專利名稱：提高突變頻率和突變譜的植物誘變育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及誘變育種技術(shù)，特別是一種提高突變頻率和突變譜的植物誘變育種方法。
背景技術(shù)：
用輻射誘變技術(shù)進(jìn)行新品種選育，已有許多報(bào)道，這種方法育種雖有不少成功的先例，但方法費(fèi)工費(fèi)時(shí)，育種效率較低，特別是對(duì)于無性繁殖植物的誘變育種，由于隱性突變難以顯現(xiàn)出來，因此獲得目標(biāo)突變個(gè)體的概率非常低。無性繁殖植物誘變育種的特點(diǎn)就一般而言，基因發(fā)生顯性突變，當(dāng)代就會(huì)表現(xiàn)出來，形成嵌合體。但Y射線誘發(fā)的基因突變一般隱性突變居多，顯性突變僅為少量，用Y 射線輻射誘變處理種子繁殖植物時(shí)，篩選隱性突變必須經(jīng)過自交，使隱性突變?cè)谄浜蟠邪匆欢ū壤_(dá)到純合，在形成純合系之后，突變性狀才能顯現(xiàn)，因此其突變性狀也只能在M2 代才能進(jìn)行篩選。然而對(duì)于無性繁殖植物(如甘薯的營(yíng)養(yǎng)器官或外植體)長(zhǎng)成植株后，其無性第一代大量隱性突變不能顯現(xiàn)，無性系第二代不經(jīng)過雌雄配子結(jié)合，隱性突變的位點(diǎn)因不能純合，故突變形狀也不能表現(xiàn)出來。這是因?yàn)殡[性突變基因被顯性基因所掩蓋。加之一般誘發(fā)的總突變率本來就很低(只有千分之幾)，因此，對(duì)于無性繁殖植物的誘變育種效率往往難以提高。誘發(fā)體細(xì)胞的類減數(shù)分裂現(xiàn)象，最早是由Huskings等(1 Huskings C L. Segregation and reduction in somatic tissues 1 Initial observation on Alliumc 印 a. The journal of Hereditty. 1948，39 :311_325)報(bào)道的，他們利用核酸的鈉鹽對(duì)洋蔥的根進(jìn)行處理并發(fā)現(xiàn)洋蔥根尖細(xì)胞存在染色體減數(shù)現(xiàn)象，洋蔥染色體數(shù)為2η =16，分裂中的細(xì)胞染色體發(fā)生8 8分離的情況(約占2% )，Mehra等(Mehra PN, Dhiman N. Induced meiotic reductionin root tips 1 Effect of purine derivatives. Cytologia 1986,51 :439_448)用咖啡因處理Pterotheca(同義詞Cr印is為還陽參屬植物)的根尖細(xì)胞發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)體細(xì)胞染色體減數(shù)發(fā)生，Ronchi 等(R O nchi VN, GiorgctyL, TonclliM, MartiniG, 1992 Plani Cell, Tissue and organ Culture, R onchi VN, GiorgctyL, TonclliM, Marti 幾 iG, I, 92Plant Cell, Tissue and organ Culture, 30 :15 19)對(duì)胡蘿卜胚性細(xì)胞系用細(xì)胞光度儀分析發(fā)現(xiàn)，在單個(gè)細(xì)胞中DNA含量總是存在著消減現(xiàn)象，表明胚性細(xì)胞系中總存在一定數(shù)量的單倍體細(xì)胞；通過細(xì)胞學(xué)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞分裂相中，總有一定比例的細(xì)胞染色體為半數(shù)，因此，Ronchi等提出一個(gè)嶄新的觀點(diǎn)認(rèn)為，體細(xì)胞類減數(shù)分裂可能為體細(xì)胞胚胎發(fā)生前基因組重組所必須，可能是體細(xì)胞胚胎發(fā)生的前提。(張麗華、陳一華、陳正華等，核酸類似物誘導(dǎo)蠶豆高頻率類減數(shù)分裂，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)Journal of Agricultural Biotechnology 2000,8(2) 147-150 ；陳一華、陳正華，植物離體培養(yǎng)細(xì)胞的類減數(shù)分裂， 遺傳HEREDITAS(Bci]ing)18(6) :32 361996。)用咖啡因等核酸類似物對(duì)蠶豆種子根尖進(jìn)行處理，建立了高頻率類減數(shù)分裂發(fā)生體系，觀察了種子根尖體細(xì)胞類減數(shù)分裂的方式與類型，認(rèn)為體細(xì)胞類減數(shù)分裂可以為人工所誘導(dǎo)。但眾多學(xué)者雖都研究了這一現(xiàn)象，至今并見將體細(xì)胞類減數(shù)分裂誘導(dǎo)及其胚胎發(fā)生的體系用于培育新品種得報(bào)道。體細(xì)胞類 減數(shù)分裂的機(jī)理及其誘導(dǎo)采用體細(xì)胞類減數(shù)分裂的誘導(dǎo)技術(shù)就可能使無性繁殖植物誘發(fā)產(chǎn)生的隱性突變能夠在再生的無性后代中顯現(xiàn)出來。