專利名稱：：馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基及其優(yōu)化方法及成苗方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，具體地，涉及一種馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基，應用該培養(yǎng)基使馬鈴薯試管苗葉片一步成苗的方法，相應地，本發(fā)明也提供了一種優(yōu)化該培養(yǎng)基的方法。
背景技術：
：馬鈴薯(Sola皿ntuberosumL.)是重要的糧、菜、飼料和工業(yè)原料兼農(nóng)作物，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有相當重要的地位。為了創(chuàng)新種質資源，組織培養(yǎng)技術被廣泛的應用于馬鈴薯育種研究中，并取得了顯著成果。植物組織培養(yǎng)一般是采用脫分化、再分化芽和生根壯苗等幾個培養(yǎng)程序，稱為多步成苗。為了簡化培養(yǎng)程序，提高培養(yǎng)效率，人們研究建立了一種一步成苗的新方法。一步成苗又稱一次成苗或直接成苗，是指外植體在一種培養(yǎng)基上同時完成脫分化和再分化過程，直接分化出完整植株的培養(yǎng)方法。組織培養(yǎng)一步成苗，已在煙草、小麥、水稻、大豆、棉花、辣椒等方面均有報道。目前以馬鈴薯葉片、莖段、葉柄、根等多種外植體進行了的再生植株培養(yǎng)，均采用多步成苗培養(yǎng)。其具體技術實施方案為將馬鈴薯試管苗的葉片、莖段、葉柄、根等的外植體進行愈傷組織培養(yǎng)，誘導30d左右后進行愈傷組織的繼代培養(yǎng)，再將愈傷組織轉接分化培養(yǎng)基中再生植株，多步培養(yǎng)途徑煩瑣、再生率普遍較低且誘導時間較長。該一步成苗方法具有再生周期短，繁殖系數(shù)和再生頻率高，易操作，培養(yǎng)程序簡單等優(yōu)點，馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗未見報道。
發(fā)明內容針對上述問題，本發(fā)明的一個目的是優(yōu)化馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基的方法，該培養(yǎng)基使馬鈴薯試管苗葉片在形成愈傷組織后，不需要轉移到分化培養(yǎng)基上，而是直接在原培養(yǎng)基上分化成苗，提高了馬鈴薯試管苗葉片愈傷組織的再生效率、縮短了培養(yǎng)時間、簡化了操作步驟，為馬鈴薯優(yōu)良種苗復壯快繁和品種改良提供了一條有效途徑。本發(fā)明的另一目的是提供一種馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基。本發(fā)明的再一目的是利用上述馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基使馬鈴薯試管苗葉片離體培養(yǎng)一步成苗的培養(yǎng)方法。本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的一種優(yōu)化馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基的方法，該培養(yǎng)基使馬鈴薯試管苗葉片離體培養(yǎng)一步成苗，包括以下步驟(1)以不加任何激素的MS培養(yǎng)基作為對照，采用三因素三水平的L9(34)正交試驗設計，在MS培養(yǎng)基中，添加不同濃度的e-芐氨基嘌呤、萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸的不同組合，配制成馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基，其中6-芐氨基嘌呤濃度為1.5mg/L、2.0mg/L和2.5mg/L，萘乙酸濃度為0.lmg/L、0.2mg/L和0.4mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸濃度為0.Omg/L、0.lmg/L和0.2mg/L;將所得的不同激素組合的培養(yǎng)基置于培養(yǎng)瓶中；(2)將馬鈴薯試管苗葉片接種在步驟(1)所述不同激素組合的培養(yǎng)基中；3(3)將步驟(2)所得的接種后培養(yǎng)基置于溫度為22士2t:條件下，全黑暗培養(yǎng)710天后進行16h/d光照培養(yǎng)，光強為20001x;(4)光照培養(yǎng)20d后，統(tǒng)計愈傷組織誘導率及愈傷組織的形成情況，光照培養(yǎng)40d后統(tǒng)計愈傷組織分化率及成苗狀況；(5)分析步驟(4)所得的實驗數(shù)據(jù)，以質優(yōu)、量多、高分化率及成苗狀況良好所對應的愈傷組織誘導培養(yǎng)基為優(yōu)化的培養(yǎng)基?！N馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基，使馬鈴薯試管苗葉片一步成苗離體培養(yǎng)，所述一步成苗培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，并在1LMS培養(yǎng)基中，還需補加如下組分，并使各組分的終濃度如下度為:6_芐氨基嘌呤1.52.5mg/L;萘乙酸0.10.4mg/L;2，4-二氯苯氧乙酸00.lmg/L。較佳地，所述的馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基，以1LMS培養(yǎng)基計，補加的各組分的終濃6_芐氨基嘌呤2.0mg/L;萘乙酸0.4mg/L。利用所述的馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基，使馬鈴薯試管苗葉片離體培養(yǎng)一步成苗的培養(yǎng)方法，包括如下步驟(1)、提供所述馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基，并進行滅菌處理；(2)、選取來源一致的馬鈴薯無菌試管苗，無菌條件下，切取頂端完全展開的葉片約0.5cmX0.5cm，以葉片背面貼于步驟(1)所述的培養(yǎng)基上；(3)、將步驟(2)所得的接種后培養(yǎng)基置于溫度為22士2t:條件下，全黑暗培養(yǎng)，710天后進行16h/d光照培養(yǎng)，光強為20001x;(4)、光照培養(yǎng)40d后，得馬鈴薯再生植株。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明所述的馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基和應用該培養(yǎng)基使馬鈴薯試管葉片離體培養(yǎng)一步成苗的方法，葉片外植體在形成愈傷組織后，不需要轉移到分化培養(yǎng)基上，而是直接在原培養(yǎng)基上分化成苗，該方法具有再生周期短，繁殖系數(shù)和再生頻率高，易操作，培養(yǎng)程序簡單等優(yōu)點，為馬鈴薯優(yōu)良種苗快速繁殖及品種改良提供一條有效途徑。具體實施例方式以下將結合具體實施例對本發(fā)明做進一步描述和說明。本試驗以川芋IO號馬鈴薯品種的脫毒試管苗為供試材料，由四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院馬鈴薯研究與開發(fā)中心提供。MS培養(yǎng)基由成都科龍化工試劑廠生產(chǎn)；萘乙酸(NAA)，6-芐氨基嘌呤(6-BA)，2，4_二氯苯氧乙酸(2，4_D)均為市售分析純化學試劑。所需激素的配制方法6-芐氨基嘌呤(6-BA):配制濃度為lmg/ml，稱取0.lg6-芐氨基嘌呤用少許4INHCL溶解后用蒸餾水定容至100ml容量瓶中，待用；萘乙酸(NAA):配制濃度為0.5mg/ml，稱取0.05g萘乙酸用少許無水乙醇溶解后用蒸餾水定容至100ml容量瓶中，待用；2，4-二氯苯氧乙酸(2，4_D):配制濃度為lmg/ml，稱取0.lg2，4-二氯苯氧乙酸用少許INHCL溶解后用蒸餾水定容至100ml容量瓶中，待用。實施例1:—種優(yōu)化馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基的方法，該培養(yǎng)基使馬鈴薯試管苗葉片離體培養(yǎng)一步成苗，包括以下步驟以不加任何激素的MS培養(yǎng)基作為對照，采用三因素三水平的L9(34)正交試驗設計，在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度和組合的6-芐氨基嘌呤、萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸，配制成10組不同的馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基。