一種利用金耳菌種轉(zhuǎn)化銀杏葉提取物獲取銀杏內(nèi)酯b的工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了利用金耳菌種轉(zhuǎn)化銀杏葉提取物獲取銀杏內(nèi)酯B的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)金耳菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，從試管斜面、液體搖瓶、一級(jí)種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化銀杏葉提取物產(chǎn)生銀杏內(nèi)酯B，發(fā)酵液經(jīng)過乙酸乙酯萃取、無水酒精結(jié)晶把銀杏內(nèi)酯B從發(fā)酵液分離出來。利用該方法所得到的銀杏內(nèi)酯B的純度≧90%。
【專利說明】一種利用金耳菌種轉(zhuǎn)化銀杏葉提取物獲取銀杏內(nèi)酯B的工
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【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，通過金耳菌種液體培養(yǎng)，同時(shí)轉(zhuǎn)化銀杏葉提取物制備銀杏內(nèi)酯B的一種新工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]研究證明銀杏內(nèi)酯是銀杏葉中主要的活性成分之一，是一類特異有效的血小板活化因子(Platelet activating factor)受體拮抗劑。血小板活化因子(PAF)是由血小板和多種炎癥組織分泌產(chǎn)生的一種內(nèi)源性磷酯，是目前發(fā)現(xiàn)的最有效的血小板聚集誘導(dǎo)劑，與許多疾病的產(chǎn)生、發(fā)展密切相關(guān)。銀杏內(nèi)酯作為PAF受體特異性拮抗劑，具有廣泛的藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)與缺血損傷有保護(hù)作用，抗休克、抗過敏、抗菌抗炎作用，以及抗器官移植中的排斥反應(yīng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B可降低肝門靜脈壓提高全身血管耐受性，說明它對(duì)肝硬化有一定的療效。銀杏內(nèi)酯對(duì)于腎損傷有治療作用。這些作用都與銀杏內(nèi)酯B作為PAF受體拮抗劑有關(guān)，并且它目前被認(rèn)為是作用最強(qiáng)的、最有臨床應(yīng)用前景的天然血小板活化因子(PAF)受體拮抗劑。
[0003]目前國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)銀杏內(nèi)酯B的方法主要是從銀杏葉提取物，目前已見報(bào)導(dǎo)的銀杏內(nèi)酯B的專利共有5篇，其中關(guān)于銀杏內(nèi)酯B的制劑有一篇(一種銀杏內(nèi)酯B固體分散體及其制備方法，申請(qǐng)?zhí)?CN200910204198.4)，三篇關(guān)于銀杏內(nèi)酯B及其衍生物的生理學(xué)功能(銀杏內(nèi)酯B的一種新用途；申請(qǐng)?zhí)?CN200910092750.5 ;銀杏內(nèi)酯B衍生物在制藥中的新用途，申請(qǐng)?zhí)?CN200910234319.X ;銀杏內(nèi)酯B水解衍生物及其用途，申請(qǐng)?zhí)?CN201010122039.2)。而關(guān)于銀杏內(nèi)酯B的制備只有一篇(一種從銀杏內(nèi)酯混合物中分離銀杏內(nèi)酯B的方法，申請(qǐng)?zhí)?一種從銀杏內(nèi)酯混合物中分離銀杏內(nèi)酯B的方法，申請(qǐng)?zhí)?CN201010608847.X)，該銀杏內(nèi)酯中含有銀杏內(nèi)酯A、B、C、M等同系物，該專利是采用分離技術(shù)從銀杏內(nèi)酯混合 物中分離銀杏內(nèi)酯B，有別于本發(fā)明利用真菌金耳液體轉(zhuǎn)化銀杏內(nèi)酯產(chǎn)生銀杏內(nèi)酯B技術(shù)。
[0004]近年來有學(xué)者提出了中藥發(fā)酵制藥技術(shù)。所謂的中藥發(fā)酵制藥技術(shù)是在繼承中藥炮制學(xué)發(fā)酵法的基礎(chǔ)上，吸取了微生態(tài)學(xué)研究成果，結(jié)合現(xiàn)代生物工程的發(fā)酵技術(shù)而形成的高科技中藥制藥新技術(shù)，是從中藥(天然藥物)制藥方面尋找藥物的新療效。傳統(tǒng)的中藥發(fā)酵多是在天然的條件下進(jìn)行的，而現(xiàn)在的中藥發(fā)酵制藥技術(shù)是在充分吸收了近代微生態(tài)學(xué)、生物工程學(xué)的研究成果而逐漸形成的。本發(fā)明在吸取中藥發(fā)酵制藥技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用深層發(fā)酵技術(shù)，在液體培養(yǎng)基中添加適量的銀杏葉提取物，金耳在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)代謝，同時(shí)轉(zhuǎn)化銀杏葉的活性成分，如銀杏內(nèi)酯復(fù)合物，生成銀杏內(nèi)酯B。
[0005]本發(fā)明提供的是一種銀杏內(nèi)酯B的生產(chǎn)技術(shù)，該技術(shù)不是單純的利用分離提純方法獲得大量的銀杏內(nèi)酯B，而是在培養(yǎng)基中添加銀杏葉提取物，以金耳為菌種通過液體培養(yǎng)技術(shù)轉(zhuǎn)化銀杏葉提取物，產(chǎn)生含有銀杏內(nèi)酯B，以及通過提取步驟獲得銀杏內(nèi)酯B制品。