體細(xì)胞類減數(shù)分裂多在離體培養(yǎng)下誘導(dǎo)發(fā)生，它屬于體細(xì)胞無性系變異的一種類型。所謂體細(xì)胞無性系變異(somaclonal variation)是指在離體培養(yǎng)中培養(yǎng)的外植體在脫分化增殖和再生過程中產(chǎn)生的可遺傳的變異，已用這種方法進(jìn)行了多種作物的新品種選育，如水稻、小麥、玉米、菊花、草莓等植物，都已有育種成功的報(bào)道。對(duì)其機(jī)理的研究，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由激素，特別是 2，4-D等激素引起基因或染色體突變的結(jié)果。而且也有報(bào)道表明，有些單一性狀的變異在有性繁殖后代中不會(huì)再發(fā)生分離，如凌定厚等在水稻體細(xì)胞無性系變異中，發(fā)現(xiàn)多種性狀都產(chǎn)生了純合遺傳現(xiàn)象，在有性繁殖后代中沒有發(fā)生分離，但他們并未揭示純合遺傳發(fā)生的機(jī)理，也并未將這種現(xiàn)象與細(xì)胞染色體類減數(shù)分裂聯(lián)系起來。眾所周知，減數(shù)分裂是高等植物在有性生殖過程中產(chǎn)生配子時(shí)發(fā)生的基本生物學(xué)現(xiàn)象，與雌雄配子發(fā)生過程相關(guān)聯(lián)。但有報(bào)道表明，在離體誘導(dǎo)細(xì)胞脫分化以及體細(xì)胞胚胎發(fā)生的系統(tǒng)中，也存在著一定數(shù)量與配子形成類似的減數(shù)分裂現(xiàn)象(因這一過程不太規(guī)則，故稱為“類減數(shù)分裂現(xiàn)象”)。甘薯是一種高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、營(yíng)養(yǎng)豐富、用途廣泛的農(nóng)作物，既是重要的糧食作物，又是良好的飼料作物，也是工業(yè)原料作物，又可作為觀賞植物。近年來，甘薯作為天然綠色食品其獨(dú)特的保健功能逐漸被人們認(rèn)識(shí)，在許多發(fā)達(dá)國家，都將甘薯作為保健食品。隨著甘薯用途的多樣化，不同類型、不同用途甘薯新品種選育取得了明顯進(jìn)展，如高淀粉(工業(yè)用)甘薯品種、紫肉(高花青素)甘薯品種、桔紅肉(高胡蘿卜素)甘薯品種、高蛋白(飼用)甘薯品種、水果用甘薯品種、菜用甘薯新品種、觀賞品種(金葉薯)選育都取得了明顯進(jìn)展。 因此，甘薯的栽培面積日益擴(kuò)大，種植區(qū)域也不斷向北方延伸，在寒冷的北方篩選出抗逆性 (抗寒、抗鹽堿性強(qiáng)的)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)甘薯品種，顯得十分重要；同時(shí)，對(duì)北方地區(qū)農(nóng)村種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整尤為重要。如何通過誘變育種方法提高甘薯突變頻率并獲得更多的突變個(gè)體，從中篩選出具有目標(biāo)抗性品質(zhì)的新品種，目前也未見到報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)無性繁殖植物的誘變育種過程中存在的問題，提供一種提高突變頻率和突變譜的植物誘變育種方法，可在較短時(shí)間內(nèi)離體篩選大量材料，獲得單細(xì)胞起源的純合抗逆突變體，明顯縮短了育種周期，使選擇效率大大提高。提高突變頻率和突變譜的植物誘變育種方法，其步驟如下(1)誘變對(duì)胚性細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，然后繼代擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)誘導(dǎo)類減數(shù)分裂對(duì)誘變處理、繼代擴(kuò)大培養(yǎng)得到細(xì)胞進(jìn)行類減數(shù)分裂誘導(dǎo)；(3)自然加倍獲得突變純合體細(xì)胞，結(jié)合育種目標(biāo)與突變性狀篩選突變純合體。步驟(2)誘導(dǎo)類減數(shù)分裂，指采用含40 60mmol/L嘌呤類核苷或尿嘧啶核苷的 MS液體培養(yǎng)基浸泡誘變處理后的胚性細(xì)胞2小時(shí)、恢復(fù)20 40小時(shí)，繼代擴(kuò)大培養(yǎng)得到類減數(shù)分裂細(xì)胞。步驟⑴誘變，指采用鈷60-Y射線輻照處理胚性細(xì)胞，輻射劑量為出現(xiàn)愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的劑量。
