專利名稱：大豆組培苗和轉(zhuǎn)化苗在無菌條件下培養(yǎng)結(jié)莢成熟技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，是一種大豆組培苗和轉(zhuǎn)化苗在無菌條件下培養(yǎng)結(jié)莢成熟的技術(shù)。
背景技術(shù)：
大豆原產(chǎn)于我國，是重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是我國居民食用油和植物蛋白的主要來源。大豆品種改良主要采用傳統(tǒng)育種方法，如雜交育種法，但在大豆抗不良環(huán)境(如病、蟲、 草害等)脅迫的育種方面使用雜交育種法因抗源匱乏有一定的局限性。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)入植物中，以改良受體某些不良性狀的分子育種法，已展示出良好的應(yīng)用前景。大豆轉(zhuǎn)基因常采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍轟擊法，這些遺傳轉(zhuǎn)化方法都是植物組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的，外植體(如胚尖、末成熟子葉等)在無菌條件下培養(yǎng)過程中將外源有益基因轉(zhuǎn)入受體，并經(jīng)過抗性篩選得到抗性個(gè)體。不論是一般大豆組織培養(yǎng)得到的組培苗， 還是經(jīng)過轉(zhuǎn)基因及抗性篩選得到的轉(zhuǎn)化苗，要完成生育周期得到種子常規(guī)方法都是經(jīng)過練苗，將其從組織培養(yǎng)瓶中取出移栽到特殊配制的基質(zhì)中，如蛭石、珍珠巖等，在具有調(diào)溫控濕的智能溫室中細(xì)心培養(yǎng)這些小植株，使其開花、結(jié)莢、成熟。因?yàn)榻?jīng)過組織培養(yǎng)得到的組培苗和轉(zhuǎn)化苗都比由種子萌發(fā)產(chǎn)生的苗小、生長也較弱。組織培養(yǎng)再生小植株從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到溫室中生長，因環(huán)境變化較大，很難適合溫室的生長環(huán)境，導(dǎo)致移栽成活率不高。采用本技術(shù)將再生小植株在無菌條件下培養(yǎng)得到成熟的大豆種子，為一些有大豆組織培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化研究條件、但不具備智能溫室等配套設(shè)備的研究單位提供了一種從大豆組培苗和轉(zhuǎn)化苗得到種子的簡便技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述以大豆為實(shí)驗(yàn)材料，將經(jīng)器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑獲得組培苗、經(jīng)轉(zhuǎn)基因及抗性篩選得到轉(zhuǎn)化苗轉(zhuǎn)接到40X250mm直形管中，在18 25°C、光照時(shí)間 14h、光照強(qiáng)度2500 11500LUX、相對濕度30 40 %的智能型人工氣候箱中培養(yǎng)，4 6 周在無菌條件下向直形管中添加1/2MS或MS液體培養(yǎng)基補(bǔ)充營養(yǎng)，培養(yǎng)30 50d時(shí)大豆開花，40 60d時(shí)結(jié)莢、90 120d得到成熟大豆種子，以此完成在無菌培養(yǎng)條件下從大豆組培苗和轉(zhuǎn)化苗到開花、結(jié)莢、成熟全過程。解決了大豆組培苗和轉(zhuǎn)化苗移栽到溫室時(shí)成活低、在溫室中生長高能耗、對環(huán)境條件要求較高等問題，是一種簡便易行由大豆組培苗和轉(zhuǎn)化苗獲得種子的技術(shù)。
具體實(shí)施例方式大豆組培苗和轉(zhuǎn)化苗在無菌條件下培養(yǎng)結(jié)莢成熟技術(shù)通過以下步驟實(shí)現(xiàn)方案一大豆成熟種子胚尖不定芽的組培苗和轉(zhuǎn)化苗在無菌條件下培養(yǎng)結(jié)莢成熟(一 )大豆成熟種子胚尖不定芽的組培苗和轉(zhuǎn)化苗的獲得
1大豆成熟種子誘導(dǎo)胚尖不定芽經(jīng)器官發(fā)生途徑獲得組培苗挑選成熟無病蟲害的大豆種子，浸泡在75%乙醇溶液中3 5min，用0. 的 HgCl2溶液消毒15 20min，無菌水沖洗3 4次后，浸于無菌水25°C暗培養(yǎng)M 4 (期間換水)。取浸泡后萌動(dòng)的大豆種子，在超凈工作臺(tái)中剝?nèi)シN皮、去掉兩片子葉、兩片原葉和胚根，取胚尖接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+3 ^ig/L 6-BA，每升培養(yǎng)基中附加3%蔗糖， 0.7%瓊脂粉，pH調(diào)至5. 8 6. 2，下同)中，置于溫度25士 1°C、光照16h/d，強(qiáng)度2000 3000Lux的條件下誘導(dǎo)M 4 后，將大豆胚尖轉(zhuǎn)接到不定芽伸長培養(yǎng)基(MS+0. 05 Img/ L 6-BA+0. 1 0. 2mg/L IBA)培養(yǎng)，條件同不定芽誘導(dǎo)，2周更換一次培養(yǎng)基。 