g/L+瓊脂0～10g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-芐氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值為5.0～7.0；c、大規(guī)模培養(yǎng)選取經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的紫綠色愈傷組織，在大規(guī)模培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間10～24天，培養(yǎng)溫度10～30℃，光照時(shí)間0～24小時(shí)/天，光照強(qiáng)度0～100μmol/m2·s；所述的大規(guī)模培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基MS+蔗糖0～50g/L+瓊脂0～10g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-芐氨基嘌呤0.1～5.0mg/L，pH值為5.0～7.0；在大規(guī)模培養(yǎng)的0～20天內(nèi)往培養(yǎng)基中加入非生物誘導(dǎo)子SNP、MJ和SA，其中，SNP10～100μmol/L+MJ10～100μmol/L+SA10～100μmol/L。2.按照權(quán)利要求1所述的天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)方法，其特征在于所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間1520天，培養(yǎng)溫度2025。C，光照時(shí)間820小時(shí)/天，光照強(qiáng)度6080iimol/m2s;基本培養(yǎng)基MS+蔗糖2030g/L+瓊脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-芐氨基嘌呤2.03.0mg/L，pH值為5.56.5;所述的大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間1520天，培養(yǎng)溫度2025。C，光照時(shí)間820小時(shí)/天，光照強(qiáng)度6080iimol/m2.s;基本培養(yǎng)基]\^+蔗糖2030g/L+瓊脂46g/L+a-萘乙酸2.03.0mg/L+6-芐氨基嘌呤2.03.Omg/L;在大規(guī)模培養(yǎng)的020天內(nèi)往培養(yǎng)基中加入非生物誘導(dǎo)子，SNP4060iimol/L+MJ4060iimol/L+SA4060iimol/L。3.按照權(quán)利要求1或2所述的天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)方法，其特征在于非生物誘導(dǎo)子SNP、MJ和SA的制備方法是將SNP用二甲基亞砜匿S0溶解，經(jīng)0.22iim濾膜過(guò)濾制的一氧化氮N0的供體；將MJ和SA用蒸餾水溶解經(jīng)0.22iim濾膜過(guò)濾制的MJ和SA誘導(dǎo)子。4.按照權(quán)利要求1或2所述的天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)方法，其特征在于植物體的無(wú)菌處理方法包括如下步驟a)將選取的幼莖及葉片用水清洗泥土，再浸泡于蒸餾水中；b)將清洗的幼莖及葉片用7080%的酒精浸泡1020秒進(jìn)行表面滅菌；c)將經(jīng)過(guò)酒精滅菌的幼莖及葉片置于0.050.2%氯化滎溶液中浸泡36分鐘，浸泡過(guò)程中不斷輕輕攪拌使植物體表面充分接觸到氯化汞溶液；d)將經(jīng)過(guò)氯化汞溶液浸泡滅菌的植物體用高溫滅菌處理的蒸餾水漂洗36遍，將植物體表面粘附的氯化汞溶液漂洗干凈，再將植物體用無(wú)菌濾紙吸干水分；e)用無(wú)菌剪刀將幼莖及葉片剪成0.30.5cm2大小，無(wú)菌條件下，將上述表面滅菌處理的材料，每瓶接種5塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種天山雪蓮愈傷組織培養(yǎng)方法，它包括如下步驟植物體的選擇及無(wú)菌處理、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)和大規(guī)模培養(yǎng)三個(gè)環(huán)節(jié)，其核心技術(shù)是選用如下大規(guī)模培養(yǎng)基，MS+蔗糖0～50g/L+瓊脂0～10g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-芐氨基嘌呤0.1～5.0mg/L；在大規(guī)模培養(yǎng)中加入非生物誘導(dǎo)子SNP40～60μmol/L+MJ40～60μmol/L+SA40～60μmol/L。該方法易操作，有效成分含量高，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，可達(dá)到產(chǎn)業(yè)化水平。用本發(fā)明方法培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫丁香苷，不變性、含量高、成本低、周期短、極具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。文檔編號(hào)A01H4/00GK101773071SQ20101000076公開(kāi)日2010年7月14日申請(qǐng)日期2010年1月19日優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日發(fā)明者賈景明申請(qǐng)人:煙臺(tái)匯鵬生物科技有限公司