所述輻射劑量為20 30Gy，劑量率為每分鐘IOGy/分鐘。所述植物指甘薯。 所述胚性細(xì)胞的制備包括植物材料脫分化，然后繼代擴(kuò)大培養(yǎng)；所述脫分化培養(yǎng)基為MS+2，4-D 0. 5-2mg/L+6-BA 0. 5_2mg/L+lAA 0. 5_2mg/L+N0A0. 5_2mg/L、蔗糖 3%。所述繼代擴(kuò)大培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為MS+2，4-D 0. 05-0. 2mg/L+6_BA 0. 5-lmg/ L+KTO. 5-lmg/L+NOAO. 5-lmg/L+IAAO. 5-lmg/L+TDZO. 5mg/L。所述脫分化培養(yǎng)基為2，4-D0.5mg/L+6-BA 0. 5mg/L+lAA 0. 5mg/L+N0A 0. 5mg/L, 蔗糖3%。步驟(2)中，選擇經(jīng)誘變處理、繼代擴(kuò)大培養(yǎng)后且處于旺盛分裂期的細(xì)胞進(jìn)行類減數(shù)分裂誘導(dǎo)。所述篩選突變純合體指對(duì)突變純合體施加低溫，高溫和/或高鹽堿逆境選擇壓， 然后篩選出逆境條件下能夠存活下來的個(gè)體。本發(fā)明將人們發(fā)現(xiàn)的體細(xì)胞離體培養(yǎng)繁殖過程中的類減數(shù)分裂現(xiàn)象結(jié)合人工輻射誘變技術(shù)，應(yīng)用到誘變育種技術(shù)中，顯著提高了無性繁殖材料育種過程中，對(duì)隱形突變個(gè)體的獲得率。此前，沒有見到這種提高突變育種效率和突變個(gè)體獲得率的育種方法。本發(fā)明的育種方法的完整技術(shù)路線主要包括(1)制備胚性細(xì)胞_(2)誘變_(3) 誘導(dǎo)類減數(shù)分裂-(4)篩選突變純合體，四個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)于提高突變頻率和突變個(gè)體的獲得率，對(duì)胚性細(xì)胞進(jìn)行誘變和誘導(dǎo)類減數(shù)分裂兩步是必不可少的環(huán)節(jié)。該技術(shù)路線可適于多種植物的誘變育種，只是針對(duì)不同植物的誘變育種時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其掌握的常識(shí)結(jié)合本發(fā)明的描述，可以調(diào)整制備胚性細(xì)胞，誘變，誘導(dǎo)類減數(shù)分裂所采用的具體方式，試劑和參數(shù)，然而都可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的一提高誘變育種中的突變個(gè)體的獲得率，縮短育種周期。本發(fā)明中優(yōu)選采用嘌呤類核苷和/或尿嘧啶作為類減數(shù)分裂誘導(dǎo)劑。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)劑處理濃度，處理時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間均影響誘導(dǎo)率。本發(fā)明的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用40 60mmol/L的嘌呤類核苷或尿嘧啶對(duì)誘變處理后的細(xì)胞進(jìn)行處理2 3小時(shí)、恢復(fù)20 40 小時(shí)的有絲分裂和類減數(shù)分裂誘導(dǎo)率最高，分析原因可能是，獲得高頻率的處于旺盛分裂期的細(xì)胞是獲得高頻率的類減數(shù)分裂的前提。本發(fā)明的誘變育種方法中，優(yōu)選采用鈷60- Y射線輻照處理胚性細(xì)胞，輻射劑量為出現(xiàn)愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的劑量，這樣的劑量能夠獲得最多的突變，選擇的機(jī)率多， 有可能選到所期望的突變苗。對(duì)于不同的植物，可能選擇不同的對(duì)于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所述60-Y射線的輻射劑量為20 30Gy能夠獲得較多的突變又不至于抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。為了獲得較好的誘變效果，必須誘導(dǎo)體細(xì)胞脫分化，建立胚性細(xì)胞團(tuán)大量發(fā)生，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備獲得大量的胚性細(xì)胞。本發(fā)明的甘薯誘變育種中，提供了一種誘導(dǎo)效果非常好的新的脫分化培養(yǎng)基配方MS+2，4-D 0. 5-2mg/L+6-BA 0. 5_2mg/ L+1AA0. 5-2mg/L+N0A0. 5_2mg/L、蔗糖3%的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上15-20天。能夠獲得高達(dá)68%的胚性細(xì)胞。還提供了胚性細(xì)胞和誘變處理后的細(xì)胞均適用的繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方 MS+2,4-D0. 05-0. 2mg/L+6_BA 0. 5-lmg/L+KT 0. 5-lmg/L+NOAO. 5-lmg/L+IAAO. 5-lmg/L+TDZO. 5mg/L蔗糖3%的培養(yǎng)基，進(jìn)行繼代培養(yǎng)15-20天， 在本發(fā)明所建立的體細(xì)胞類減數(shù)分裂誘導(dǎo)體系中，注意到材料狀態(tài)、誘導(dǎo)劑的濃度、材料處理的時(shí)間、和被處理材料的恢復(fù)時(shí)間4個(gè)因素都會(huì)影響到類減數(shù)分裂效率，只有在這4個(gè)因素相互之間調(diào)整到最佳狀態(tài)時(shí)，才能獲得高頻率的處于旺盛分類期的有絲分裂細(xì)胞及類減數(shù)分裂頻率才能達(dá)到較高水平，在本發(fā)明中獲得的類減數(shù)分裂頻率可達(dá)50%左右(觀察到的減數(shù)分裂相的細(xì)胞數(shù)/觀察有絲分裂相細(xì)胞總數(shù))。