專利名稱：一種提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系及方法
一種提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系及方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，具體涉及一種提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn) 化體系及方法；該轉(zhuǎn)化體系中，含有質(zhì)粒DNA溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和 所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 01% 0. 05% (V/V)；該轉(zhuǎn)化方法的步驟為選取自交授 粉后的玉米的果穗的苞葉和花絲，將所述的轉(zhuǎn)化體系滴在切口凹陷處。
背景技術(shù)：
在玉米的轉(zhuǎn)基因方法研究中，已經(jīng)報(bào)道了多種可行方法可以將外源基因?qū)胗衩?中并得以穩(wěn)定遺傳，這些方法包括基因槍法，PEG介導(dǎo)法，電激法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通 道法。在這些轉(zhuǎn)化方法中大多依賴于玉米的組織培養(yǎng)技術(shù)，玉米的組織培養(yǎng)受基因型和受 體范圍的限制比較大，而花粉管通道轉(zhuǎn)化法不依賴于植物的組織培養(yǎng)技術(shù)，無(wú)需昂貴的儀 器設(shè)備，不受自交系品種和轉(zhuǎn)化基因類型的限制，以及可進(jìn)行規(guī)?；D(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)，因此備受 人們的青睞。
花粉管通道轉(zhuǎn)化法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿著花粉管滲入，經(jīng)過(guò)珠心 通道進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞。周光宇(1979)認(rèn)為 可以利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道(花粉管引導(dǎo)組織)，經(jīng)珠心通道將外源DNA 攜帶進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化受體為受精卵或其前后的生殖細(xì)胞(精子或卵子)，由于它們?nèi)蕴幱谖?形成細(xì)胞壁的類似“原生質(zhì)體”狀態(tài)，并且正進(jìn)行活躍的DNA復(fù)制、分離和重組，所以很容易 將外源DNA片段整合到受體基因組中，以達(dá)到遺傳轉(zhuǎn)化的目的(《遠(yuǎn)緣雜交的分子基礎(chǔ)-DNA 片段雜交假說(shuō)的一個(gè)論證》遺傳學(xué)報(bào)，1979，6 (4): 405-413)。但目前玉米花粉管通道法還 存在轉(zhuǎn)化效率較低的問(wèn)題，轉(zhuǎn)化率為0. 36%-5.洲不等(關(guān)淑艷，張健華，柴曉杰，馬義勇，曲 同寶，孫波，王丕武；《花粉管通道法將淀粉分支酶基因反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)入玉米自交系的研 究》；玉米科學(xué)，2005，13 (4) :13-15)、(王罡，張艷貞，魏松紅，胡應(yīng)剛，吳穎，季靜；《花粉管 通道法將Bt毒蛋白基因?qū)雰?yōu)良玉米自交系》；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002, (4):40-44).
因此，在農(nóng)業(yè)科研及生產(chǎn)中需要一種轉(zhuǎn)化效率高、操作簡(jiǎn)便、能將含有目的DNA的 質(zhì)粒DNA溶液直接轉(zhuǎn)入玉米的提花粉管通道轉(zhuǎn)化體系及其轉(zhuǎn)化方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系及方法，該轉(zhuǎn)化體系 中，含有質(zhì)粒DNA溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積 比為0. 01% 0. 05% (V/V)；該轉(zhuǎn)化方法的步驟為選取自交授粉后的玉米的果穗的苞葉和 花絲，將所述的轉(zhuǎn)化體系滴在切口凹陷處。本發(fā)明轉(zhuǎn)化效率高、操作簡(jiǎn)便、適用的玉米范圍 廣泛。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系，所述的轉(zhuǎn)化體系中，含有質(zhì)粒DNA 溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 01% 0.05% (V/V)。
所述的質(zhì)粒DNA溶液中的質(zhì)粒帶有植物除草劑篩選標(biāo)記基因Bar。
所述的質(zhì)粒為pBPC-Zmptil-bar、pBPC-P5CS-FU9A、PBI121-bar-TPSl、 PGreen0229-RD29A-CBF4-DHA。
