專利名稱：玉米ZmCIPK12基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種與類似鈣調(diào)磷酸酶B亞基的蛋白(calcineurin B-Iike proteins, CBLs)互作的蛋白激酶(CIPK)的制備方法,本發(fā)明還涉及類似I丐調(diào)磷酸酶B亞基的蛋白(calcineurin B-Iike proteins, CBLs)互作的蛋白激酶(CIPK)基因在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Ca2+是植物生長的必需元素之一，不同的外界刺激信號都可以引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度發(fā)生瞬間、持續(xù)或振蕩變化。這些刺激包括非生物和生物刺激，非生物刺激有光、高溫、低溫、氧化脅迫等；生物刺激有激素ABA和赤霉素、病原激發(fā)子等。越來越多的研究表明，在非 生物逆境脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中，鈣離子是最重要的第二信使之一。首先，植物受到干旱、冷害、鹽脅迫時，胞內(nèi)Ca2+濃度會迅速升高；其次，Ca2+濃度升高能夠調(diào)控許多脅迫誘導(dǎo)基因的表達；其三，脅迫反應(yīng)基因的啟動子的激活同樣需要Ca2+濃度的增加。因此，現(xiàn)在普遍認(rèn)為Ca2+作為第二信使將脅迫信號傳輸?shù)秸{(diào)控通路的下游，Ca2+信使的傳遞是通過鈣結(jié)合蛋白介導(dǎo)的。目前,在植物中已鑒定出許多Ca2+結(jié)合蛋白(calcium sensors)。主要有三類隹丐調(diào)素(calmodulin, CaM)及I丐調(diào)素相關(guān)蛋白(CaM-related proteins) 丐依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPK);類似于動物I丐調(diào)憐酸酶B亞基的蛋白(calcineurin B-Iike proteins, CBLs)。第一類,I丐調(diào)素及I丐調(diào)素相關(guān)蛋白是大家最為熟知的一類Ca2+結(jié)合蛋白，它含有4個能夠直接結(jié)合Ca2+的典型的EF-hand結(jié)構(gòu)域。鈣調(diào)素自身并沒有酶活性，只有其活化后進一步作用于它的目標(biāo)蛋白，才能實現(xiàn)信號的傳遞。鈣調(diào)素作用的目標(biāo)蛋白包括蛋白激酶、轉(zhuǎn)運子、結(jié)構(gòu)蛋白等。第二類，CDPK是一類既含有類似于CaM結(jié)合Ca2+的結(jié)構(gòu)域，同時也含有激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶，因此，它的獨特性就在于它可以同時作為Ca2+的感應(yīng)分子和效應(yīng)分子。第三類Ca2+結(jié)合蛋白-CBL，是最近幾年才發(fā)現(xiàn)的，目前只發(fā)現(xiàn)存在于高等植物中。它和CaM —樣，只含有Ca2+的結(jié)合域，不含有激酶區(qū)。CBL與CaM不同的是，它調(diào)控的是一類特殊的蛋白激酶，稱為CBL互作蛋白激酶(CBL-interactingprotein kinases, CIPKs)。CIPK在N端含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶區(qū),并通過其特有的C末端區(qū)域(C-terminal region)與CBL互作。通過對已知的基因組數(shù)據(jù)(包括EST)的掃描分析發(fā)現(xiàn)，CBL和CIPK只存在于植物中，說明他們可能是植物所特有的一類基因家族，可能出現(xiàn)于植物的早期進化中。由于CIPK基因是近幾年才發(fā)現(xiàn)的，所以對于CIPK基因的研究，目前還是非常有限的。雖然到目前為止，通過基因組數(shù)據(jù)的分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在擬南芥上有10個CBL基因，25個CIPK基因，在水稻上有10個CBL基因，30個CIPK基因，但也只有個別的基因的功能得以研究，對于不同CBL，CIPK基因所調(diào)控的不同的信號途徑也僅限于初步的了解。