各組中，含有的6-芐氨基嘌呤、萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸的濃度及組合見表1表1具有不同激素組合物的馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基正交實驗設計L9(34)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>對上述10種馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基進行滅菌處理，并取適量置于培養(yǎng)瓶中；選取來源一致的馬鈴薯無菌試管苗，無菌條件下，切取頂端完全展開的葉片，并切取約0.5cmX0.5cm大小葉片，以葉片背面貼于所述馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基上；每瓶接種6個外植體，每個組合接種8瓶；接種后培養(yǎng)基置于溫度為22士2t:條件下，全黑暗培養(yǎng)，7-10天后進行16h/d光照培養(yǎng)，光強為20001x;光照培養(yǎng)20d后，由表2可知愈傷組織誘導率，即產(chǎn)生愈傷的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)X100X，及愈傷組織的形成情況。在原培養(yǎng)基中繼續(xù)光照培養(yǎng)40d后得愈傷組織分化結果(見表3)，即分化芽的愈傷塊數(shù)/總愈傷塊數(shù)X100X，及成苗狀況。表2不同激素組合對葉片愈傷組織誘導的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注+越多表明愈傷組織量越多(下同).表3不同激素組合對葉片不定芽分化的影響組號外植體數(shù)(個〕分化率(％)出芽天數(shù)(d)叢生芽數(shù)量及長勢-0480一一14860.435平均3個芽，3cra，較健壯24820.838平均l.5個芽，1.5cm，較細3480-未見芽分化44810.440平均l個芽，2.5cm，較細承5480-未見芽分化64872.933平均ll個芽，6cm,較健壯。7480-未見芽分化84852.135平均4個芽，5cm,較健壯9480-未見芽分化分析表2所得的實驗數(shù)據(jù)可知，除對照組外，各組馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基均能較好的誘導馬鈴薯葉片形成愈傷組織，其誘導率均達到80%以上，第3，6，7，8，9組，誘導率達到90%以上；而第2，3，4，5，6，8，9組均有較好的愈傷質量，其中，第3，8，9組的愈傷質量最好。再分析表3中數(shù)據(jù)可知，第3，5，9組中的愈傷組織未能分化成芽，而在第2，4，6，8組中，第2組和第4組中的愈傷組織的分化率較差，出芽天數(shù)最長，叢生芽數(shù)量少而長勢較差，第6組和第8組的分化率較好，出芽天數(shù)較短，以第6組分化率最好，出芽天數(shù)最短，叢生芽數(shù)量多而長勢較好。再結合表1分析第2，4，6，8組所對應的培養(yǎng)基中的各激素的濃度和組合，其中，6-BA在第2，4，6，8組中的濃度依次為1.5mg/L，2mg/L，2mg/L，2.5mg/L;NAA在第2，4，6，8組中的濃度依次為O.2mg/L，0.lmg/L，0.4mg/L，0.2mg/L;2，4-D在第2，4，6，8組中的濃度依次為0.lmg/L，0.lmg/L，Omg/L，Omg/L;綜上可知，能夠使馬鈴薯試管苗葉片離體培養(yǎng)一步成苗的培養(yǎng)基組分為以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，并在1LMS培養(yǎng)基中，還需補加的組分及各組分的終濃度為6-節(jié)氨基嘌呤1.52.5mg/L;萘乙酸0.10.4mg/L;2，4-二氯苯氧乙酸00.lmg/L。再結合表1分析第6組所對應的培養(yǎng)基中的各激素的濃度和組合，可知，最佳的馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基的組分為1LMS培養(yǎng)基中，含有終濃度為2.Omg/L的6-芐氨基嘌呤和終濃度為0.4mg/L萘乙酸。