專利名稱：一種川貝母培養(yǎng)物快速生產(chǎn)中的有效除菌方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種川貝母培養(yǎng)物快速生產(chǎn)中的有效除菌方法。
背景技術(shù)：
名貴藥材川貝母是百合科多年生草本植物川貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)的干燥鱗莖，為最常用、最有效的止咳化痰藥，常用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞 嗽，咯痰帶血，其有效成分主要為貝母生物堿和留體皂甙類。隨著各種止咳化痰藥物的開發(fā) 和大量的需求，川貝母的用量不斷增加，而僅靠采挖野生川貝母已遠遠不能滿足藥材市場 的需求。植物組織培養(yǎng)技術(shù)不但可以有效的解決藥用植物對溫度、土質(zhì)、氣候等條件的依 賴，還能快速、高效的生產(chǎn)藥用植物有效成分。自1956年Routine和Nickel首次通過植物 培養(yǎng)生產(chǎn)有用次級代謝產(chǎn)物以來，藥用植物組織培養(yǎng)的研究工作取得了較大的進展，已有 上百種植物代謝產(chǎn)物通過細胞培養(yǎng)技術(shù)獲得，近半數(shù)次級代謝產(chǎn)物的含量超過原植物。因 此，運用現(xiàn)代生物技術(shù)的組織培養(yǎng)手段獲得川貝母藥材的有效組份是解決當(dāng)前川貝母藥材 供不應(yīng)求的重要途徑。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)利用組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)川貝母培養(yǎng)物25天生物量可增加約3. 5倍， 生物堿含量是野生川貝母的2倍左右。但是，在川貝母培養(yǎng)物快速無菌培養(yǎng)生產(chǎn)過程中，由 于一些原因會造成培養(yǎng)材料出現(xiàn)染菌的情況。由于培養(yǎng)材料一旦出現(xiàn)染菌后會嚴(yán)重抑制其 生長和有效組份的積累，并且最終導(dǎo)致培養(yǎng)材料的死亡，從而會對快速生產(chǎn)造成巨大的經(jīng) 濟損失。因此如何有效地清除川貝母培養(yǎng)物快速生產(chǎn)中出現(xiàn)的染菌問題具有非常重要的意 義。目前所采用的解決方法一般是將染菌的材料取出后，用酒精和升汞對材料進行二次消 毒處理。由于川貝母培養(yǎng)材料細胞幼嫩，且長期生活在人工培育的優(yōu)越環(huán)境條件下，細胞抵 御外界環(huán)境的能力已降低，再次經(jīng)酒精和升汞消毒處理后，會造成培養(yǎng)材料的大量褐化、死 亡。因此，當(dāng)前在川貝母培養(yǎng)物快速生產(chǎn)過程中，一旦出現(xiàn)培養(yǎng)材料染菌后一般都是采取終 止培養(yǎng)，丟棄培養(yǎng)物，從而造成了大量的人力、物力和財力的浪費。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種川貝母培養(yǎng)物快速生產(chǎn)中的有效除菌方法，該方法既 能有效除菌，又不會造成培養(yǎng)材料褐化、死亡。為達到上述目的，本發(fā)明采用的解決方法包括下列步驟(1)染菌材料的選取定期觀察川貝母培養(yǎng)材料生長狀況，一旦肉眼觀察到材料 或培養(yǎng)基中有細菌產(chǎn)生時，即將培養(yǎng)材料取出；(2)預(yù)處理將取出的培養(yǎng)材料先用無菌水沖洗2 5次，并用無菌濾紙反復(fù)吸干 材料表面的水分，再放入頭孢噻肟鈉濃度為200 500mg -L"1的抗生素水中浸泡6 12min， 其間不停振蕩，取出后用無菌濾紙反復(fù)吸干材料表面的水分；(3)液體除菌將預(yù)處理后的材料接入含有抗生素的MS+6-BA2. Omg · L^+NAA0. 3mg · L-1+蔗糖30g · L-1液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 2周，搖床轉(zhuǎn)速100 120r · mirT1，培養(yǎng) 條件為每天光照8 12小時，光照強度為1000 16001x，溫度18 22°C，所述抗生素的種 類及濃度為頭孢噻肟鈉300mg · Γ1 800mg · Γ1或頭孢噻肟鈉150mg · Γ1 300mg · Γ1+ 頭孢曲松鈉 150mg · L-1 300mg · L-1 ；(4)第一次固體除菌取出經(jīng)液體除菌的材料，用無菌濾紙反復(fù)吸干材料表面 的水分，再接入含有與(3)步驟相同種類和濃度的抗生素的MS+6-BA 2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6. 