美國朱健康教授研究組利用在鹽脅迫下篩選擬南芥突變體的方法，鑒定了幾個SOS (Salt OverlySensitive)基因，其中S0S2就是一個CIPK基因(也稱為AtCIPK24)，而S0S3就是一個CBL基因(也稱為AtCBL4)。S0S2和S0S3突變體對鹽脅迫極為敏感，說明S0S2和S0S3基因在擬南芥對鹽脅迫的抗性中起重要作用。當(dāng)植物受到高鹽脅迫時，引起胞內(nèi)Ca2+濃度升高，S0S3首先感受到Ca2+所傳導(dǎo)的脅迫信號，然后特異性地激活S0S2，S0S2進一步作用于Na+/H+反轉(zhuǎn)運子(即S0S1)，SOSl將胞內(nèi)多余的Na+轉(zhuǎn)運到胞外，達到抵抗Na+對植物細(xì)胞的毒害作用。這一調(diào)控通路是在目前的抗逆研究領(lǐng)域中研究的比較清楚的調(diào)控途徑。美國LuanSheng教授研究組在1999年克隆了擬南芥AtCBLl基因，并通過酵母雙雜的方法，克隆了與AtCBLl互作的AtCIPKl基因。2003年他們對擬南芥的CIPK家族成員之一 AtCIPK3基因的功能進行了研究，發(fā)現(xiàn)CIPK3基因在3-7天的幼苗期有較高的表達，在成株期表達量很低，有趣的是，AtCIPK3基因在ΑΒΑ、冷害、高鹽、干旱、機械傷害等誘導(dǎo)下高水平的表達。但是AtCIPK3的突變體在各種逆境的脅迫下，并沒有明顯的表型的變化。然而，在AtCIPK3的突變體上，對許多明顯受ABA和各種脅迫調(diào)控的基因的表達的研究卻發(fā)現(xiàn)，一些信號調(diào)控途徑已經(jīng)發(fā)生改變，但是干旱誘導(dǎo)的基因的表達并沒有受到影響，說明AtCIPK3是有選擇地來調(diào)控植物在ABA和各種脅迫下的調(diào)控途徑。對于AtCIPK3繼續(xù)研究所得的另一個重要發(fā)現(xiàn)是，AtCIPK3可能是在各種脅迫下依賴ABA調(diào)控途徑和不依賴ABA調(diào)控途徑的調(diào)節(jié)的關(guān)鍵樞紐(cross-talk node)。Chikano等(2001)研究發(fā)現(xiàn)另外一個擬南芥CIPK家族成員
之一 AtSR2(即AtCIPK14)參與到糖的調(diào)控途徑中，AtCIPKH的突變體對葡萄糖(Glc)非常敏感，但是但是對各種滲透脅迫卻沒有任何反應(yīng)，暗示著AtCIPKH可能特異性地參與在糖的調(diào)控體系中。因此，目前對于植物CIPK基因的研究正是一個方興未艾的領(lǐng)域，僅有的一些研究結(jié)果只是對這一領(lǐng)域的初步探索，這方面的研究工作基本上是在模式植物擬南芥上進行的。對于重要作物(如水稻、玉米、小麥等)的此類基因的研究還鮮有報道，特別是有關(guān)玉米CIPK基因的功能研究尚未見應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的內(nèi)容為提供一個玉米ZmCIPK12的基因序列，利用ZmCIPK序列信息擴增該基因，并構(gòu)建過表達載體轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，獲得的轉(zhuǎn)基因植株在150mM NaCL、350mM甘露醇上表現(xiàn)為對滲透脅迫和鹽脅迫的抗性。本發(fā)明的技術(shù)方案如下玉米ZmCIPK12基因，具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；該基因編碼區(qū)全長1512個堿基，基因中的激酶結(jié)構(gòu)域為第321個至第597個共276個堿基(圖I)，該蛋白由504個氨基酸殘基組成。利用該序列信息，擴增該基因，構(gòu)建克隆載體以及植物表達載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株在NaCL及甘露醇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為對滲透脅迫和鹽脅迫的抗性，說明CIPK12編碼的蛋白能夠調(diào)控植物抗逆過程。本發(fā)明中ZmCIPK12通過基因調(diào)控來參與植物抗逆過程成為可能對于培育高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有重要意義。


