專(zhuān)利名稱(chēng)：一種獲得無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因平邑甜茶植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因平邑甜茶植株的方法，特別地，是一種產(chǎn)生無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因平邑甜茶植株的方法。
背景技術(shù)：
5FgSf^ [Malus hupehensis (Pamp.) Rehd. var. pingyiensis Jiang] ^^^MiiJ 北海棠種的一個(gè)變種，是典型的具有兼性無(wú)融合生殖性狀的植物，也是我國(guó)特有蘋(píng)果砧木資源；其樹(shù)性喬化，耐蔭、抗?jié)衬芰?qiáng)，嫁接蘋(píng)果的親和力強(qiáng)，是目前蘋(píng)果生產(chǎn)中已被廣泛應(yīng)用的砧木之一。由于無(wú)融合生殖的特點(diǎn)，使得平邑甜茶的傳統(tǒng)育種較為困難，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以平邑甜茶進(jìn)行性狀改良。而在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中常常用到選擇標(biāo)記基因，它常與目的基因共轉(zhuǎn)化，在選擇壓的作用下，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞被殺死，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞由于獲得標(biāo)記基因的抗性而成活下來(lái)，并進(jìn)一步增殖分化，形成轉(zhuǎn)基因植株，這對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的獲得至關(guān)重要。但轉(zhuǎn)基因植株一旦再生成功，標(biāo)記基因便不再有用，甚至是有害的。因此培育無(wú)標(biāo)記轉(zhuǎn)基因平邑甜茶，目前已成為平邑甜茶分子育種的重要目標(biāo)，而國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有平邑甜茶這方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因平邑甜茶植株的方法，特別地，是一種產(chǎn)生無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因平邑甜茶植株的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種獲得無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因平邑甜茶植株的方法，其步驟如下A.構(gòu)建植物表達(dá)載體pl21-Cre_Gus，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，在下在含IOOmg · Γ1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)；B.將平邑甜茶組織培養(yǎng)苗在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)35天，之后在無(wú)菌條件下取組織培養(yǎng)伸展葉片，剪成面積約0. Icm2的葉盤(pán)，放在步驟A得到的培養(yǎng)物中5分鐘，然后接種在再生培養(yǎng)基上，黑暗條件培養(yǎng)下1天；C.將經(jīng)過(guò)步驟B培養(yǎng)的平邑甜茶葉盤(pán)轉(zhuǎn)接在含300mg · Γ1頭孢霉素的分化培養(yǎng)基上，在溫度(25士 1)°C下暗培養(yǎng)14天，然后置于光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度為30 μ mol · m_2 · s—1的條件下再培養(yǎng)30天，獲得轉(zhuǎn)化芽；D.將步驟C中獲得的轉(zhuǎn)化芽切下，接種在生根培養(yǎng)基上，置于光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度為30 μ mol · m_2 · s—1的條件下培養(yǎng)40天，即可完成生根；E.取步驟D中得到的轉(zhuǎn)化植株的幼葉進(jìn)行PCR和⑶S鑒定獲得轉(zhuǎn)基因植株；F.將步驟D中得到的轉(zhuǎn)基因植株置于42°C下熱處理15分鐘，再取其幼葉進(jìn)行進(jìn)一步PCR鑒定，獲得無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因平邑甜茶植株。所述平邑甜茶的組織培養(yǎng)苗可以按照以下步驟得到初春采平邑甜茶一年生枝條，水培養(yǎng)10天左右，取枝條上飽滿的芽，流水沖洗3小時(shí)，用0. 的升汞(HgCl2)處理6分鐘，無(wú)菌水沖洗6次，用無(wú)菌吸水紙吸干殘留水分，將芽接種到初代培養(yǎng)基上；在接種后的第二天開(kāi)始有部分材料開(kāi)始褐化，一旦發(fā)現(xiàn)有褐化的材料，馬上更換為新的初代培養(yǎng)基， 直到褐化消除；接種10天時(shí)，飽滿的芽都開(kāi)始萌發(fā)，40天時(shí)長(zhǎng)成約4cm左右的組培苗。所述將植物表達(dá)載體pl21-Cre-Gus轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404可以按照以下步驟操作a.分別取5-10 μ L的載體pl21-Cre_Gus和100 μ L根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)LBA4404加在1. 5uL的離心管中，混勻，冰上放置30分鐘；b.液氮中速凍2-3分鐘，37°C水浴3分鐘；c.再加入800LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)，在條件下，180轉(zhuǎn)培養(yǎng)2_4小時(shí)；d.然后5000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，離心管底部留IOOuL,混勻涂布在含IOOmg · L—1
卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上；e.挑出長(zhǎng)出的單菌落，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的根癌農(nóng)桿菌LBA4404即可轉(zhuǎn)化植物材料。所述LB液體培養(yǎng)基為IOmg化―1蛋白胨、5mg化―1酵母提取物、IOmg -L^1NaCl,pH7. 0
的培養(yǎng)基。所述LB固體培養(yǎng)基為IOmg · L—1蛋白胨、5mg · L—1酵母提取物、IOmg · L^1NaCl, 6. 5mg · Γ1瓊脂粉，pH7. 0的培養(yǎng)基。所述初代培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1瓊脂粉、