本發(fā)明的目的是由以下另一技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化方法，提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道 轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化體系中，含有質(zhì)粒DNA溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質(zhì) 粒DNA溶液的體積比為0. 01% 0. 05% (V/V);所述的轉(zhuǎn)化方法的步驟為選取自交授粉后 的玉米的果穗，剪去苞葉和花絲，將所述的轉(zhuǎn)化體系滴在切口凹陷處；使外源DNA經(jīng)花粉進(jìn) 入時(shí)形成的通道進(jìn)入幼胚，從而完成外源DNA導(dǎo)入過(guò)程。
所述的玉米為玉米自交系178、501、517，M017、C7-2、吉444、京對(duì)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果1、本發(fā)明在質(zhì)粒DNA溶液中添加合適濃度的表面活性劑Silwet L-77，故可以改善含 質(zhì)粒DNA溶液的表面活性，有利于DNA溶液在玉米花絲或柱頭上的潤(rùn)濕、粘附與滲透，增加 玉米花粉管對(duì)DNA的吸收率，從而提高外源DNA片段整合到受體玉米基因組中的效率。
2、本發(fā)明中，因?yàn)槭侵苯訉⒑心康腄NA的質(zhì)粒DNA溶液直接轉(zhuǎn)入玉米中，不依賴 于玉米的組培再生體系，所以操作簡(jiǎn)便，無(wú)需昂貴儀器，生產(chǎn)成本低廉。
3、本發(fā)明不受玉米自交系品種和轉(zhuǎn)化基因種類的限制，適用范圍廣泛。


圖 1 質(zhì)粒 pBPC-Zmptil-bar 圖譜；圖 2 質(zhì)粒 pBPC-P5CS-F129A 圖譜；圖 3 質(zhì)粒 PBI121-bar-TPSl 圖譜；圖 4 質(zhì)粒 PGreen0229-RD29A-CBF4-DHA 圖譜；圖5 實(shí)施例2中，噴施200mg/L除草劑后的玉米植株的照片；圖6 實(shí)施例2中，對(duì)除草劑抗性植株的PCR分子檢測(cè)結(jié)果；圖7 實(shí)施例2中，對(duì)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性植株的免疫印跡驗(yàn)證結(jié)果；圖8 實(shí)施例2中，Tl代轉(zhuǎn)基因植株噴施除草劑5天后的照片；圖9 實(shí)施例12中，中間載體pGreen0029-35s-bar-nos的構(gòu)建流程圖；圖10 實(shí)施例12中，表達(dá)載體pBI121-TPS I的構(gòu)建流程圖；圖11 實(shí)施例12中，質(zhì)粒pBI121- TPSl-bar的構(gòu)建流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 一種提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系及其轉(zhuǎn)化方法，所述的轉(zhuǎn)化體系中， 含有質(zhì)粒DNA溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比 為 0. 01% 0. 05% (V/V)。
所述的質(zhì)粒DNA溶液中的質(zhì)粒帶有植物除草劑篩選標(biāo)記基因Bar。
所述的質(zhì)粒為pBPC-Zmptil-bar、pBPC-P5CS-FU9A、PBI121-bar-TPSl、PGreen0229-RD29A-CBF4-DHA。
一種提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化方法，提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管 通道轉(zhuǎn)化體系中，含有質(zhì)粒DNA溶液和Mlwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA 溶液的體積比為0.01% 0.05% (V/V);所述的轉(zhuǎn)化方法的步驟為選取自交授粉后的玉米 的果穗，剪去苞葉和花絲，將所述的轉(zhuǎn)化體系滴在切口凹陷處。
所述的玉米為玉米自交系178、501、517，M017、C7-2、吉444、京對(duì)。
本實(shí)施例采用的Silwet L-77，是一種有機(jī)硅表面活性劑；在質(zhì)粒DNA溶液中添加 合適濃度的表面活性劑Silwet L-77，故可以改善含質(zhì)粒DNA溶液的表面活性，有利于DNA 溶液在玉米花絲或柱頭上的潤(rùn)濕、粘附與滲透，增加玉米花粉管對(duì)DNA的吸收率，從而提高 外源DNA片段整合到受體玉米基因組中的效率。
本實(shí)施例中，因?yàn)槭侵苯訉⒑心康腄NA的質(zhì)粒DNA溶液直接轉(zhuǎn)入玉米中，不依賴 于玉米的組培再生體系，所以操作簡(jiǎn)便，無(wú)需昂貴儀器，生產(chǎn)成本低廉。
本實(shí)施例的轉(zhuǎn)化方法不受玉米自交系品種和轉(zhuǎn)化基因種類的限制，適用范圍廣 泛。
實(shí)施例2 本實(shí)施例是在實(shí)施例1基礎(chǔ)上的優(yōu)選方案，應(yīng)用于質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar。
所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 02% (V/V)。