圖I :為ZmCIPK12核苷酸序列與氨基酸序列，ATG為起始密碼子，*為終止符號。圖2 :植物表達載體示意圖；35S PROM為35S啟動子，NOS term為NOS終止子，NPTII為編碼卡那霉素抗性的標(biāo)記篩選基因。圖3 ZmCIPK12轉(zhuǎn)基因株系目的基因的PCR檢測；M =Marker ; I :正對照(以ZmCIPK12表達載體為PCR模板)；2 :負(fù)對照(以野生型擬南芥DNA為PCR模板)；3_9 ZmCIPK12不同轉(zhuǎn)基因株系目的基因擴增結(jié)果圖4 :轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型植株在150mM NaCl的生長情況比較；轉(zhuǎn)35S :ZmCIPK12基因擬南芥種子點播在含有150mM NaCl的MS培養(yǎng)基上，4°C春化3d后，置于22°C培養(yǎng)，IOd后觀察生長狀況轉(zhuǎn)基因株系在150mM NaCl的平板上生長明顯受到抑制，部分幼苗出現(xiàn)玻璃化情況，但轉(zhuǎn)基因株系12-7、12-19長勢明顯優(yōu)于WT，NaCl對幼苗根長也有明顯抑制作用。圖5 :轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型植株在300mM甘露醇上的生長情況比較；轉(zhuǎn)35S ZmCIPK12基因擬南芥種子點播在含有300mM甘露醇的MS培養(yǎng)基上，4°C春化3d后，置于22°C培養(yǎng)，IOd后觀察生長狀況，從圖可知，ZmCIPK12-19、12-23兩個株系根長明顯比WT長， 葉片變化不是很大，說明轉(zhuǎn)基因株系對甘露醇有明顯抗性。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。實施例I :含有CIPK蛋白激酶基因的表達載體的構(gòu)建I、以本發(fā)明中 ZmCIPK12 的 cDNA 序列，設(shè)計引物 C12-F ATGGACGCTACCCCGCCGTC,C12-R CTAATCAGTATCAGAAGGTAT,以玉米cDNA為模板，擴增ZmCIPK12基因序列，擴增體系
為
模板IOOng
C12F (IOuM)0.5 uL
C12-R (IOuM)0.5 uL
dNTP(lOmM)0.5 uL
聚合酶5 U
聚合酶緩沖液(IOX)2 uL
ddw補足至20 uL94°C變性3分鐘；94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸I分30秒，35個循環(huán)；72°C延伸7分鐘。PCR產(chǎn)物低溫保藏備用。 2、用普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒，回收PCR產(chǎn)物，將回收的PCR產(chǎn)物與T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，挑取轉(zhuǎn)化陽性的克隆提取質(zhì)粒送測序，經(jīng)過測序確定正確的克隆用于后續(xù)克隆及酶切。3、將ρΒΙ121質(zhì)粒用BamH I和Sac I進行雙酶切，并用瓊脂糖凝膠試劑盒回收目的片段，同時用BamH I和Sac I進行酶切連接在T載體的CIPK12片段切，并回收，將回收的CIPK12片段與ρΒΙ121載體片段連接，然后后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組克隆，結(jié)果酶切和PCR檢測后將正確的克隆命名為PBI121-CIPK12。實施例2 :含有CIPK12蛋白激酶基因的轉(zhuǎn)化與篩選I、構(gòu)建好的ZmCIPK12表達載體pBI121_CIPK12轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。2、用沾花浸染(floral dipping)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥野生型。3、將轉(zhuǎn)化后得到的Ttl代種子春化3天，然后直接播種到營養(yǎng)土中生長，正常生長約兩周后，用O. 5%。的卡那霉素噴灑Ttl代擬南芥篩選轉(zhuǎn)化植株。