因此，用于類減數(shù)分裂誘導(dǎo)的細(xì)胞，優(yōu)選選擇處于旺盛分裂期的誘變細(xì)胞。綜上所述，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的不同之處在于，將體細(xì)胞類減數(shù)分裂誘導(dǎo)及其胚性發(fā)生的體系與體細(xì)胞誘變相結(jié)合，使隱性突變達(dá)到純和，并進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新。為了提高無性繁殖植物的突變頻率和突變譜，以進(jìn)一步提高育種效率，本發(fā)明利用較為成熟的誘變因子_不同劑量的鈷60- γ射線輻照處理，其總劑量?jī)?yōu)選為20 30Gy， 劑量率為IOGy/分鐘。而經(jīng)過輻射誘變打破原有遺傳背景，創(chuàng)造新的遺傳基因突變，這已被國內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)成為重要的育種手段之一。且鑒于這一技術(shù)誘發(fā)的隱性突變居多，為此，本發(fā)明采用較高濃度激素促進(jìn)體細(xì)胞脫分化，結(jié)合采用核苷酸及其類似物等處理體細(xì)胞，誘發(fā)體細(xì)胞類減數(shù)分裂，使經(jīng)Y射線輻照產(chǎn)生的隱性突變，在減數(shù)分裂細(xì)胞的染色體加倍中達(dá)到純合，由于胚狀體為單細(xì)胞來源，這些來源于胚狀體的植株產(chǎn)生的隱性突變性狀便可在其以無性繁世代中表現(xiàn)出來，從而增加突變表型。一般激素引起的細(xì)胞無性系變異的頻率也不過1-5%。。而加上γ射線輻照誘發(fā)、以及體細(xì)胞類減數(shù)分裂誘導(dǎo)，突變頻率提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，使選擇效率大大提高(用本發(fā)明所述的方法能顯著提高突變頻率，可達(dá)到10% 以上)。且可在較短時(shí)間內(nèi)離體篩選大量材料，獲得單細(xì)胞起源的純合抗逆突變體。本發(fā)明的有益效果總結(jié)1.本發(fā)明獲得的突變效率高于一般誘變育種因通過輻射育種誘導(dǎo)出大量變異 (包括顯性、隱性突變)，同時(shí)，通過離體培養(yǎng)，也誘導(dǎo)了體細(xì)胞無性系變異，突變來自雙重的作用因子。2.本技術(shù)對(duì)無性繁殖和種子繁殖植物都會(huì)使顯、隱性突變同時(shí)顯現(xiàn)由于類減數(shù)分裂的誘導(dǎo)，可大大地加速育種程序，提高育種效率。對(duì)無性繁殖植物而言，可能在其繁殖的無性后代中，顯性及隱性突變同時(shí)顯現(xiàn)，大大地提高了突變頻率，提高選擇幾率，而一般輻射育種是不可能達(dá)到這種效果的。對(duì)種子植物而言，由于誘導(dǎo)類減數(shù)分裂的效果，可能產(chǎn)生純合遺傳，即不僅可能提早一年(在Ml代)選擇出目標(biāo)性狀，而且后代也不會(huì)再分離?？稍诙虝r(shí)間內(nèi)篩選有利的突變體。3.篩選是在細(xì)胞水平上進(jìn)行，其優(yōu)點(diǎn)是大大地節(jié)約了人力物力一般篩選是在個(gè)體水平上進(jìn)行，不僅費(fèi)時(shí)，而且費(fèi)工，占據(jù)很大面積，而且選擇效率低下，容易受到多種因素的干擾。而離體培養(yǎng)篩選條件控制嚴(yán)格，不僅省時(shí)、省力，而且篩選效果可靠，結(jié)果可信。4.胚胎發(fā)生是單細(xì)胞事件，來自胚狀體的植株不會(huì)是嵌合體由于植株來源于單細(xì)胞，無性繁殖的個(gè)體間，大都攜帶有突變的抗逆基因、無性后代應(yīng)該是均勻一致的。而一般誘變育種，無性繁殖植物變異的出現(xiàn)都是以嵌合狀態(tài)存在，經(jīng)無性繁殖后，則會(huì)發(fā)生無性分離現(xiàn)象，無性后代是不均勻一致的，往往難以應(yīng)用。


圖1.本發(fā)明誘變育種方法的流程示意圖。
具體實(shí)施例方式通過下面的實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。實(shí)施例1 甘薯胚性細(xì)胞團(tuán)大量發(fā)生1. 1.材料和方法1. 1. 1.甘薯無菌苗的誘導(dǎo)材料MS培養(yǎng)基,Murashige T and Skoog F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. (1962)Physiol Plant 15(3) :473_497.