專利名稱：培育抗細(xì)菌性條斑病轉(zhuǎn)基因植物方法及其專用載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的一種培育抗細(xì)菌性條斑病轉(zhuǎn)基因植物方法及其專用載體。
背景技術(shù)：
水稻細(xì)菌性條斑病簡(jiǎn)稱細(xì)條病，病原菌為水稻細(xì)菌性條斑病菌 (Xanthomonasoryzae pv. oryzicola (Fang) Swings et al)。廣泛分布于亞洲熱帶禾口亞熱帶地，國(guó)內(nèi)主要分布于華南、華中、西南等地區(qū)。該病發(fā)生時(shí)，蔓延迅速，導(dǎo)致稻葉變黃枯死、空 /秕粒增多、產(chǎn)量下降，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)可達(dá)40% -60%。由于近年來(lái)感病的雜交水稻大面積推廣，稻種的南繁和調(diào)運(yùn)致使此病迅速蔓延，病區(qū)不斷擴(kuò)大，現(xiàn)已成為水稻主要病害。因此研究植物的細(xì)條病抗性的機(jī)理具有重要應(yīng)用價(jià)值。在植物的抗病性應(yīng)答中，基因表達(dá)調(diào)控起著重要的作用。通過(guò)調(diào)控特異基因的表達(dá)，植物可以迅速完成抗病應(yīng)答，抵御病原菌的入侵，提高植物的抗病性。調(diào)控病害應(yīng)答基因表達(dá)是植物抵御外界病源物入侵的重要途徑。在病源物入侵時(shí)，植物可以通過(guò)特異抗病基因的表達(dá)，低于外界病源物入侵，提高植物的抗病性。因此，培育抗細(xì)菌性條斑病植物為研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育抗細(xì)菌性條斑病轉(zhuǎn)基因植物方法及其專用載體。本發(fā)明提供的培育抗細(xì)菌性條斑病的方法，為將JERFl蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铽@得轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)菌性條斑病抗性高于所述目的植物；所述JERFl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述序列2由372個(gè)氨基酸殘基組成。所述JERFl蛋白的編碼基因?yàn)樾蛄斜碇械男蛄?的自5’末端第87位到第1205
位核苷酸。其中序列1由1391個(gè)核苷酸組成，其開(kāi)放閱讀框?yàn)樽?’末端第87位到第1205 位，開(kāi)放閱讀框編碼JERFl蛋白。所述目的植物可為雙子葉植物或者單子葉植物，優(yōu)選為單子葉植物，尤其優(yōu)選為水稻。所述細(xì)菌性條斑病可由下述致病菌引起水稻細(xì)菌性條斑病菌 (Xanthomonasoryzae pv. oryzicola(Fang)Swings et al)。所述JERFl蛋白的編碼基因通過(guò)下述植物表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。所述植物表達(dá)載體的啟動(dòng)子可為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。所述植物表達(dá)載體具體為將所述JERFl蛋白的編碼基因插入載體pCAMBIA1200的 ACSI和SpeI的識(shí)別位點(diǎn)間。載體pCAMBIA1200上有ADHl內(nèi)含子，該內(nèi)含子位于ACSI識(shí)別位點(diǎn)的上游。
所述抗細(xì)菌性條斑病的轉(zhuǎn)基因植物中病程應(yīng)答基因的表達(dá)率高于所述目的植物。所述病程應(yīng)答基因?yàn)镺sChin和Osfcil。本發(fā)明的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)JERFl水稻的細(xì)菌性條斑病抗性高于野生型水稻，具體表型為，在受病原菌侵染后，轉(zhuǎn)JERFl水稻的病斑長(zhǎng)度明顯短于野生型水稻。經(jīng)過(guò)檢測(cè)抗病基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型水稻相比，轉(zhuǎn)JERFl水稻中抗病基因的表達(dá)顯著提高。因此本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)JERFl水稻的細(xì)條病抗性具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為JERFl植物表達(dá)載體構(gòu)建示意2為野生型和轉(zhuǎn)基因水稻接種細(xì)條病21天后的發(fā)病情況圖3為野生型和轉(zhuǎn)基因水稻抗病基因表達(dá)的檢測(cè)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1轉(zhuǎn)JERFl水稻的培育1、重組菌的構(gòu)建提取番茄(Lycopersicum esculentum Mill)(品種為麗春番茄，麗春番茄種子購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。)