4、由于所用的表達載體pBI121-CIPK12帶有抗卡那霉素的NPTII基因，它在轉(zhuǎn)化時能隨目的基因一起轉(zhuǎn)入植物體，所以在噴施卡那霉素后大部分未轉(zhuǎn)化植株死亡，而轉(zhuǎn)化植株仍然能夠正常生長。轉(zhuǎn)化植株按照不同株系分別收獲T1代種子。5、收獲各轉(zhuǎn)基因株系T2代種子后，用O. 5%的NaClO對種子進行消毒處理。然后 點種于含有O. 5%。的卡那霉素的MS培養(yǎng)基平板中(每個轉(zhuǎn)基因株系需要約40粒種子)，以野生型為負(fù)對照。6、春化三天后置于22度光照培養(yǎng)箱中生長，一周后觀察幼苗生長情況。野生型在含O. 5%。的卡那霉素的MS培養(yǎng)基中無法存活；T2代雜合體轉(zhuǎn)基因株系由于在產(chǎn)生子代的過程中會發(fā)生基因分離與自由組合，因此會有一部分無卡那霉素抗性的種子出現(xiàn)；只有T2代為純合體轉(zhuǎn)基因株系的種子能全部在含卡那霉素的MS培養(yǎng)基中存活。實施例3 :含有CIPK蛋白激酶基因的轉(zhuǎn)基因植株核酸PCR分析I、以提取的陽性植株的總DNA為模板，用ZmCIPK12基因引物進行PCR擴增，陽性植株能夠擴增出I. 5kb和的條帶，而假陽性植株則無PCR產(chǎn)物。野生型植株不能擴增出目的條帶(圖3)。2、收獲各轉(zhuǎn)基因株系T2代種子后，用O. 5%的NaClO對種子進行消毒處理。然后點種于含有O. 5%。的卡那霉素的MS培養(yǎng)基平板中(每個轉(zhuǎn)基因株系需要約40粒種子)，以野生型為負(fù)對照。3、春化三天后置于22°C光照培養(yǎng)箱中生長，一周后觀察幼苗生長情況。野生型在含O. 5%。的卡那霉素的MS培養(yǎng)基中無法存活。4、T2代雜合體轉(zhuǎn)基因株系由于在產(chǎn)生子代的過程中會發(fā)生基因分離與自由組合，因此會有一部分無卡那霉素抗性的種子出現(xiàn)；只有T2代為純合體轉(zhuǎn)基因株系的種子能全部在含卡那霉素的MS培養(yǎng)基中存活。實施例4 :含有CIPK蛋白激酶基因的轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株抗逆性比較將ZmCIPK12轉(zhuǎn)基因株系在含有150mM的NaCl、300mM的甘露醇的MS平板上的表型進行了分析。從結(jié)果(圖4、圖5)中可以看出，相對野生型而言，野生型在高鹽和甘露醇脅迫下葉子萎蔫發(fā)黃程度嚴(yán)重，而兩者在正常MS培養(yǎng)基中表型無明顯差別。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
權(quán)利要求
1.玉米ZmCIPK12基因，具有SEQID NO : I所示的核苷酸序列。
2.包含權(quán)利要求I所述的玉米ZmCIPK12基因的細(xì)胞、載體在用于產(chǎn)生耐旱、耐鹽堿的植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個與擬南芥同源的玉米ZmCIPK12基因及其克隆方法和應(yīng)用。該基因編碼區(qū)全長1512個堿基，基因中的激酶結(jié)構(gòu)域為第321個至第597個共276個堿基，該蛋白由504個氨基酸殘基組成。利用該序列信息，擴增該基因，構(gòu)建克隆載體以及植物表達載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥，轉(zhuǎn)基因植株在NaCL及甘露醇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為對滲透脅迫和鹽脅迫的抗性，說明CIPK12編碼的蛋白能夠調(diào)控植物抗逆過程。本發(fā)明中ZmCIPK12通過基因調(diào)控來參與植物抗逆過程成為可能對于培育高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有重要意義。
文檔編號C12N1/21GK102943080SQ20121041001
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者陳勛基, 黃全生, 陳果, 李建平, 足母熱木, 邵琳 申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所