試劑2,4-D (2,4- 二氯苯氧乙酸)北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司BA (6-芐基腺嘌呤)北京九州同業(yè)生物科技有限公司IAA (吲哚乙酸)北京九州同業(yè)生物科技有限公司NOA (萘氧乙酸)北京九州同業(yè)生物科技有限公司ΝΑΑ( α -萘乙酸)北京九州同業(yè)生物科技有限公司ΚΤ、(激動(dòng)素)北京九州同業(yè)生物科技有限公司多效唑北京九州同業(yè)生物科技有限公司GA3(赤霉素)北京九州同業(yè)生物科技有限公司TDZ (塞苯隆)北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司以甘薯的薯塊為材料，去皮后，進(jìn)行表面滅菌，先放入0. 1 %的洗衣粉溶液中漂洗 15分鐘，自來水連續(xù)沖洗3小時(shí)，用70%的酒精消毒半分鐘，然后在0. 1% HgC12溶液中消毒8分鐘，取出用無菌水沖洗5次后，用無菌濾紙吸干，然后切塊進(jìn)行培養(yǎng)。待生出無菌苗后。剝?nèi)￠L(zhǎng)約l_2mm的莖尖分生組織，取生長(zhǎng)旺盛、長(zhǎng)約2cm的莖尖，在無菌條件下用刀切割成3-5毫米左右的葉塊，置入以下其中一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織。培養(yǎng)基配方是MS+2，4-D 2mg/L+6_BA 2mg/L+lAA 2mg/L+N0A2mg/LMS+2，4-D 0. 5mg/L+6_BA 0. 5mg/L+lAA 0. 5mg/L+N0A 0. 5/L。1. 1. 2.培養(yǎng)條件材料接種后，在25°C、黑暗下培養(yǎng)3 4周后，將誘導(dǎo)得到的愈傷組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，愈傷組織和莖尖培養(yǎng)條件為25-28°C及每日12h、20001x光照。1. 2.結(jié)果1. 2. 1.甘薯胚性愈傷組織的形成和胚性細(xì)胞培養(yǎng)莖尖組織培養(yǎng)15 20天后，大多數(shù)開始形成白色的非胚性愈傷組織。培養(yǎng)6 7周后，在這些非胚性愈傷組織的表面開始形成亮黃色、結(jié)構(gòu)致密、有光澤的胚性愈傷組織。 培養(yǎng)8 9周后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的胚性愈傷組織，置于含有2，4-D和多種激素的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過6 8次繼代獲得了增殖迅速、分散程度良好的胚性細(xì)胞系。研究結(jié)果表明，莖尖組織培養(yǎng)15 20天后，不同激素配比的MS培養(yǎng)基上形成的甘薯胚性愈傷組織頻率不同。在含有2，4-D2mg/L+6-BA 2mg/L+lAA 2mg/L+N0A2mg/L的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 20天，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為36% ；在含有2，4-DO. 5mg/L+6-BA 0. 5mg/ L+1AA0. 5mg/L+N0A 0. 5/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上15-20天，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為68%。即在 MS+2，4-DO. 5-2mg/L+6_BA 0. 5_2mg/L+lAA 0. 5_2mg/L+N0A0. 5_2mg/L 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上15-20天，

且以0. 5mg/L 6-BA+l. Omg/L 1AA，2，4-D在1. Omg/L以下時(shí)，無論愈傷組織誘導(dǎo)率
還是芽的分化率都很高。1. 2. 2.胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)將生長(zhǎng)旺盛的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入到MS+2，4-D 0. 05-0. 2mg/L+6-BA 0. 5-lmg/L+KT 0. 5-lmg/L+NOAO. 5-lmg/L+IAAO. 5-lmg/L+TDZO. 5mg/L 的培養(yǎng)基上，繼代培養(yǎng)10-15天，使甘薯胚性細(xì)胞大量發(fā)生。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在脫分化過程中，胚性愈傷組織在繼代培養(yǎng)時(shí)激素水平要適當(dāng)降低。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)過高的激素水平反而對(duì)胚性愈傷組織形成有抑制作用。1. 2. 3.誘導(dǎo)完整植株再生為了使甘薯小植株再生，將直徑l_2mm左右的胚性細(xì)胞團(tuán)直接轉(zhuǎn)移到含有KT、多效唑、GA3等激素不同配比的培養(yǎng)基中，以MS+KT 0. 5mg/L+多效唑0. 5-1. 0mg/L+N0A 0. 5mg/L+GA3 0. 5-1. 0mg/L、蔗糖3%的培養(yǎng)基中成苗最佳，能使苗長(zhǎng)大。然后轉(zhuǎn)入加有NAA的培養(yǎng)基中生根，即1/2MS+KT0. 