2大豆成熟種子胚尖農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化苗將大豆胚尖在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)M 48h，種子消毒、剝?nèi)∨呒馀c接種的方法，以及胚尖不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等同大豆胚尖不定芽組培苗的誘導(dǎo)。挑取農(nóng)桿菌一單菌落，接種于加有相應(yīng)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，在170 250r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD6tltl 0. 5)，菌液在4000r/mir^4°C )離心lOmin，棄上清液，沉淀的菌體用等體積的重懸液(1/2MS，不加瓊脂，加lOOmmol/LAS，其他同胚尖不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基)重懸，靜止30min，待侵染。將經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的大豆胚尖放到農(nóng)桿菌液中浸泡10 30min，期間不斷搖晃使其充分接觸。取出后用濾紙吸掉胚尖周圍的農(nóng)桿菌液，擺放在鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)基(1/2MS， 加入lOOmmol/LAS，其他同胚尖不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上，在25°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3d，再轉(zhuǎn)接到含有抗性篩選劑和脫菌劑的不定芽伸長培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件同不定芽的誘導(dǎo)，2周更換一次培養(yǎng)基。( 二)大豆胚尖不定芽的組培苗和轉(zhuǎn)化苗在無菌條件下培養(yǎng)結(jié)莢成熟大豆胚尖不定芽組培苗和轉(zhuǎn)化苗培養(yǎng)至苗高3 km時(shí)，切取不定芽組培苗轉(zhuǎn)接于含有生根培養(yǎng)基(MS+0. 1 0. 5mg/L IBA)的大直形管中；切取不定芽轉(zhuǎn)化苗轉(zhuǎn)接于含有抗性篩選劑和脫菌劑的生根培養(yǎng)基的大直形管中。大直形管為40 X 250mm，每管接種一棵胚尖不定芽，用12 X 12mm雙層封口膜封口， 大豆苗處于無菌條件放在智能型人工氣候箱中培養(yǎng)，溫度18 25°C、光照時(shí)間14h、光照強(qiáng)度2500 11500LUX、相對濕度30 40%，具體培養(yǎng)條件見表1。4 6周在無菌條件下向直形管中添加1/2MS或MS液體培養(yǎng)基補(bǔ)充營養(yǎng)，培養(yǎng)30 50d時(shí)大豆開花、40 60d時(shí)結(jié)莢、90 120d大豆種子成熟，以此完成在無菌培養(yǎng)條件下從大豆胚尖不定芽的組培苗和轉(zhuǎn)化苗到開花、結(jié)莢、成熟的全過程。表1大豆組培苗和轉(zhuǎn)化苗在無菌條件下培養(yǎng)結(jié)莢成熟的培養(yǎng)條件
權(quán)利要求
1. 一種大豆組培苗和轉(zhuǎn)化苗在無菌條件下培養(yǎng)結(jié)莢成熟技術(shù)的特征在于將大豆經(jīng)組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化得到的組培苗和轉(zhuǎn)化苗轉(zhuǎn)接到40 X 250mm直形管中，在智能型人工氣候箱中設(shè)置以下條件培養(yǎng)完成大豆組培苗和轉(zhuǎn)化苗到開花、結(jié)莢、成熟的全過程。光照或黑暗時(shí)間(h)光照強(qiáng)度(Lux)溫度(°c)相對濕度22500204025400254051150025303870025402540025401001840
全文摘要
一種大豆組培苗和轉(zhuǎn)化苗在無菌條件下培養(yǎng)結(jié)莢成熟技術(shù)，涉及植物組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以栽培大豆為實(shí)驗(yàn)材料，將經(jīng)器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑獲得的組培苗和經(jīng)轉(zhuǎn)基因及抗性篩選得到的轉(zhuǎn)化苗轉(zhuǎn)接到40×250mm直形管中，在溫度18～25℃、光照時(shí)間14h、光照強(qiáng)度2500～11500Lux、相對濕度30～40％的智能型人工氣候箱中培養(yǎng)，4～6周向直形管中添加1/2MS或MS液體培養(yǎng)基補(bǔ)充營養(yǎng)，以此完成在無菌培養(yǎng)條件下從大豆組培苗和轉(zhuǎn)化苗到結(jié)莢成熟全過程。主要解決了大豆組織培養(yǎng)與遺傳轉(zhuǎn)化過程中組培苗和轉(zhuǎn)化苗移栽成活率低、移栽到溫室中生長需高能耗、對環(huán)境條件要求較高等問題。
文檔編號A01H4/00GK102283117SQ20111018424
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者季靜, 王罡, 王萍 申請人:淮海工學(xué)院