實施例2為了避免人為因素所造成的實驗結果的誤差，本申請人請不同的研究人員在相同條件下，利用與實施例相同的馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基，進行了與實施例1相同的實驗操作，其實驗結果見表4和表5。表4不同激素組合對葉片愈傷組織誘導的影響組號接種數(shù)誘導率愈傷量顏色與質地0480—-14895.8暗綠色，顆粒小，較致密，24895.8黃綠色，顆粒小，較致密348100++暗綠色，顆粒較大，較疏松448100++翠綠色，顆粒小，較致密54895.8++淺黃色，顆粒大，疏松648100+++暗綠色，顆粒大，較致密74885.4淡綠色，顆粒較小，疏松透明848100++暗綠色，顆粒大，較致密948100+++淺黃綠色，顆粒較大，疏松7表5不同激素組合對葉片不定芽分化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>分析表4所得的實驗數(shù)據(jù)可知，除對照組外，各組馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基均能較好的誘導馬鈴薯葉片，其誘導率均達到85%以上，第3，4，6，8，9組，誘導率達到100%;而第3，4，5，6，8，9組均有較好的愈傷量，其中，第6，9組的愈傷量最好。再分析表5中數(shù)據(jù)可知，第3組中的愈傷組織未能分化成芽；而在第4，5，6，8，9組中，第4和第5組分化率太低，叢生芽數(shù)量少而長勢較差；第9組出芽天數(shù)太長，叢生芽數(shù)量少；以第6，8組的分化率較好，出芽天數(shù)較短，叢生芽數(shù)量多而長勢較好，以第6組分化率最好，出芽天上最短，叢生芽數(shù)量最多，芽的長勢最好。再結合表1分析第4，5，6，8，9組所對應的培養(yǎng)基中的各激素的濃度和組合，其中，第5組分化率和出芽率均極低，可以視為實驗誤差，因此，該組所對應的培養(yǎng)基中的各激素的濃度可以不計。6-BA在第4，6，8，9組中的濃度依次為2mg/L，2mg/L，2.5mg/L，2.5mg/L;NAA在第4，6，8，9組中的濃度依次為0.lmg/L，0.4mg/L，0.2mg/L，0.4mg/L;2，4-D在第4，6，8，9組中的濃度依次為0.lmg/L，Omg/L，Omg/L，0.lmg/L;綜上可知，能夠使馬鈴薯試管苗葉片離體培養(yǎng)一步成苗的培養(yǎng)基組分為以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，并在1LMS培養(yǎng)基中，還需補加的組分及各組分的終濃度為6-節(jié)氨基嘌呤1.52.5mg/L;萘乙酸0.10.4mg/L;2，4-二氯苯氧乙酸00.1mg/L。再結合表1分析第6組所對應的培養(yǎng)基中的各激素的濃度和組合，可知，最佳的馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基的組分為1LMS培養(yǎng)基中，含有終濃度為2.0mg/L的6-芐氨基嘌呤和終濃度為0.4mg/L萘乙酸。綜上可知，實施例1和實施例2的結果基本相同，具有較好的重復性。實施例3利用所述的馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基，使馬鈴薯試管苗葉片離體培養(yǎng)一步成苗的培養(yǎng)方法，包括如下步驟(1)、配制馬鈴薯一步成苗培養(yǎng)基lLMS培養(yǎng)基中，加入2.0mg6-芐氨基嘌呤和0.4mg萘乙酸，進行滅菌處理，待用；(2)、選取來源一致的馬鈴薯無菌試管苗，無菌條件下，切取頂端完全展開的葉片約0.5cmX0.5cm，以葉片背面貼于步驟1所述的培養(yǎng)基上；(3)、將步驟(2)所得的接種后培養(yǎng)基置于溫度為22士2t:培養(yǎng)箱，全黑暗培養(yǎng)，710天后進行16h/d光照培養(yǎng)，光強為20001x;(4)、培養(yǎng)60d后，得馬鈴薯再生植株。上述實施例，只是本發(fā)明的較佳實施例，并非用來限制本發(fā)明實施范圍，故凡以本發(fā)明權利要求所述的特征及原理所做的等效變化或修飾，均應包括在本發(fā)明權利要求范圍之內。