5g · Γ1固體培養(yǎng)基中進行第一次除菌培養(yǎng)，培養(yǎng)時間 為25 30天，培養(yǎng)條件為每天光照8 12小時，光照強度為1000 16001χ，溫度18 22 0C ；(5)第二次固體除菌取出經(jīng)⑷步驟除菌后的材料，轉(zhuǎn)接入含有與⑷步驟相 同種類但濃度減半的抗生素的MS+6-BA 2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · L-1+蔗糖30g · L-1+瓊脂 6. 5g · L—1固體培養(yǎng)基中進行第二次除菌培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為25 30天，培養(yǎng)條件為每天光 照8 12小時，光照強度為1000 16001x，溫度18 22°C ；(6)除菌檢測取出經(jīng)(5)步驟除菌后的材料，轉(zhuǎn)接入無抗生素的MS+6-BA 2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6. 5g · Γ1的固體培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)， 在培養(yǎng)25 30天后觀察材料除菌情況，并統(tǒng)計除菌率，除菌率=(除菌后無菌材料數(shù)/除 菌材料總數(shù))X 100%。本發(fā)明是依據(jù)抗生素對細菌生長的抑制作用，通過采用特定的步驟而對快速生產(chǎn) 川貝母培養(yǎng)物中的染菌材料進行除菌的，所采用的頭孢噻肟鈉屬于非口服型的第三代頭孢 菌素，其作用機理是通過干擾細菌細胞壁的主要成分肽聚糖的合成來實現(xiàn)抑制細菌生長 的。所采用的具體步驟是將染菌的川貝母培養(yǎng)材料先用無菌水沖洗后放入抗生素水中浸泡 一定時間，并用濾紙吸干水份后接入含有特定種類和濃度的抗生素的液體培養(yǎng)中進行液體 除菌培養(yǎng)一定時間后，取出吸干水份再轉(zhuǎn)接入含有相同種類和濃度的抗生素的固體培養(yǎng)基 中進行第一次固體除菌培養(yǎng)，最后再轉(zhuǎn)接入含有相同種類但濃度減半的抗生素的固體培養(yǎng) 基中完成第二次固體除菌培養(yǎng)。本發(fā)明能在不傷害培養(yǎng)物的情況下有效地清除川貝母培養(yǎng) 物在快速生產(chǎn)中出現(xiàn)的細菌污染，其最高除菌率達92.7%，大大地降低了川貝母培養(yǎng)物因 染菌而造成的重大經(jīng)濟損失。
具體實施例方式實施例1(1)染菌材料的選取定期觀察川貝母培養(yǎng)材料生長狀況，一旦肉眼觀察到材料 或培養(yǎng)基中有細菌產(chǎn)生時，即將培養(yǎng)材料取出；(2)預(yù)處理將取出的培養(yǎng)材料稍作修整，然后用無菌水沖洗2 5次，并用無菌 濾紙反復(fù)吸干材料表面的水分，再放入頭孢噻肟鈉含量為400mg ·廠1的抗生素水中浸泡 lOmin，其間不停振蕩，取出后用無菌濾紙反復(fù)吸干材料表面的水分；(3)液體除菌將預(yù)處理后的材料接入含頭孢噻肟鈉300mg · Γ1和頭孢曲松鈉 150mg · Γ1 的 MS+6-BA 2. Omg · L_1+NAA 0. 3mg · Γ1+ 蔗糖 30g · Γ1 液體培養(yǎng)基中進行除菌 培養(yǎng)10天，搖床轉(zhuǎn)速100 120r · mirT1，培養(yǎng)條件為每天光照8 12小時，光照強度為 1000 16001X，溫度 18 22°C ；
(4)第一次固體除菌取出經(jīng)液體除菌的材料，用無菌濾紙反復(fù)吸干材料表面的 水分，再接入含頭孢噻肟鈉300mg Γ1和頭孢曲松鈉150mg 的MS+6-BA 2. Omg 'L^+NAA 0. 3mg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6. 5g · Γ1固體培養(yǎng)基中進行第一次除菌培養(yǎng)，培養(yǎng)時間 為25 30天，培養(yǎng)條件為每天光照8 12小時，光照強度為1000 16001χ，溫度18 22 0C ；(5)第二次固體除菌取出經(jīng)⑷步驟除菌后的材料，轉(zhuǎn)接入含頭孢噻肟鈉 150mg · L-1 禾口頭孢曲松鈉 75mg · L-1 的 MS+6-BA 2. Omg · L_1+NAA 0. 3mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 瓊脂6. 5g · L—1固體培養(yǎng)基中進行第二次除菌培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為25 30天，培養(yǎng)條件為每 天光照8 12小時，光照強度為1000 16001x，溫度18 22°C ；(6)除菌檢測取出經(jīng)(5)步驟除菌后的材料，轉(zhuǎn)接入無抗生素的MS+6-BA 2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6. 5g · Γ1的固體培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)， 培養(yǎng)25天后統(tǒng)計除菌率為92. 