的葉片DNA，以該DNA為模板，用引物5’-AGGCGCGCCTG TGGTGGTGCAATTATC-3，(下劃線為 ACSI 的酶切位點(diǎn))和 5’-GACTAGTAAGATGTGTATGCAGC-3’ (下劃線為SpeI的酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)，結(jié)果表明PCR 產(chǎn)物為1. 151Λ。經(jīng)測(cè)序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中的序列1自5’末端第87位到第1205 位核苷酸序列，序列表中的序列1自5’末端第87位到第1205位核苷酸序列編碼序列2 所示的蛋白，該蛋白命名為JERF1，該蛋白的編碼基因命名為JERF1。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行ACSI 和SpeI酶切，將經(jīng)ACSI和SpeI酶切后的PCR片段連接到經(jīng)同樣酶切植物雙元表達(dá)載體 PCAMBIA1200 (Cambia, GPO Box 3200, Canberra, ACT 2601, Australia)的大片段上獲得重組表達(dá)載體PCAMBIA1200-JERF1 (見(jiàn)圖1)。將重組表達(dá)載體pCAMBIA1200-JERFl通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404(購(gòu)自 Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS), http//www. cbs.knaw.nl/, NCCBbacteria/plasmids database, NCCB number 2760。 ) 1 H i 會(huì)且胃 LBA4404/ PCAMBIA1200-JERF1，經(jīng)菌落 PCR 鑒定獲得陽(yáng)性重組菌 LBA4404/pCAMBIA1200_JERFl。2.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)pCAMBIA1200-JERFl轉(zhuǎn)化水稻1)將75%乙醇滅菌后的水稻種子(日本晴)種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基(購(gòu)自北京西美杰科技有限公司)+ang/L 2,4-D)上，28°C黑暗培養(yǎng)兩周后獲得愈傷組織，將愈傷組織轉(zhuǎn)入新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，28°C繼代暗培養(yǎng)。2)將第三代繼代愈傷組織中自然分散、顏色淡黃的胚性愈傷顆粒置于繼代培養(yǎng)基 (NB培養(yǎng)基+2mg/L 2,4-D)上，28°C暗培養(yǎng)3天，獲得繼代培養(yǎng)愈傷組織。3)將上述獲得的重組菌 LBA4404/pCAMBIA1200-JERFl 接種于 IOOuM AS+AA 液體培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+2mg/L 2,4-D+100uM/L AS)中培養(yǎng)至OD為0. 3時(shí)獲得菌液，然后將繼代培養(yǎng)愈傷組織置于所述菌液中浸泡10 20分鐘，其間輕輕搖動(dòng)。倒掉菌液，小心取出浸泡后的愈傷組織用濾紙濾干多余菌液，再轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+2mg/L 2， 4-D+100uM/LAS)上，21°C _22°C暗培養(yǎng)3天，獲得共培養(yǎng)愈傷組織。4)挑選共培養(yǎng)愈傷組織，用無(wú)菌水洗去多余菌體，濾紙濾干后平鋪于篩選培養(yǎng)基 (含50mg/L潮霉素Hyg) (NB培養(yǎng)基+2mg/L 2，4_D+50mg/L Hyg)上，28°C進(jìn)行暗培養(yǎng)2周時(shí)繼代一次，然后再培養(yǎng)2周繼代2次，獲得繼代后的共培養(yǎng)愈傷組織。5)將生長(zhǎng)旺盛，呈乳白色或微黃色的新鮮繼代后的共培養(yǎng)愈傷組織轉(zhuǎn)至預(yù)分化培養(yǎng)基(NB培養(yǎng)基+5mg/LABA+0. 5mg/L NAA)，暗培養(yǎng)1周，然后光照培養(yǎng)兩周，繼代一次獲得分化成苗。6)將長(zhǎng)勢(shì)好的分化成苗移至生根培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基，上海生工購(gòu)買)(瓶裝) 上。培養(yǎng)1-2周后移栽溫室獲得23株TO代轉(zhuǎn)JERFl水稻。將上述獲得的TO代轉(zhuǎn)JERFl水稻采用Northern blot鑒定，以JERFl的cDNA序列為探針，鑒定結(jié)果為獲得14株陽(yáng)性TO代轉(zhuǎn)JERFl水稻。收獲鑒定后陽(yáng)性的TO代轉(zhuǎn)JERFl 水稻的種子，使用潮霉素選擇平板萌發(fā)獲得Tl代轉(zhuǎn)JERFl水稻，確認(rèn)其具有3 1的分離比，然后將Tl代轉(zhuǎn)JERFl水稻轉(zhuǎn)至土壤培養(yǎng)直至成熟，收獲Tl代轉(zhuǎn)JERFl水稻種子采用同樣的方法獲得T2代轉(zhuǎn)JERFl水稻，收獲T2代轉(zhuǎn)JERFl水稻種子采用同樣的方法獲得7個(gè) T3代轉(zhuǎn)JERFl水稻株系。