1.Omg · L、-芐基腺嘌呤(6-benzyladenine)和 0. 2mg · Γ1 吲哚丁酸(indole-3-butyric acid)，pH5.6的培養(yǎng)基。所述繼代培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1瓊脂粉、 0. 3mg · L、-芐基腺嘌呤和 0. Img · Γ1 萘乙酸(naphthalene-acetic acid)，ρΗ5· 6 的培養(yǎng)基；所述再生培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1瓊脂粉、
2.Omg · L-1N-苯基-N，-1,2, 3-噻二唑-5-脲和 0. 2mg · L-1 吲哚丁酸，ρΗ5· 6 的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1瓊脂粉、 300mg · Γ1頭孢霉素、5mg · Γ1卡那霉素、2. Omg · Ι^Ν-苯基-N，-1，2，3-噻二唑-5-脲和 0. 2mg · L-1吲哚丁酸，ρΗ5· 6的培養(yǎng)基；所述生根培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1瓊脂粉和 0. 4mg · L-1吲哚丁酸，ρΗ5· 6的培養(yǎng)基。所述MS基本培養(yǎng)基的配方如下，其中各組分單位為mg · L—1
權(quán)利要求
1.一種獲得無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因平邑甜茶植株的方法，其特征在于，步驟如下A.構(gòu)建植物表達(dá)載體pl21-Cre-Gus，轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，在觀°C下在含 IOOmg · Γ1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)；B.將平邑甜茶的組織培養(yǎng)苗在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)35天，之后在無(wú)菌條件下取組織培養(yǎng)伸展葉片，剪成面積約0. Icm2的葉盤(pán)，放在步驟A得到的培養(yǎng)物中5分鐘，然后接種在再生培養(yǎng)基上，黑暗條件培養(yǎng)下1天；C.將經(jīng)過(guò)步驟B培養(yǎng)的平邑甜茶葉盤(pán)轉(zhuǎn)接在含300mg· Γ1頭孢霉素的分化培養(yǎng)基上， 在溫度(25士 1) ！下暗培養(yǎng)14天，然后置于光周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度為 30 μ mol · πΓ2 · s—1的條件下再培養(yǎng)30天，獲得轉(zhuǎn)化芽；D.將步驟C中獲得的轉(zhuǎn)化芽切下，接種在生根培養(yǎng)基上，置于光周期為16小時(shí)光照/8 小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度為30 μ mol · m_2 · s—1的條件下培養(yǎng)40天，即可完成生根；E.取步驟D中得到的轉(zhuǎn)基因植株的幼葉進(jìn)行PCR和GUS鑒定；F.將步驟D中得到的轉(zhuǎn)基因植株置于42°C下熱處理15分鐘，再取其幼葉進(jìn)行進(jìn)一步 PCR鑒定，獲得無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因平邑甜茶植株；所述植物表達(dá)載體pl21-Cre-Gus的序列如序列表SEQ ID :No. 1所示；所述繼代培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1瓊脂粉、 0. 3mg · ^6-芐基腺嘌呤和0. Img · L—1萘乙酸，pH5. 6的培養(yǎng)基；所述再生培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1瓊脂粉、 2. Omg · L-1N-苯基-N，-1,2, 3-噻二唑-5-脲和 0. 2mg · L-1 吲哚丁酸，ρΗ5· 6 的培養(yǎng)基；所述分化培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1瓊脂粉、 300mg · Γ1頭孢霉素、5mg · Γ1卡那霉素、2. Omg · Ι^Ν-苯基-N，-1，2，3-噻二唑-5-脲和 0. 2mg · L-1吲哚丁酸，ρΗ5· 6的培養(yǎng)基；所述生根培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中附加30mg · Γ1蔗糖、6. 5mg · Γ1瓊脂粉和 0. 4mg · L-1吲哚丁酸，ρΗ5· 6的培養(yǎng)基。
2.一種用于獲得無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因平邑甜茶植株的方法中的植物表達(dá)載體 pl21-Cre-Gus，其特征在于，其序列如序列表SEQ ID :No. 1所示。
全文摘要
一種獲得無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因平邑甜茶植株的方法，是將攜帶表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌在含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)后備用；將平邑甜茶組培苗在繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)35天，取伸展葉片剪成葉盤(pán)，置備用培養(yǎng)物中5分鐘，后接種在再生培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)1天；將葉盤(pán)轉(zhuǎn)接在含頭孢霉素的分化培養(yǎng)基上，(25±1)℃下暗培養(yǎng)14天，后置光周期16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度30μmol·m-2·s-1下培養(yǎng)30天，將獲得的不定芽切下，接種在生根培養(yǎng)基上，置光周期16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗、光照強(qiáng)度30μmol·m-2·s-1下培養(yǎng)40天生根；42℃下熱處理15分鐘，進(jìn)一步鑒定后獲得無(wú)選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因平邑甜茶植株。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102191268SQ20111006953
公開(kāi)日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月22日
發(fā)明者劉松忠, 張強(qiáng), 王媛花, 金萬(wàn)梅 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院