[0006]本發(fā)明所使用的金耳菌種可選任意一種金耳菌種，例如云南、西藏或山西的野生金耳，經(jīng)常規(guī)組織分離得到的菌種。其以金耳為出發(fā)菌株，進(jìn)行試管菌種、液體搖瓶菌種、種子罐菌種、發(fā)酵等步驟制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液，含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液經(jīng)過乙酸乙酯萃取、濃縮、酒精復(fù)溶，一 20°C結(jié)晶、過濾、烘干等提取工藝得到銀杏內(nèi)酯B晶體。其中所述的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基為馬鈴薯200g，切成片狀、加入1000mL水，煮沸30分鐘，過濾，濾液定容至1000mL,根據(jù)試驗(yàn)需要進(jìn)行分裝，120°C滅菌30分鐘；其中所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基1000mL加入瓊脂20g，煮沸融化瓊脂，分裝試管，120°C滅菌30分鐘后，擺成斜面；其中所述的試管斜面菌種為保藏菌種切成4X4mm小塊菌種，挑取一小塊轉(zhuǎn)接含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的試管中，20~32°C培養(yǎng)5~20天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆茫黄渲兴龅囊后w搖瓶菌種為試管斜面菌種切成4X4mm大小的小塊，挑取3~8塊轉(zhuǎn)接入裝有60~150mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，20~32°C，80~150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)3~8天制得金耳液體搖瓶菌種；其中所述的種子罐菌種為10~50瓶金耳液體搖瓶菌種接入裝有30~100L的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基和105~350mL豆油的種子罐中，在溫度20~32°C，通氣量0.3~1:1/分鐘(通氣氣體體積/培養(yǎng)基液體體積)，攪拌轉(zhuǎn)速80~150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)I~5天；其中所述發(fā)酵工藝為為60L種子罐菌種接入裝有180~1800L的含有0.1~3%的銀杏葉提取物的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基和630~6300mL豆油的發(fā)酵罐中，在溫度20~32°C，通氣量0.3~1:1/分鐘(通氣氣體體積/培養(yǎng)基液體體積)，攪拌轉(zhuǎn)速80~150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)3~10天制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液；其中所述的銀杏內(nèi)酯B提取工藝為發(fā)酵液用鹽酸或硫酸調(diào)節(jié)pH 1.0~4.0，連續(xù)用0.3~3倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯萃取2~4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C結(jié)晶24~120小時(shí)，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內(nèi)酯B純品。
[0007]本發(fā)明所述的工藝適合1000~10000L發(fā)酵規(guī)模，本發(fā)明所述的工藝采用的銀杏葉提取物為國(guó)內(nèi)任意一家銀杏葉提取物，但是總黃酮含量> 24%，總內(nèi)酯含量> 6%。利用該工藝獲得銀杏內(nèi)酯B純度3 90%。
【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為本發(fā)明工藝流程圖。
[0008]下述實(shí)施例中所使用的金耳菌株是由發(fā)明人篩選得到的金耳BlOl菌株，金耳BlOl菌株于2011年4月21日提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏。金耳BlOl的分類命名為金耳(7>6?i?77a保藏號(hào)為CGMCC N0.4785。保藏單位地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0009]為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案所涉及的材料及工藝，給出了以下實(shí)施例。這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0010]實(shí)施例1培養(yǎng)基的制備
馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的制備:稱取所需重量的馬鈴薯，切成片狀、加入5倍馬鈴薯重量的水，煮沸30分鐘，過濾，濾液定容至所加水的體積，根據(jù)試驗(yàn)需要分裝250mL三角瓶、種子罐或發(fā)酵罐中，120°C滅菌30分鐘，冷卻備用。
[0011]馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的制備:稱取馬鈴薯200g，切成片狀、加入1000mL水，煮沸30分鐘，過濾，濾液定各至1000mL,加入瓊脂20g,加熱待瓊脂完全融化后，分裝18 X 200mm的試管，每管15mL培養(yǎng)基，120°C滅菌30分鐘，冷卻到50°C，擺成斜面，斜面長(zhǎng)度為試管長(zhǎng)度的一半；
實(shí)施例2含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液的制備