所述的轉(zhuǎn)化體系的制備方法包括以下步驟A、菌體活化先挑一個(gè)含有質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar的單菌落到7ml含50mg/L氨芐 青霉素的LB (胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化鈉 (NaCl) 10g/L)液體培養(yǎng)基中，在37°C、250 rpm條件振蕩培養(yǎng)過(guò)夜(12 16 h)，得到菌液 A；B、擴(kuò)大培養(yǎng)然后將所述的菌液A稀釋到經(jīng)37°C溫育過(guò)350 ml LB (含50mg/L氨芐 青霉素)液體培養(yǎng)基中，200 rpm振蕩培養(yǎng)約10 h，得到菌液B;C、質(zhì)粒DNA的提取和純化將所述的菌液B在室溫下8000rpm離心10 min,收集菌體 后利用高純度質(zhì)粒大提試劑盒(NEW INDUSTRY，北京通寶達(dá)公司代理)按照說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒 DNA的提取和純化，最后用無(wú)菌水溶解，得到溶液A ；D、質(zhì)粒DNA溶液的制備再將所述的溶液A倍比稀釋后在0.8 %的瓊脂糖膠上電泳， 分析其純度和濃度；最后將溶液中的DNA濃度調(diào)整為500 μ g/ml，得到所述的質(zhì)粒DNA溶 液；F、轉(zhuǎn)化體系的配制在所述的質(zhì)粒DNA溶液添加Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和 所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 01% (V/V)0
所述的轉(zhuǎn)化方法包括以下步驟選擇玉米受體材料，在開花期從受體自交系群體中選擇發(fā)育較好的植株進(jìn)行套袋授粉 自交。選取自交授粉后18 20h的玉米的果穗，先將雌穗上的紙袋摘下，用剪刀剪去距離 穗軸頂端1 2厘米的花絲和苞葉，保持花絲切面平齊，加以修剪并使苞葉內(nèi)的花絲略低于 苞葉；然后用移液槍在切口處滴注200-300ul所述的反應(yīng)體系，之后立即重新套上紙袋，記 載導(dǎo)入時(shí)間及質(zhì)粒名稱，待其吸收后(約1小時(shí))重復(fù)滴注1次，每種處理做3-5個(gè)果穗。 待玉米果穗成熟時(shí)，將其分別曬干脫粒，備用。
所述的玉米受體材料的品種為玉米自交系178和501。
本實(shí)施例中，質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar的制備方法記載于《ZmPtil基因正義和RNAi 表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化玉米的研究》(張森燕，吳忠義，張秀海，劉占磊，王永勤，黃叢林。 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23 (5):1-5)。
本實(shí)施例的檢測(cè)方法結(jié)果如下本實(shí)施例中Silwet L-77購(gòu)自GE公司，其他試劑均為常規(guī)試劑，可以在市場(chǎng)上購(gòu)買得到。
一、除草劑篩選檢測(cè)在北京地區(qū)4月下旬到5月上旬將玉米種子播種在普通溫室土壤中，適當(dāng)澆水保持土 壤達(dá)到一定的濕度，待種子萌發(fā)后長(zhǎng)到3-4葉期，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，此時(shí)噴施除草劑草銨膦(商 品名百速頓，浙江永農(nóng)公司生產(chǎn))200mg/L (百速頓原液稀釋1000倍)，5天后統(tǒng)計(jì)存活的綠 苗數(shù)，此時(shí)存活苗統(tǒng)計(jì)為除草劑抗性苗。如圖5所示，圖中為噴施200mg/L除草劑后的照片， 綠苗為除草劑的抗性苗。
二、PCR分子檢測(cè)參照張森燕等(2008)方法進(jìn)行，該方法記載于《ZmPtil基因正義和RNAi表達(dá)載體的 構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化玉米的研究》(張森燕，吳忠義，張秀海，劉占磊，王永勤，黃叢林；華北農(nóng)學(xué)報(bào)， 2008,23 (5) 1-5)如圖6所示，圖中為對(duì)除草劑抗性植株的PCR分子檢測(cè)結(jié)果。1 水，2 非轉(zhuǎn)基因植株； 3-7 除草劑抗性轉(zhuǎn)基因植株。
三、免疫印跡檢測(cè)參照田路明(2006)方法進(jìn)行，該方法記載于《Overexpression AtNHXl confers salt-tolerance of transgenic tall fescue〉〉(Tian Luming, Huang Conglin, Yu Rong, Liang Ruifang, Li Zhiliang, Zhang Lusheng, Wang Yongqin, Zhang Xiuhai and Wu Zhongyi*. African Journal of Biotechnology, 2006,5(11): 1041—1044)如圖7所示，圖中為對(duì)PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性植株進(jìn)行免疫印跡驗(yàn)證結(jié)果。WT 非轉(zhuǎn)基因植 株；1-6為轉(zhuǎn)基因植株，可以看到轉(zhuǎn)基因植株中有不同程度的蛋白的表達(dá)。
