玉米Opaque1基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種玉米Opaque1基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。該分子標(biāo)記是通過PCR擴(kuò)增特異性引物，得到的一種共顯性分子標(biāo)記MYO-PD，所述的特異性引物為SEQIDNO.1～SEQIDNO.2所示的堿基序列。利用這個(gè)與o1基因完全連鎖的分子標(biāo)記能對玉米任何時(shí)期和任何組織的DNA進(jìn)行基因型鑒定，檢測雜交育種子代各單株中o1基因的存在與否以及雜合或純合狀態(tài)。同時(shí)，利用這個(gè)分子標(biāo)記能區(qū)分突變體與10種國內(nèi)主要育種親本，能夠在任何育種背景群體中準(zhǔn)確檢測到o1基因的存在，且錯(cuò)選率為0。這種檢測方法的準(zhǔn)確性高，操作簡單，為利用o1基因的DNA分子標(biāo)記輔助育種提供重要的技術(shù)手段。
【專利說明】玉米Opaquel基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種玉米φ<3<7--?7基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]全球正經(jīng)歷著持續(xù)的沖擊:糧食危機(jī)、螺旋式上升的能源消費(fèi)、氣候變暖的加劇以及近來的經(jīng)濟(jì)衰退。糧食危機(jī)引發(fā)的騷亂在各大洲時(shí)有發(fā)生。作為食品、飼料和燃料的重要來源，農(nóng)作物的全球需求和消耗正在急劇增加。特別是，新興國家飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整:肉類消費(fèi)不斷增加；以及發(fā)達(dá)國家利用糧食生產(chǎn)生物燃料的加速。這使得糧食問題日益凸現(xiàn)，已成為制約世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展及安全的關(guān)鍵因素之一。因此，只有通過不斷提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，在世界有限的耕地上生產(chǎn)出更多的糧食，才能滿足社會(huì)需求，維持世界安全和全球經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展。
[0003]玉米是世界上是世界上分布最廣的作物之一，栽培面積僅次于小麥和水稻。它是世界上同時(shí)也是我國主要的糧食和飼料作物。從1998年起，玉米總產(chǎn)量已超過小麥和水稻成為世界第一大糧食作物。我國從1995年開始玉米的總產(chǎn)量已超過小麥，成為僅次于水稻的第二大糧食作物。預(yù)計(jì)到2017年，全球玉米和小麥的年產(chǎn)量需要再增加2億噸才能滿足全世界的需求。為應(yīng)對世界糧食危機(jī)，保證國家糧食安全，我國提出了構(gòu)建糧食核心區(qū)、到2020年再增產(chǎn)糧食1000億斤的戰(zhàn)略目標(biāo)，其中需要新增玉米400億斤(全國新增1000億斤糧食生產(chǎn)能力規(guī)劃2009-2020年，2009，國務(wù)院)。因此，這對玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的改良與創(chuàng)新提出了更高的要求。
[0004]玉米i/ea,亦稱包谷、荀米、棒子，屬于禾本科(Craaifleae)玉蜀黍族(Maydeae) 一年生草本植物。與其它作物相比，玉米具有以下優(yōu)點(diǎn):巨大的突變體庫、較大的異染色質(zhì)區(qū)段、很高的核苷酸多態(tài)性以及其基因與近緣草本共線(colinearity)。因此，玉米已成為遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)和基因組學(xué)研究的中心系統(tǒng)。同時(shí)，作為光合高效的C4植物，玉米已被列為研究生物產(chǎn)量和質(zhì)量相關(guān)機(jī)制生物質(zhì)能源的模式系統(tǒng)。2009年，隨著2.3Gb玉米B73自交系草圖序列在Science雜志上發(fā)表，這將對玉米馴化以及農(nóng)藝性狀的研究起著里程碑式的作用。
[0005]籽粒是玉米營養(yǎng)物質(zhì)的重要儲(chǔ)存器官。它主要由來源于雙受精的胚和胚乳組成，并且表面有種皮包被。在典型的馬齒(dent)玉米品種中，胚乳由物理特性不同的幾個(gè)部分組成。其最外層是糊粉層(aleurone)，由一些特化的細(xì)胞組成，在種子萌發(fā)過程中能夠分泌水解酶。糊粉層下面就是粉質(zhì)胚乳細(xì)胞(starchy endosperm cells),充斥著淀粉和儲(chǔ)藏蛋白，這些細(xì)胞形成兩種結(jié)構(gòu)不同的區(qū)域:分布于外圍的玻璃質(zhì)(vitreous)胚乳和內(nèi)部的粉質(zhì)(starchy)胚乳。