05mg/L+NAA0. 5mg/L、蔗糖2%的培養(yǎng)基中生根較好，可達(dá)到90%。1. 2. 4.再生植株的擴(kuò)大繁殖將無菌苗切成帶芽小段，然后轉(zhuǎn)入到V2MS芽分化較好，具體是MS+0. 5mg/L NAA+1. Omg/LKT。如添加AgN03，最佳含量為l_2mg/L，可以誘導(dǎo)出大量不定芽，在MS培養(yǎng)基中多次繼代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)大繁殖。實(shí)施例2 =60Co- Y射線輻照處理甘薯莖段及胚性細(xì)胞2. 1.材料和方法2. 1. 1.輻照處理材料的準(zhǔn)備用本發(fā)明所建立的甘薯胚性細(xì)胞系為材料，選擇發(fā)育良好，處于旺盛分裂狀態(tài)(愈傷組織顆粒狀、致密、色澤鮮黃、質(zhì)地幼嫩)的愈傷組織， 轉(zhuǎn)將其入到新鮮的繼代培養(yǎng)基(MS+2，4-D 0. 05-0. 2mg/L+6-BA 0. 5-lmg/L+KTO. 5-lmg/ L+N0A0. 5-lmg/L+IAAO. 5-lmg/L+TDZO. 5mg/L)中。在轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基10-15天后進(jìn)行輻照處理。2. 1. 2.輻照處理方法將離體培養(yǎng)的胚性愈傷組織送到中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能所進(jìn)行6ciCo-Y射線輻照處理，輻射劑量為10、20、30、40、60Gy，每處理用4瓶愈傷組織。輻照后，將胚性細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)20-30天，再轉(zhuǎn)移到新鮮的繼代培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大繁殖。2.2.結(jié)果2. 2. 1.突變處理的結(jié)果甘薯愈傷組織經(jīng)射線輻照后會(huì)產(chǎn)生損傷，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)應(yīng)該有20 30天的修復(fù)期，為此應(yīng)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)1次。培養(yǎng) 25天后將愈傷組織稱重。結(jié)果表明，當(dāng)輻照劑量為IOGy時(shí)生長(zhǎng)受到影響，30Gy，50Gy劑量輻照，愈傷組織生長(zhǎng)受到顯著抑制，差異顯著，經(jīng)多重比較檢測(cè)(LSD測(cè)驗(yàn))顯示30Gy以上處理的生長(zhǎng)速度與無輻照處理的對(duì)照差異顯著。輻照胚性愈傷組織時(shí)，以出現(xiàn)愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的劑量較為合適，這樣的劑量得到的個(gè)體較多，選擇的機(jī)率多，有可能選到所期望的突變苗。劑量太大，細(xì)胞損傷增大，對(duì)今后成苗有一定影響，不易選到健壯的突變苗。本發(fā)明優(yōu)選20-30Gy輻照劑量范圍可有效地誘發(fā)突變，兼顧突變率與細(xì)胞生長(zhǎng)率。 2. 2. 2.輻照的胚性愈傷組織雖受到抑制，但還要其發(fā)育成苗輻照前愈傷組織重量平均為0. 035克，未輻照的胚性愈傷組織經(jīng)20經(jīng)天后為 0. 102克胚性愈傷組織用20Gy劑量輻照經(jīng)20經(jīng)天后，取20塊胚性愈傷組織稱重，重量分別是 0. 030,0. 055,0. 050,0. 055,0. 052,0. 070,0. 060,0. 056,0. 045,0. 042,0. 041,0. 040g、 0. 040,0. 039,0. 036,0. 033,0. 031,0. 029,0. 028,0. 021g,單個(gè)愈傷組織的平均重量是 0. 0426g。在這些個(gè)體中，重量在0. 03g以上的愈傷組織均有可能誘導(dǎo)出苗，這樣才可能選出突變個(gè)體；重量小于0. 03g的愈傷組織，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，在誘導(dǎo)苗分化時(shí)會(huì)出現(xiàn)困難，不易誘導(dǎo)出幼苗，也難以選出突變個(gè)體。實(shí)施例3 甘薯胚性細(xì)胞類減數(shù)分裂的誘導(dǎo)3. 1材料和方法3. 1. 1.材料本發(fā)明采用的試材之一是金葉薯，金葉薯是近年來新開發(fā)出的一年生地被植物， 因其金黃透亮的色彩十分奪目，在夏日尤其突出，而且能對(duì)鮮花起到很好的襯托作用。經(jīng)實(shí)施例1記載的脫分化處理，和實(shí)施例2記載的輻照誘變處理后得到金葉薯的胚性細(xì)胞，以用于本實(shí)施中進(jìn)行類減數(shù)分裂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。3. 1. 2.