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)JERFl水稻抗病性鑒定在正常光、溫、水條件下培養(yǎng)水稻(日本晴)(以下稱為野生型，WT)和4株T3代轉(zhuǎn) JERFl 水稻(編號(hào)為 JERF1-0E4、JERF1-0E8、JERF1-0E9 和 JERF1-0E10)，當(dāng)野生型和 T3 代轉(zhuǎn)JERFl水稻長(zhǎng)到抽穗期時(shí)，在水稻的展開(kāi)葉片葉脈兩側(cè)進(jìn)行針刺接種水稻細(xì)菌性條斑病病原菌水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola(Fang)Swings et al)。 病菌的接種濃度為5X IO8CfVml。每株接種3個(gè)葉片，每葉4-6個(gè)針刺點(diǎn)。接種后7天觀察接種植物的發(fā)病情況，接種后21天統(tǒng)計(jì)發(fā)病植株的病斑長(zhǎng)度(取平均值)，結(jié)果如表1所示。
病斑長(zhǎng)大于IOmm為敏感性(S)，病斑長(zhǎng)小于IOmm為抗性(R)。表1發(fā)病植株的病斑長(zhǎng)度
權(quán)利要求
1.一種培育抗細(xì)菌性條斑病轉(zhuǎn)基因植物方法，為將JERFl蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，獲得抗細(xì)菌性條斑病的轉(zhuǎn)基因植物；所述JERFl蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述JERFl蛋白的編碼基因?yàn)樾蛄斜碇械男蛄?的自5’末端第87位到第1205位核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優(yōu)選為單子葉植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為水稻。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述細(xì)菌性條斑病由下述致病菌弓I起水禾苗細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola (Fang) Swings et al)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述JERFl蛋白的編碼基因通過(guò)植物表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于所述植物表達(dá)載體中的啟動(dòng)子為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述植物表達(dá)載體為將所述JERFl 蛋白的編碼基因插入載體PCAMBIA1200的多克隆位點(diǎn)間得到的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一所述的方法，其特征在于所述抗細(xì)菌性條斑病的轉(zhuǎn)基因植物中病程應(yīng)答基因的表達(dá)率高于所述目的植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述的方法，其特征在于所述病程應(yīng)答基因?yàn)镺sChin和 OsXal0
全文摘要
本發(fā)明提供一種培育抗細(xì)菌性條斑病轉(zhuǎn)基因植物方法及其專用載體，該方法為將JERF1蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铽@得轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)菌性條斑病抗性高于所述目的植物；所述JERF1蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)JERF1水稻的細(xì)菌性條斑病抗性高于野生型水稻，具體表型為，在受病原菌侵染后，轉(zhuǎn)JERF1水稻的病斑長(zhǎng)度明顯短于野生型水稻。經(jīng)過(guò)檢測(cè)抗病基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型水稻相比，轉(zhuǎn)JERF1水稻中抗病基因的表達(dá)顯著提高。因此本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)JERF1水稻的細(xì)條病抗性具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102260678SQ20101018369
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2010年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日
發(fā)明者周時(shí)榮, 張執(zhí)金, 張海文, 權(quán)瑞黨, 李小湘, 黃榮峰 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所