[0006]通常，玉米胚乳含有90%的淀粉和10%的蛋白。而這些蛋白中70%的成分是醇溶蛋白，也稱作玉米蛋白(zein)。然而，這些含量豐富的醇溶蛋白營養(yǎng)成分卻很不平衡。它缺乏一些單胃動(dòng)物必需的氨基酸，尤其是賴氨酸；它僅含有1.5-2%的賴氨酸，而最佳的人類營養(yǎng)比例是5%。而大多數(shù)粉質(zhì)胚乳突變體都有一個(gè)共同的特征:賴氨酸的含量顯著增加，從而改良了蛋白品質(zhì)。其中，以的突變尤為顯著，賴氨酸含量增加接近2倍。研究表明，大多數(shù)此類突變體蛋白品質(zhì)的改善得益于非醇溶蛋白與醇溶蛋白的比例的增加。
[0007]玉米胚乳突變體0之的發(fā)現(xiàn)為玉米品質(zhì)改造創(chuàng)新提供了極為重要的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn):o之通過減少醇溶蛋白的合成、增加其它富含賴氨酸的蛋白質(zhì)，從而最終提高胚乳中賴氨酸的含量。但是，這種類型的突變會(huì)導(dǎo)致籽粒密度低、質(zhì)地柔軟、以及硬度下降。隨之而來的是一些不利的農(nóng)藝性狀，例如籽粒很脆、易受蟲害及不易儲(chǔ)藏，產(chǎn)量也隨之減低，極大降低了該類型突變體的商業(yè)價(jià)值。
[0008]于是，玉米育種學(xué)家開始尋找能夠改變M胚乳松軟、粉質(zhì)表型的修飾基因(modifier gene),從而獲得必需氨基酸含量增加且物理性質(zhì)正常的籽粒。研究表明:調(diào)控 o2的修飾基因的位點(diǎn)有好幾個(gè)；這些位點(diǎn)都能夠有效地改善粉質(zhì)胚乳突變體的不利農(nóng)藝性狀。南非和國際玉米和小麥改良中心的育種學(xué)家，通過將oJ?修飾基因系統(tǒng)滲入種質(zhì)的方法，最終獲得了胚乳堅(jiān)硬的0之突變體,稱為“優(yōu)質(zhì)蛋白玉米”(QPM, quality proteinmaize)。QPM表型和產(chǎn)量與正常玉米相似，但卻保持了 oJ?的賴氨酸含量。這種種質(zhì)創(chuàng)新極大地增加了玉米的商業(yè)價(jià)值，極大推動(dòng)了玉米產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0009]玉米籽粒品質(zhì)性狀的改造依賴于這些能夠改良蛋白品質(zhì)的高賴氨酸突變體。opaque I (ol)是玉米經(jīng)典的粉質(zhì)胚乳突變體,最早由Singleton和Jones發(fā)現(xiàn),呈現(xiàn)出柔軟、粉質(zhì)的籽粒表型。ol突變體在特定遺傳背景下(如A69Y等)，能產(chǎn)生oJ?突變體類似的效應(yīng)，賴氨酸含量增加，蛋白品質(zhì)提高(Balconi et al.，1998)。如果能將o7突變體引入生產(chǎn)品種，則能進(jìn)一步提高籽粒的賴氨酸(Iys)含量，培育出高賴氨酸(Iys)含量的優(yōu)質(zhì)蛋白玉米新品種。因此，ol突變體可以改善玉米籽粒的蛋白品質(zhì)，對培育高品質(zhì)的玉米有很好的應(yīng)用價(jià)值。
[0010]01雖然已經(jīng)被克隆，但是見基因至今尚未通過雜交育種被很好地利用，主要是因?yàn)?1由隱性基因突變引起，通過雜交選育需要較長的時(shí)間。DNA分子標(biāo)記輔助育種是一項(xiàng)新的育種技術(shù)，該技術(shù)是通過利用與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記對控制目標(biāo)性狀的基因進(jìn)行間接選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)。該技術(shù)對目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)移，不僅可在早期進(jìn)行準(zhǔn)確、穩(wěn)定的選擇，而且可克服再度利用隱性基因識(shí)別難的問題，從而加速育種進(jìn)程，提高育種效率。與常規(guī)育種相比，該技術(shù)可提高育種效率2-3倍。
[0011]DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的關(guān)鍵是:(1)獲得的分子標(biāo)記應(yīng)該是能夠區(qū)分育種過程中雜交親本(純合見類型和純合野生型類型)以及它們雜交子代(Fl代)的共顯性標(biāo)記；(2)獲得的共顯性分子標(biāo)記與控制目標(biāo)性狀基因的連鎖情況，連鎖越緊密在其后代中錯(cuò)選的概率越低，如果該標(biāo)記來源于控制目標(biāo)性狀基因，則利用該分子標(biāo)記在其后代中錯(cuò)選的概率為零；(3)該標(biāo)記可以區(qū)分突變體與國內(nèi)所有主要育種親本。以往研究中并沒有獲得位于仍基因上并且與其完全連鎖的共顯性DNA分子標(biāo)記，故無法對該基因所控制的目標(biāo)性狀進(jìn)行DNA分子標(biāo)記輔助選擇，同時(shí)，以往也為獲得能夠區(qū)分突變體與國內(nèi)所有主要育種親本的分析標(biāo)記。所以，對于該種標(biāo)記的獲得和鑒定是對控制玉米籽粒高油高賴氨酸含量農(nóng)藝性狀的01基因進(jìn)行DNA分子標(biāo)記輔助育種的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的之一在于提供一種玉米Opaqiwl基因的分子標(biāo)記。[0013]本發(fā)明的目的之二在于提供該分子標(biāo)記在檢測和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應(yīng)用。