方法用嘌呤類核苷處理下有絲分裂指數(shù)的最佳條件以未經(jīng)藥物處理的甘薯胚性細(xì)胞為對(duì)照，鏡檢時(shí)觀察有絲分裂指數(shù)(100個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行分裂的細(xì)胞所占百分率)及體細(xì)胞類減數(shù)分裂頻率(100個(gè)分裂細(xì)胞中發(fā)生類減數(shù)分裂的細(xì)胞數(shù))?？紤]甘薯胚性細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)受嘌呤類核苷濃度、受處理時(shí)間、以及復(fù)時(shí)間的影響。本發(fā)明對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化。方法為先將嘌呤類核苷溶于MS液體培養(yǎng)基中，配成系列不濃度的溶液。尿嘧啶核苷先用lOmmol/L NaOH溶解，然后用IN HCl將pH調(diào)至7. 0-7. 5，以免溶液產(chǎn)生沉淀，然后按不濃度加入到MS液體培養(yǎng)基中。取胚性細(xì)胞團(tuán)在系列梯度的藥物溶液中按設(shè)置時(shí)間 (HT表示處理時(shí)間)浸泡，處理后用MS液體培養(yǎng)基沖洗，置于淺層MS液體培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)，同時(shí)，設(shè)置了不同的恢復(fù)時(shí)間(RT表示恢復(fù)時(shí)間)，將誘變處理后得到的胚性細(xì)胞浸泡于不同濃度X的腺嘌呤核苷及尿嘧啶核苷溶液中處理Y個(gè)小時(shí)，恢復(fù)Z個(gè)小時(shí)。采用以下三個(gè)因素進(jìn)行組合處理X，嘌呤類核苷或尿嘧啶核苷濃度0、20、40、60、80、100mmol/L，本實(shí)施例采用的腺嘌呤核苷。HT處理時(shí)間設(shè)為2-8小時(shí)，RT恢復(fù)時(shí)間分別為0、5、10、20、40、80小時(shí)。觀察有絲分裂指數(shù)及類減數(shù)分裂頻率。(3)細(xì)胞學(xué)觀察方法甘薯的染色體很小，而且數(shù)量較多(2η = 90)，同時(shí)又是六倍體植物，減數(shù)分裂行難以觀察，本試驗(yàn)除用醋酸洋紅壓片法外，同時(shí)經(jīng)過簡(jiǎn)易水解(濃鹽酸純酒精=1 1) 進(jìn)行壓片后，還采用石碳酸品紅法再染色，可直接用于減數(shù)分裂相的觀察、分析。 1)取樣與預(yù)檢最適取樣時(shí)間是在上午的9:30-12 ;00，取樣后立即固定。首先取不同恢復(fù)時(shí)間的胚性細(xì)胞，用卡諾固定液(酒精冰醋酸3 1)固定，或用固定液冰醋酸氯仿純酒精1:3:6固定。固定12-24小時(shí)后，換到70%的乙醇中保存。鏡檢時(shí)觀察計(jì)算有絲分裂頻率(進(jìn)行有絲分裂細(xì)胞數(shù)在所觀察的細(xì)胞數(shù)的百分率)及體細(xì)胞類減數(shù)分裂頻率(發(fā)生類減數(shù)分裂的細(xì)胞數(shù)占選取的有絲分裂細(xì)胞中的比例)。進(jìn)行預(yù)檢，選用經(jīng)固定2小時(shí)以上，大小合適的胚性愈傷，用鑷子或解剖針先取出一枚材料，置于載玻片上，加醋酸洋紅一滴，用鑷子擠碎，分散細(xì)胞，加蓋片初壓，初步觀察是否有分裂相。2)醋酸洋紅制片經(jīng)預(yù)檢確定有分裂相，在醋酸洋紅中浸泡6-12小時(shí)以上的細(xì)胞，取一塊置于載玻片上，加45%外的冰醋酸蓋片，置于酒精燈火焰上微烤，趁熱壓片。顯微鏡下觀察可見染色體分散呈紅色，細(xì)胞質(zhì)淡紅色。從蓋片一側(cè)滴加濃鹽酸純酒精=1 1 水解液，經(jīng)一分鐘左右，迅速用濾紙片吸去水解液，立即用45%冰醋酸滲洗2-3次。3)加石碳酸品紅再染色加石碳酸品紅液后，在火焰上再微烤一次，復(fù)壓片。此時(shí)，鏡下觀察可見染色體分散清晰，呈紫紅色，細(xì)胞質(zhì)無色透明。3. 2結(jié)果與分析3. 2. 1.對(duì)僅僅經(jīng)過脫分化的胚性細(xì)胞觀察細(xì)胞類減數(shù)分裂，在100個(gè)細(xì)胞有絲分裂相，其中有9個(gè)細(xì)胞染色體異常，典型的類減數(shù)分裂細(xì)胞有4個(gè)，即占4%。類減數(shù)分裂誘導(dǎo)頻率偏低。在未經(jīng)核酸類似物處理的甘薯胚性細(xì)胞中，細(xì)胞雖然處于旺盛的有絲分裂狀態(tài)， 但僅觀察到3-5%體細(xì)胞類減數(shù)分裂現(xiàn)象。3. 2. 2為誘導(dǎo)體細(xì)胞類減數(shù)分裂優(yōu)化了條件使誘導(dǎo)率顯著提高3.2. 1. 1嘌呤類核苷的濃度分別配制成0、20、40、60、80、100讓01/1，不同處理時(shí)間為2小時(shí)、8小時(shí)。不同恢復(fù)時(shí)間為10、20、40、80小時(shí)。處理方法第一步培養(yǎng)分裂旺盛的胚性細(xì)胞；第二步誘導(dǎo)體細(xì)胞類減數(shù)分裂；第三步細(xì)胞自然加倍獲得純合體細(xì)胞胚，并使之發(fā)育成完整植株。結(jié)果顯示誘導(dǎo)得到的細(xì)胞用于統(tǒng)計(jì)不同濃度處理的有絲分裂指數(shù)表明鏡檢時(shí)觀察到有絲分裂指數(shù)(分裂的細(xì)胞占觀察細(xì)胞百分率)在腺嘌呤核苷20-60mmol/L時(shí)較高，而且穩(wěn)定，沒有太大變化，在這種條件下可觀察到大量的類減數(shù)分裂細(xì)胞。濃度再加大， 則會(huì)減少分裂細(xì)胞的數(shù)目，恢復(fù)時(shí)間與濃度呈正相關(guān)，濃度越大恢復(fù)時(shí)間越長(zhǎng)，分裂細(xì)胞越少，以致無法進(jìn)行類減數(shù)分裂頻率統(tǒng)計(jì)，具體如下表1.腺嘌呤核苷誘導(dǎo)的甘薯胚性細(xì)胞染色體減數(shù)(45 45)頻率
