利用過表達(dá)hoxa10基因制備轉(zhuǎn)基因豬的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于豬轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用過表達(dá)H0XA10基因制備轉(zhuǎn)基 因豬的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 養(yǎng)豬業(yè)是畜牧業(yè)生產(chǎn)體系的重要組成部分，在畜牧行業(yè)中占有舉足輕重的地位。 對于養(yǎng)豬生產(chǎn)者來說，豬繁殖性狀特別是產(chǎn)仔數(shù)是影響生產(chǎn)效益的重要因素之一。但由于 產(chǎn)仔數(shù)性狀受到受精率、排卵率、胚胎著床等多種因素的影響，同時還是低遺傳力性狀，遺 傳力僅為0. 10-0. 15,通過傳統(tǒng)的選育方法進(jìn)行改良，進(jìn)展緩慢、收效甚微。雖然產(chǎn)仔數(shù)遺傳 改良難度大，但因其經(jīng)濟(jì)效益高，開發(fā)利用新的遺傳改良技術(shù)尤為重要。
[0003] 從上世紀(jì)80年代起，轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅速。在生物育種方面，相對于傳統(tǒng)技術(shù)， 使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可使育種年限大大縮短。因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)為提高母豬繁殖性能與遺傳改 良提供了新思路以及新途徑。但在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高母豬繁殖數(shù)性能的過程中，選擇影 響母豬繁殖性能的主效基因是最為關(guān)鍵的一環(huán)，因此對所選基因的功能鑒定則顯得十分重 要。
[0004] 在人與小鼠中，同源異形框基因H0XA10 (HomoboxlO)已被多次報道與子 宮內(nèi)膜容受性（TaylorHSetal.，HOXgeneexpressionisalteredinthe endometriumofwomenwithendometriosis.Hum.Reprod1999,14(5):1328-1331 ； BagotCNetal.,:MaternalHoxalOisrequiredforpinopodformationin thedevelopmentofmouseuterinereceptivitytoembryoimplantation. DevelopmentalDynamics2001，222，（3) :538-544)、胚胎附植(TaylorHS:Therole ofHOXgenesinhumanimplantation.Hum.Reprod, 2000, 6(1) :75-79：HyuniungLim etal. ,Hoxa-10RegulatesUterineStromalCellResponsivenesstoProgesterone duringImplantationandDecidualizationintheMouse.MolecularEndocrinology June1999, 13 (6): 1005-1017)和胚胎發(fā)育（LeoFetal.，：Regulationoftryptophan 2,3-dioxygenasebyHOXA10enhancesembryoviabilitythroughserotonin signaling.EndocrinologyandMetabolim2011，300(1) :86_93)等繁殖性狀相關(guān)D 本 實(shí)驗(yàn)室對該基因的部分功能進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)H0XA10基因在豬（Genebank登錄號為 JN836599)與人（GenBank登錄號為NM_018951)和小鼠（GenBank登錄號為NM_008263)中 高度保守，并且豬H0XA10基因的表達(dá)與母豬子宮內(nèi)膜的功能相關(guān)；同時通過孕激素處理 妊娠小鼠，發(fā)現(xiàn)H0XA10基因表達(dá)量上調(diào)時，小鼠的胚胎著床數(shù)上升，驗(yàn)證了H0XA10基因?qū)?胎附植具有重要作用（WuDetal. ,Molecularcharacterizationandidentification oftheE2/P4responseelementintheporcineHOXAlOgene.MolCellBiochem 2013, 374:213-222)。因而，豬H0XA10作為與繁殖性狀密切相關(guān)的候選基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)H0XA10 基因豬模型，從個體水平上進(jìn)一步研究其作用機(jī)理并用于提高豬繁殖性能顯得十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種利用過表達(dá)H0XA10基因制備 轉(zhuǎn)基豬的方法。本發(fā)明以豬H0XA10基因?yàn)檠绣硨ο螅趥鹘y(tǒng)克隆技術(shù)，利用本實(shí)驗(yàn)前期 構(gòu)建的雌激素誘導(dǎo)型啟動子載體質(zhì)粒pc3. 1-H0XA10-DNA轉(zhuǎn)染大白豬胎兒成纖維細(xì)胞，通 過G418篩選，PCR鑒定轉(zhuǎn)H0XA10基因細(xì)胞系，然后將所建立的PCR陽性轉(zhuǎn)H0XA10基因細(xì)胞 系用于手工核移植，共移植5頭受體母豬，其中3頭受孕，最后通過PCR、RT-PCR、染色體步 移技術(shù)檢測H0XA10基因的表達(dá)證實(shí)獲得H0XA10的轉(zhuǎn)基因克隆豬。該轉(zhuǎn)基因豬可用于研宄 H0XA10對母豬繁殖性能的影響并提供動物模型，以及培育具有高繁殖性能的優(yōu)良品種豬。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：