[0014]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種玉米Opaquel基因的分子標(biāo)記，其特征在于該分子標(biāo)記是通過PCR擴(kuò)增特異性引物，得到的一種共顯性分子標(biāo)記MY0-PD，所述的特異性引物為SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.2所不的喊基序列。
[0015]一種根據(jù)上述的高油高賴氨酸玉米此7基因的分子標(biāo)記在檢測和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應(yīng)用。。
[0016]本發(fā)明利用高油高賴氨酸玉米(01/01)與其他具優(yōu)良性狀的玉米雜交獲得Fl代，F(xiàn)l代自交后篩選具有目的性狀的高油高賴氨酸玉米F2，F(xiàn)2代多次自交，最終獲得穩(wěn)定的純合體。
[0017]本發(fā)明提供I個(gè)位于見基因上并且與其完全連鎖的共顯性DNA分子標(biāo)記，以及利用這個(gè)共顯性DNA分子標(biāo)記對Ol基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔 助選擇的方法。利用這個(gè)分子標(biāo)記能對玉米任何時(shí)期和任何組織的DNA進(jìn)行基因型鑒定，檢測雜交育種子代各單株中ol基因的存在與否以及雜合或純合狀態(tài)。利用這個(gè)分子標(biāo)記能區(qū)分突變體與國內(nèi)10種主要育種親本，能夠在任何育種背景群體中準(zhǔn)確檢測到ol基因的存在。這種檢測方法的準(zhǔn)確性高，操作簡單，為利用ol基因的DNA分子標(biāo)記輔助育種提供重要的技術(shù)手段。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1 ol突變體和野生型籽粒中脂肪酸含量變化圖 圖2為玉米籽粒純合突變體外形圖(ol/ol)；
圖3是玉米籽粒野生型(+/+)
圖4是用于進(jìn)行01基因克隆的BC群體構(gòu)建路線；
圖5標(biāo)記MYO-PD在BC群體中的分離情況，其中I一5為ol/ol純合體；6 —10為01/+雜合體；
圖6是本發(fā)明中分子標(biāo)記在玉米四號(hào)染色體長臂上的示意位置；
圖7是標(biāo)記MYO-PD在10種國內(nèi)不同育種自交系間的多態(tài)情況；+/_是雜合型對照，ol為ol/ol是突變體對照。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實(shí)施事例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生物學(xué)一實(shí)驗(yàn)手冊(Plant Molecular Biology — A Laboratory Manual, Melody S.Clark編’ Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0020]實(shí)施例一:利用Ol突變體(ol/ol)培育高油高賴氨酸玉米
與對應(yīng)的野生型相比，ol突變體籽?？傊舅岷吭黾恿?10%左右，其中占玉米脂肪酸組分90%左右的三大組分(:16:0，(:18:1，(:18:2都有顯著性差異(表1，圖1)。把o7突變純合體(ol/ol)與其它具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的玉米雜交，然后Fl代自交，在F2代中分離出高油高賴氨酸玉米籽粒的隱性純合體。該隱性純合體經(jīng)多代自交，輪回選擇，逐代選擇籽粒發(fā)育好，賴氨酸含量高的種子，最終獲得穩(wěn)定的隱性純合體，高油高賴氨酸自交系或群體，即獲得高油高賴氨酸商品玉米。
[0021]表1 ol突變體及其對應(yīng)野生型脂肪酸含量分析。
【權(quán)利要求】
1.一種玉米此7基因的分子標(biāo)記，其特征在于該分子標(biāo)記是通過PCR擴(kuò)增特異性引物，得到的一種共顯性分子標(biāo)記MYO-PD，所述的特異性引物為SEQ ID N0.1~SEQ IDN0.2所不的喊基序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的高油高賴氨酸玉米基因的分子標(biāo)記在檢測和區(qū)分玉米育種過程中雜交親本以及它`們雜交子代類型中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103695550SQ201310718089
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】王桂鳳, 王芳, 鐘鳴宇, 王佳佳, 王剛, 宋任濤, 許政暟 申請人:上海大學(xué)