權利要求一種優(yōu)化馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基的方法，該培養(yǎng)基使馬鈴薯試管苗葉片離體培養(yǎng)一步成苗，其特征在于，包括以下步驟(1)以不加任何激素的MS培養(yǎng)基作為對照，采用三因素三水平的L9(34)正交試驗設計，在MS培養(yǎng)基中，添加不同濃度的6-芐氨基嘌呤、萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸的不同組合，配制成馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基，其中6-芐氨基嘌呤濃度為1.5mg/L、2.0mg/L和2.5mg/L，萘乙酸濃度為0.1mg/L、0.2mg/L和0.4mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸濃度為0.0mg/L、0.1mg/L和0.2mg/L；將所得的不同激素組合的培養(yǎng)基置于培養(yǎng)瓶中；(2)將馬鈴薯試管苗葉片接種在步驟(1)所述不同激素組合的培養(yǎng)基中；(3)將步驟(2)所得的接種后培養(yǎng)基置于溫度為22±2℃條件下，全黑暗培養(yǎng)7～10天后進行16h/d光照培養(yǎng)，光強為2000lx；(4)光照培養(yǎng)20d后，統(tǒng)計愈傷組織誘導率及愈傷組織的形成情況，光照培養(yǎng)40d后統(tǒng)計愈傷組織分化率及成苗狀況；(5)分析步驟(4)所得的實驗數(shù)據(jù)，以愈傷組織誘導率高及愈傷組織的形成情況良好，愈傷組織分化率高及成苗狀況良好所對應的培養(yǎng)基為優(yōu)化的培養(yǎng)基。2.—種馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基，使馬鈴薯試管苗葉片離體培養(yǎng)一步成苗，其特征在于，所述培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，并在1LMS培養(yǎng)基中，還需補加如下組分，并使各組分的終濃度如下6_芐氨基嘌呤1.52.5mg/L;萘乙酸0.10.4mg/L;2，4-二氯苯氧乙酸00.lmg/L。3.如權利要求2所述的馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基，其特征在于，以1LMS培養(yǎng)基計，補加的各組分的終濃度為6_芐氨基嘌呤2.Omg/L;萘乙酸0.4mg/L。4.利用權利要求2或3所述的馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基，使馬鈴薯試管苗葉片離體培養(yǎng)一步成苗的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)、提供所述馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基，并進行滅菌處理；(2)、選取來源一致的馬鈴薯無菌試管苗，無菌條件下，切取頂端完全展開的葉片約0.5cmX0.5cm，以葉片背面貼于步驟(1)所述的培養(yǎng)基上；(3)、將步驟(2)所得的接種后培養(yǎng)基置于溫度為22+2t:條件下，全黑暗培養(yǎng)，710天后進行16h/d光照培養(yǎng)，光強為20001x;(4)、光照培養(yǎng)60d后，得馬鈴薯再生植株。全文摘要本發(fā)明公開了一種優(yōu)化馬鈴薯離體培養(yǎng)一步成苗培養(yǎng)基的方法，該培養(yǎng)基使馬鈴薯試管苗葉片離體培養(yǎng)一步成苗，所述一步成苗培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，并在1LMS培養(yǎng)基中，補加不同濃度和組合的6-芐氨基嘌呤，萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸，而后經(jīng)愈傷組織誘導直接分化不定芽和不定根，一步獲得馬鈴薯再生植株。本發(fā)明無需將初代培養(yǎng)基中誘導獲得的愈傷組織轉接于分化培養(yǎng)基中再生成苗，與離體培養(yǎng)多步再生成苗相比，其步驟簡化，培養(yǎng)周期短，重復性好，成苗率高。文檔編號A01H4/00GK101790935SQ20101014009公開日2010年8月4日申請日期2010年3月31日優(yōu)先權日2010年3月31日發(fā)明者倪蘇,劉帆,楊先泉,王俊,王西瑤,胡小弦,黃雪麗申請人:四川農(nóng)業(yè)大學