將保藏菌種切成4X4mm小塊菌種，挑取一小塊轉(zhuǎn)接含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的試管中，20°C培養(yǎng)20天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆?；試管斜面菌種切成4 X 4mm大小的小塊，挑取3塊轉(zhuǎn)接入裝有60~150mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，20~32°C，80轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)8天制得金耳液體搖瓶菌種；其中所述的種子罐菌種為10瓶金耳液體搖瓶菌種接入裝有30L的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基和105mL豆油的種子罐中，在溫度20°C，通氣量0.3:1/分鐘(通氣氣體體積/培養(yǎng)基液體體積)，攪拌轉(zhuǎn)速80轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)5天；60L種子罐菌種接入裝有180L的含有0.1%的徐州天力生化制品有限公司生產(chǎn)的銀杏葉提取物的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基和630mL豆油的發(fā)酵罐中，在溫度20°C，通氣量0.3:1/分鐘(通氣氣體體積/培養(yǎng)基液體體積)，攪拌轉(zhuǎn)速80轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)10天制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液。
[0012]實(shí)施例3含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液的制備
將保藏菌種切成4X4mm小塊菌種，挑取一小塊轉(zhuǎn)接含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的試管中，25°C培養(yǎng)10天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆?；其中所述的液體搖瓶菌種為試管斜面菌種切成4 X 4mm大小的小塊，挑取5塊轉(zhuǎn)接入裝有IOOmL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，260C，120轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)5天制得金耳液體搖瓶菌種；30瓶金耳液體搖瓶菌種接入裝有50L的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基和250mL丑油的種子罐中，在溫度26°C,通氣量0.6:1/分鐘(通氣氣體體積/培養(yǎng)基液體體積)，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)3天；60L種子罐菌種接入裝有600L的含有1.5%的寧波中藥制藥有限公司生產(chǎn)的銀杏葉提取物的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基和2500mL豆油的發(fā)酵罐中，在溫度26°C，通氣量0.6:1/分鐘(通氣氣體體積/培養(yǎng)基液體體積)，攪拌轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)6天制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液。
[0013]實(shí)施例4含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液的制備
將保藏菌種切成4X4mm小塊菌種，挑取一小塊轉(zhuǎn)接含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的試管中，32°C培養(yǎng)5天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆茫辉嚬苄泵婢N切成4 X 4mm大小的小塊，挑取8塊轉(zhuǎn)接入裝有150mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，三角瓶放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，32°C，150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)3天制得金耳液體搖瓶菌種；50瓶金耳液體搖瓶菌種接入裝有100L的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基和350mL豆油的種子罐中，在溫度32°C，通氣量1:1/分鐘(通氣氣體體積/培養(yǎng)基液體體積)，攪拌轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)I天；60L種子罐菌種接入裝有1800L的含有3%的西安昌岳植物化工有限公司生產(chǎn)的銀杏葉提取物的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基和630mL豆油的發(fā)酵罐中，在溫度32°C，通氣量1:1/分鐘(通氣氣體體積/培養(yǎng)基液體體積)，攪拌轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)3天制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液。
[0014]實(shí)施例5銀杏內(nèi)酯B的提取
實(shí)施例2~4發(fā)酵液用鹽酸調(diào)節(jié)pH 4.0，加入0.3倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯萃取，水相再用0.3倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯萃取一次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于-20°C結(jié)晶120小時(shí)，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內(nèi)酯B純品。
[0015]實(shí)施例6銀杏內(nèi)酯B的提取
發(fā)酵液用鹽酸調(diào)節(jié)PH 2.5，連續(xù)用1.5倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于-20°C結(jié)晶60小時(shí)，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內(nèi)酯B純品。
[0016]實(shí)施例7銀杏內(nèi)酯B的提取