[0007] 1、構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)H0XA10基因的豬成纖維細(xì)胞系：
[0008] 1. 1線性化pc3. 1-H0XA10-DNA載體：將本申請人所在的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育 種與繁殖實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建的pc3. 1-H0XA10-DNA質(zhì)粒（見序列表SEQIDNO:l、圖1)DNA 采用Bglll單酶切進(jìn)行線性化處理。
[0009] 1. 2建立大白豬胎兒成纖維細(xì)胞系：采用胰酶消化法消化33日齡的大白豬胎兒， 分離得到的大白豬胎兒成纖維細(xì)胞置于細(xì)胞液中在38. 5°C、5%C02、100%濕度的培養(yǎng)箱中 進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0010] 1.3建立轉(zhuǎn)H0XA10基因細(xì)胞系：利用Y染色體特異基因SRY序列（Genebank 登錄號：U49860)設(shè)計引物來鑒定大白豬胎兒成纖維細(xì)胞的性別，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選取不 同性別的大白豬胎兒成纖維細(xì)胞作為受體細(xì)胞，利用Invitrogen公司生產(chǎn)的脂質(zhì)體 Lipofectamine?2000(貨號：11668-019)將pc3. 1-H0XA10-DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入受體細(xì)胞。轉(zhuǎn) 染24小時后利用800yg/mlG418進(jìn)行篩選。連續(xù)篩選7-8天后將G418濃度逐漸降低至 200yg/ml并維持培養(yǎng)，最終獲得抗性單克隆細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)。隨后通過PCR對獲得的單克 隆細(xì)胞進(jìn)行鑒定，得到轉(zhuǎn)H0XA10基因的陽性細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0011] 2、轉(zhuǎn)H0XA10基因克隆胚胎的制備
[0012] 2. 1豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)：從屠宰場收集豬的卵巢置于37°C生理鹽水中，2小 時內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。采用帶有18號針頭的10ml-次性注射器采集3-6_卵泡中的卵泡液并 放入15ml離心管中，靜止10分鐘后棄去上清，用采卵液（名稱PVA-TL-HEPES，配方：稱取聚 乙烯醇 0?lg，NaCl6. 6633g，KCl0? 2386g，NaH2P040. 0408g，NaHC030. 168g，羥乙基哌嗪乙硫 磺酸Ifepes2. 383g，酚紅0. 0022g，山梨醣醇2. 186g，丙酮酸鈉0. 022g，乳酸鈉1. 868ml，青 霉素GO. 065g，硫酸鏈霉素 0? 025g，MgCl2 ? 6H20 0? 1017g，CaCl2 ? 2H200. 294g，用雙蒸水定 容至100ml，并將pH調(diào)至7. 4)洗兩遍。在顯微鏡下挑選形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞質(zhì)均勻，外圍有3-5 層卵丘細(xì)胞緊密包裹的卵丘細(xì)胞-卵母細(xì)胞復(fù)合體（簡稱COCs)置于38. 5°C、5%C02、飽和 濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42-44小時，隨后用透明質(zhì)酸酶消化，吹打成裸卵，以第一極體排出為 豬卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)準(zhǔn)。豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液配方：基礎(chǔ)培養(yǎng)液為培養(yǎng)基Mediuml99(購 自Gibco公司），在其中添加10% (體積比）豬卵泡液（PFF)，0? 1%聚乙烯醇（PVA，）30mM NaHC03,10yg/ml慶大霉素（Gentamicin)，3. 05mMD-葡萄糖（D-Glucose)，0? 91mM丙酬酸 鈉（Na-pyruvate)，0? 07g/LL-胱氨酸鹽酸鹽（L-cystine)，12. 5ng/ml表皮生長因子（EGF lOIU/ml促黃體生成素（LH)，lOIU/ml促卵泡生成素（FSH)。
[0013] 2. 2卵母細(xì)胞去核與移核：按照Lai等人報道的方法（LaiLX，Prather RS:ProductionofClonedPigsbyUsingSomaticCellsasDonors.Clonedandstem cells2003, 5(4) :233-2405)，將豬的卵母細(xì)胞置于顯微操作盤工作滴中，隨后將固定針 (Holder)固定住卵母細(xì)胞，注射針（injection)針尖快速刺破透明帶后收針，輕柔地破開 細(xì)胞膜，然后緩慢回針，使針口正對極體且位于透明帶間隙內(nèi)，緩緩吸取1/5-1/4的細(xì)胞質(zhì) 并同時吸走極體，沿橫軸方向快速出針，迅速推動油壓泵，使吸取物順著透明帶涌出。利用 胰酶將用于移核的細(xì)胞消化并置于顯微操作盤中，將顯微操作針調(diào)節(jié)到最佳位置，選取中 等大小、活力較好的細(xì)胞約30-50個吸入injection中。Holder固定胚胎后，調(diào)節(jié)焦距， 使胚胎與injection在同一平面，稍微給injection-點(diǎn)向外打細(xì)胞的力，待細(xì)胞將要出 injection