權(quán)利要求
1.提高突變頻率和突變譜的植物誘變育種方法，其步驟如下(1)誘變對(duì)胚性細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，然后繼代擴(kuò)大培養(yǎng)，(2)誘導(dǎo)類減數(shù)分裂對(duì)誘變處理、繼代擴(kuò)大培養(yǎng)得到細(xì)胞進(jìn)行類減數(shù)分裂誘導(dǎo)，(3)自然加倍獲得突變純合體細(xì)胞，結(jié)合育種目標(biāo)與突變性狀篩選突變純合體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物誘變育種方法，步驟(2)誘導(dǎo)類減數(shù)分裂，指采用含 40 60mmol/L嘌呤類核苷或尿嘧啶核苷的MS液體培養(yǎng)基浸泡誘變處理后的胚性細(xì)胞2小時(shí)、恢復(fù)20 40小時(shí)，繼代擴(kuò)大培養(yǎng)得到類減數(shù)分裂細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物誘變育種方法，步驟(1)誘變，指采用鈷60-γ射線輻照胚性細(xì)胞，輻射劑量為出現(xiàn)愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制的劑量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物誘變育種方法，所述輻射劑量為20 30Gy，劑量率為每分鐘IOGy/分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一所述的植物誘變育種方法，所述植物指甘薯。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物誘變育種方法，所述胚性細(xì)胞的制備包括植物材料脫分化，然后繼代擴(kuò)大培養(yǎng)；所述脫分化培養(yǎng)基為MS+2，4-D 0. 5-2mg/L+6-BA 0. 5_2mg/L+lAA 0. 5-2mg/L+N0A0. 5_2mg/L、蔗糖 3%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的植物誘變育種方法，所述脫分化培養(yǎng)基為2，4-D0.5mg/ L+6-BA0. 5mg/L+lAA0. 5mg/L+N0A0. 5mg/L，蔗糖 3%。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的植物誘變育種方法，所述繼代擴(kuò)大培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基為MS+2，4-D 0.05-0.2mg/L+6_BA 0.5-lmg/L+KTO. 5-lmg/L+NOAO. 5-lmg/L+IAAO. 5-lmg/ L+TDZO. 5mg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物誘變育種方法，步驟(2)中，選擇經(jīng)誘變處理、繼代擴(kuò)大培養(yǎng)后且處于旺盛分裂期的細(xì)胞進(jìn)行類減數(shù)分裂誘導(dǎo)
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物誘變育種方法，所述篩選突變純合體指對(duì)突變純合體施加低溫，高溫和/或高鹽堿逆境選擇壓，然后篩選出逆境條件下能夠存活下來的個(gè)體。
全文摘要
本發(fā)明“提高突變頻率和突變譜的植物誘變育種方法”，屬于植物誘變育種領(lǐng)域。其步驟如下(1)誘變對(duì)胚性細(xì)胞進(jìn)行誘變處理，然后繼代擴(kuò)大培養(yǎng)，(2)誘導(dǎo)類減數(shù)分裂對(duì)誘變處理、繼代擴(kuò)大培養(yǎng)得到細(xì)胞進(jìn)行類減數(shù)分裂誘導(dǎo)，(3)自然加倍獲得突變純合體細(xì)胞，結(jié)合育種目標(biāo)與突變性狀篩選突變純合體。可在較短時(shí)間內(nèi)離體篩選大量材料，獲得單細(xì)胞起源的純合抗逆突變體，明顯縮短了育種周期，使選擇效率大大提高。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102250873SQ20111017461
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月24日
發(fā)明者石春鴻 申請(qǐng)人:北京青神園林工程有限公司, 石春鴻