7%。 實施例2將實施例1中的液體培養(yǎng)基和第一次固體除菌的培養(yǎng)基中的抗生素改為頭孢噻 肟鈉600mg ·廠1，第二次固體除菌的培養(yǎng)基中的抗生素改為頭孢噻肟鈉300mg · L—1，其它步 驟同實例1，除菌率為89.4%。說明單獨使用恰當(dāng)濃度的頭孢噻肟鈉，也能實現(xiàn)對川貝母培 養(yǎng)物的有效除菌。實施例3將實例1中的液體培養(yǎng)基和第一次固體除菌的培養(yǎng)基中抗生素改為頭孢噻肟鈉 SOOmg · L—1，第二次固體除菌的培養(yǎng)基中抗生素改為頭孢噻肟鈉400mg · L、其它步驟同實 例1，除菌率為91. 9% ；但培養(yǎng)材料開始出現(xiàn)變黃、褐化現(xiàn)象，且生長明顯受到抑制，這說明 高濃度的抗生素在除菌的同時也對培養(yǎng)材料有一定的毒害作用。
權(quán)利要求
1. 一種川貝母培養(yǎng)物快速生產(chǎn)中的有效除菌方法，其特征在于包括下列步驟(1)染菌材料的選取定期觀察川貝母培養(yǎng)材料生長狀況，一旦肉眼觀察到材料或培 養(yǎng)基中有細菌產(chǎn)生時，即將培養(yǎng)材料取出；(2)預(yù)處理將取出的培養(yǎng)材料先用無菌水沖洗2 5次，并用無菌濾紙反復(fù)吸干材料 表面的水分，再放入頭孢噻肟鈉濃度為200 500mg ·廠1的抗生素水中浸泡6 12min，其 間不停振蕩，取出后用無菌濾紙反復(fù)吸干材料表面的水分；(3)液體除菌將預(yù)處理后的材料接入含有抗生素的MS+6-BA2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · L-1+蔗糖30g · L-1液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 2周，搖床轉(zhuǎn)速100 120r · mirT1，培養(yǎng) 條件為每天光照8 12小時，光照強度為1000 16001x，溫度18 22°C，所述抗生素的種 類及濃度為頭孢噻肟鈉300mg · Γ1 800mg · Γ1或頭孢噻肟鈉150mg · Γ1 300mg · Γ1+ 頭孢曲松鈉 150mg · L-1 300mg · L-1 ；(4)第一次固體除菌取出經(jīng)液體除菌的材料，用無菌濾紙反復(fù)吸干材料表面的水分， 再接入含有與⑶步驟相同種類和濃度的抗生素的MS+6-BA 2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · Γ1+ 蔗糖30g -Γ1+瓊脂6. 5g 固體培養(yǎng)基中進行第一次除菌培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為25 30天， 培養(yǎng)條件為每天光照8 12小時，光照強度為1000 16001χ，溫度18 22°C ；(5)第二次固體除菌取出經(jīng)(4)步驟除菌后的材料，轉(zhuǎn)接入含有與(4)步驟相同種類 但濃度減半的抗生素的 MS+6-BA2. Omg · L^+NAAO. 3mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 瓊脂 6. 5g · L-1 固體培養(yǎng)基中進行第二次除菌培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為25 30天，培養(yǎng)條件為每天光照8 12 小時，光照強度為1000 16001x，溫度18 22°C ；(6)除菌檢測取出經(jīng)(5)步驟除菌后的材料，轉(zhuǎn)接入無抗生素的MS+6-BA 2. Omg · L^+NAA 0. 3mg · Γ1+蔗糖30g · Γ1+瓊脂6. 5g · Γ1的固體培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)， 在培養(yǎng)25 30天后觀察材料除菌情況，并統(tǒng)計除菌率。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種川貝母培養(yǎng)物快速生產(chǎn)中的有效除菌方法，該方法主要是依據(jù)抗生素對細菌生長的抑制作用，通過采用特定的步驟而對快速生產(chǎn)川貝母培養(yǎng)物中的染菌材料進行除菌的，所采用的步驟包括染菌材料的選取→預(yù)處理→液體除菌→第一次固體除菌→第二次固體除菌→除菌檢測。本發(fā)明能在不傷害培養(yǎng)物的情況下有效地清除在川貝母培養(yǎng)物快速生產(chǎn)中出現(xiàn)的細菌污染，其最高除菌率達92.7％。
文檔編號A01N65/42GK102100177SQ201010551099
公開日2011年6月22日 申請日期2010年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月19日
發(fā)明者代勇, 代娟, 徐世軍, 李楊, 王曉蓉, 王躍華, 蔣婷婷, 蕾蕓 申請人:成都大學(xué)