四、轉(zhuǎn)基因植株性狀檢測(cè)如圖8所示，圖中為Tl代轉(zhuǎn)基因植株噴施除草劑5天后的照片，中間發(fā)黃的植株沒有 除草劑抗性，說(shuō)明該方法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因株系能夠穩(wěn)定遺傳到下一代。
本實(shí)施例中，轉(zhuǎn)化后得到的玉米籽粒數(shù)、出苗數(shù)、除草劑抗性苗數(shù)、 PCR檢測(cè)呈 陽(yáng)性數(shù)、轉(zhuǎn)化率(按檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)與出苗數(shù)計(jì)算)的統(tǒng)計(jì)詳見表1。
實(shí)施例3 本實(shí)施例是在實(shí)施例1基礎(chǔ)上的優(yōu)選方案，應(yīng)用于質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar ； 本實(shí)施例中，所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 01% (V/V)； 所述的玉米受體材料的品種為玉米自交系178和501。
本實(shí)施例中，質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar的制備方法參見實(shí)施例2 ；本實(shí)施例的所述的轉(zhuǎn)化體系的制備方法、轉(zhuǎn)化方法、檢測(cè)方法詳見實(shí)施例2 ；轉(zhuǎn)化后得 到的玉米籽粒數(shù)、出苗數(shù)、除草劑抗性苗數(shù)、PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性數(shù)、轉(zhuǎn)化率(按檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)與出 苗數(shù)計(jì)算)的統(tǒng)計(jì)詳見表1。
實(shí)施例4 本實(shí)施例是在實(shí)施例1基礎(chǔ)上的優(yōu)選方案，應(yīng)用于質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar ； 本實(shí)施例中，所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 03% (V/V)； 所述的玉米受體材料的品種為玉米自交系178和501。
本實(shí)施例中，質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar的制備方法參見實(shí)施例2 ；本實(shí)施例的所述的轉(zhuǎn)化體系的制備方法、轉(zhuǎn)化方法、檢測(cè)方法詳見實(shí)施例2 ；轉(zhuǎn)化后得 到的玉米籽粒數(shù)、出苗數(shù)、除草劑抗性苗數(shù)、PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性數(shù)、轉(zhuǎn)化率(按檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)與出 苗數(shù)計(jì)算)的統(tǒng)計(jì)詳見表1。
實(shí)施例5 本實(shí)施例是在實(shí)施例1基礎(chǔ)上的優(yōu)選方案，應(yīng)用于質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar ； 本實(shí)施例中，所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 04% (V/V)； 所述的玉米受體材料的品種為玉米自交系178和501。
本實(shí)施例中，質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar的制備方法參見實(shí)施例2 ；本實(shí)施例的所述的轉(zhuǎn)化體系的制備方法、轉(zhuǎn)化方法、檢測(cè)方法詳見實(shí)施例2 ；轉(zhuǎn)化后得 到的玉米籽粒數(shù)、出苗數(shù)、除草劑抗性苗數(shù)、PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性數(shù)、轉(zhuǎn)化率(按檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)與出 苗數(shù)計(jì)算)的統(tǒng)計(jì)詳見表1。
實(shí)施例6:本實(shí)施例是在實(shí)施例1基礎(chǔ)上的優(yōu)選方案，應(yīng)用于質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar ； 本實(shí)施例中，所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 05% (V/V)； 所述的玉米受體材料的品種為玉米自交系178和501。
本實(shí)施例中，質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar的制備方法參見實(shí)施例2 ；本實(shí)施例的所述的轉(zhuǎn)化體系的制備方法、轉(zhuǎn)化方法、檢測(cè)方法詳見實(shí)施例2 ；轉(zhuǎn)化后得 到的玉米籽粒數(shù)、出苗數(shù)、除草劑抗性苗數(shù)、PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性數(shù)、轉(zhuǎn)化率(按檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)與出 苗數(shù)計(jì)算)的統(tǒng)計(jì)詳見表1。