發(fā)酵液用硫酸調(diào)節(jié)PH 1.0，連續(xù)用發(fā)酵液體積的3倍體積的乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C結(jié)晶24 - 120小時(shí)，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內(nèi)酯B純品。
[0017]實(shí)施例8銀杏內(nèi)酯B純度分析 準(zhǔn)確稱取實(shí)施例5 — 7的樣品5mg溶于ImL無水乙醇中，0.2 μ m膜過濾,濾液共分析用;準(zhǔn)確稱取1、2、3、4、5、6、7和8mg銀杏內(nèi)酯B溶于I mL無水乙醇中，0.2 μ m膜過濾，濾液共分析用；標(biāo)準(zhǔn)品銀杏內(nèi)酯B純度分析采用高效液相色譜技術(shù)，層析柱為C-18柱，流動(dòng)相為乙晴一水，采用連續(xù)梯度洗脫，以標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，根據(jù)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得計(jì)算公式，根據(jù)樣品中峰面積計(jì)算純度。由此測(cè)出實(shí)施例5 - 7的銀杏內(nèi)酯B的含量分別為90.5%、91.2% 和 92.1%。
【權(quán)利要求】
1.一種利用金耳菌種轉(zhuǎn)化銀杏葉提取物獲取銀杏內(nèi)酯B的工藝，其特征在于以金耳為出發(fā)菌株，通過試管斜面菌種、液體搖瓶菌種、種子罐菌種、發(fā)酵等步驟制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液，含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液經(jīng)過乙酸乙酯萃取、濃縮、酒精復(fù)溶，一 20°C結(jié)晶、過濾、烘干等提取工藝得到銀杏內(nèi)酯B晶體。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的一種利用金耳菌種轉(zhuǎn)化銀杏葉提取物獲取銀杏內(nèi)酯B的工藝，將保藏菌種切成4X4mm小塊菌種，挑取一小塊轉(zhuǎn)接含有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的試管中，20~32°C培養(yǎng)5~20天，制得試管斜面菌種，該試管斜面4°C保存?zhèn)溆?；金耳試管斜面菌種切成4X4mm大小的小塊，挑取3~8塊轉(zhuǎn)接入裝有60~150mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中，三角瓶放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，20~32°C，80~150轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)3~8天制得金耳液體搖瓶菌種；10~50瓶金耳液體搖瓶菌種接入裝有30~100L的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基和105~350mL豆油的種子罐中，在溫度20~32°C，通氣量0.3~1:1/分鐘(通氣氣體體積:培養(yǎng)基液體體積)，攪拌轉(zhuǎn)速80~150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)I~5天制得；60L種子罐菌種接入裝有180~1800L的含有0.1~3%的銀杏葉提取物的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基和630~6300L豆油的發(fā)酵罐中，在溫度20~32°C，通氣量0.3~1:1/分鐘(通氣氣體體積:培養(yǎng)基液體體積)，攪拌轉(zhuǎn)速80~150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)3~10天制得含有銀杏內(nèi)酯B的發(fā)酵液；其中所述的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基為馬鈴薯200g，切成片狀、加入1000mL /K，煮沸30分鐘，過濾，濾液定容至1000mL,根據(jù)試驗(yàn)需要進(jìn)行分裝，120°C滅菌30分鐘；其中所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基為馬鈴薯液體培養(yǎng)基1000mL加入瓊脂20g，煮沸融化瓊脂，分裝試管，120°C滅菌30分鐘后，擺成斜面。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用金耳菌種轉(zhuǎn)化銀杏葉提取物獲取銀杏內(nèi)酯B的工藝，銀杏內(nèi)酯B提取工藝為發(fā)酵液用鹽酸或硫酸調(diào)節(jié)pH 1.0~4.0，連續(xù)用0.3~3倍發(fā)酵液體積的乙酸乙酯萃取2~4次，合并乙酸乙酯萃取液，真空濃縮至干，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，過濾，濾液至于_20°C結(jié)晶24~120小時(shí)，過濾，濾渣水洗，80°C干燥得到銀杏內(nèi)酯B純品O
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的一種利用金耳菌種轉(zhuǎn)化銀杏葉提取物獲取銀杏內(nèi)酯B的工藝，銀杏葉提取物為國(guó)內(nèi)任意以廠家生`產(chǎn)的銀杏葉提取物，但是銀杏葉提取物中，總黃酮含量> 24%,總內(nèi)酯含量> 6%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵提取工藝所制得的銀杏內(nèi)酯B白色，內(nèi)酯含量390%。
【文檔編號(hào)】C12P17/18GK103882075SQ201410041643
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月28日
【發(fā)明者】俞建國(guó), 俞亞磊, 王斌 申請(qǐng)人:江蘇河海科技工程集團(tuán)有限公司