由表1中可知，與未添加有Silwet L-77的反應(yīng)體系相比，添加有Silwet L-77的 轉(zhuǎn)化體系能夠顯著提高質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar轉(zhuǎn)化玉米的效率；但是，如果Silwet L-77的 濃度過(guò)高0. 1%)會(huì)影響玉米的結(jié)實(shí)率。
表1: Silwet L-77對(duì)質(zhì)粒pBPC-Zmptil-bar轉(zhuǎn)化玉米的效率的影響
權(quán)利要求
1.一種提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化體系 中，含有質(zhì)粒DNA溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積 比為 0. 01% 0. 05%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系，其特征在于 所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 01%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系，其特征在于 所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 02%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系，其特征在于 所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 03%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系，其特征在于 所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 04%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系，其特征在于 所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 05%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的所述的提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體 系，其特征在于所述的質(zhì)粒DNA溶液中的質(zhì)粒帶有植物除草劑篩選標(biāo)記基因Bar。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系，其特 征在于所述的質(zhì)粒為 pBPC-Zmptil-kir、pBPC-P5CS-FU9A、PBI121-bar-TPSl、 PGreen0229-RD29A-CBF4-DHA。
9.一種提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化方法，其特征在于提高玉米轉(zhuǎn)基因效 率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化體系中，含有質(zhì)粒DNA溶液和Silwet L-77 ；所述的Silwet L-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0. 01% 0. 05% ；所述的轉(zhuǎn)化方法的步驟為選取自交授粉后的玉米的果穗，剪去苞葉和花絲，將所述的 轉(zhuǎn)化體系滴在切口凹陷處。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化方法，其特征在于 所述的玉米為玉米自交系178、501、517，] 017、07-2、吉444、京24。
全文摘要
一種提高玉米轉(zhuǎn)基因效率的花粉管通道轉(zhuǎn)化體系及方法，該轉(zhuǎn)化體系中，含有質(zhì)粒DNA溶液和SilwetL-77；所述的SilwetL-77和所述的質(zhì)粒DNA溶液的體積比為0.01%～0.05%；該轉(zhuǎn)化方法為選取自交授粉后的玉米的果穗的苞葉和花絲，將所述的轉(zhuǎn)化體系滴在切口凹陷處。本發(fā)明在質(zhì)粒DNA溶液中添加表面活性劑SilwetL-77，改善含質(zhì)粒DNA溶液的表面活性，有利于DNA溶液在玉米花絲或柱頭上的潤(rùn)濕、粘附與滲透，增加玉米花粉管對(duì)DNA的吸收率，從而提高外源DNA片段整合到受體玉米基因組中的效率；本發(fā)明因?yàn)槭侵苯訉⒑心康腄NA的質(zhì)粒DNA溶液直接轉(zhuǎn)入玉米中，不依賴于玉米的組培再生體系，所以操作簡(jiǎn)便，無(wú)需昂貴儀器，生產(chǎn)成本低廉；本發(fā)明不受玉米自交系品種和轉(zhuǎn)化基因種類的限制，適用范圍廣泛。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102031273SQ20101026356
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者吳忠義, 張秀海, 李春華, 梁宏霞, 程曦, 羅昌, 黃叢林 申請(qǐng)人:北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心