專利名稱：酸性β-甘露聚糖酶基因改造及其工程菌的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及β-甘露聚糖酶基因改造、合成、拼接及含有此基因的工程菌構(gòu)建，特別是一種真菌酸性β -甘露聚糖酶全基因及其高效表達(dá)工程菌的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
甘露聚糖酶已從不同來源的生物中分離，有植物(如西紅柿的種子和果實(shí))、低等動(dòng)物(如藍(lán)貽貝 Mytilus deulis)和微生物(Millward-Sadler, et al. Microbiol.Lett. 141，183-188)。其中微生物是產(chǎn)β -甘露聚糖酶的重要來源，已報(bào)道的有芽孢桿菌、氣單孢菌、黃單孢菌、梭孢菌、青霉、木霉和鏈霉等(Braithwaite, et al. , Biochem.J, 305:1005-1010, 1995; Duffaud, et al. , Appl Environ Microbiol, 63(1):169-177, 1997; Reese and Shibata, Can J Microbiol, 11 :167-183，1965 ; Aki no, etal. , AppI. Microbial Biotech, 26:323-327,1987)。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于甘露聚糖酶的研究和開發(fā)集中在細(xì)菌產(chǎn)生的堿性和中性β-甘露聚糖酶方面，JP-A-03047076公開了由一種芽孢桿菌得到的β -甘露聚糖酶，具有分子量37±3 kDa，最適pH 8-10, pi 5. 3-5. 4 JP-A-08051975公開了來自嗜堿性芽孢桿菌AM-001的幾種堿性β-甘露聚糖酶，其具有分子量43±3 kDa和57±3 kDa，最適pH 8-10 ；W097/11164公開了一種可用于漂白紙漿和紙張，來自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的純化甘露聚糖酶及其制備方法；ZL200510103125. 8公開了一種來自于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的β -甘露聚糖酶基因序列及其工程菌的構(gòu)建，可用于甘露寡糖的制備；ZL01128868. x公開了一種中性甘露聚糖酶,該酶在搖瓶水平上表達(dá)酶活性為307 IU/mL。不同微生物所產(chǎn)的甘露聚糖酶在分子量、最適催化溫度、最適pH、底物特異性等方面都存在很大差異。真菌產(chǎn)甘露聚糖酶作用偏酸性，而細(xì)菌和放線菌產(chǎn)甘露聚糖酶作用的PH近中性或偏堿性，但穩(wěn)定性較好。目前甘露聚糖酶的生產(chǎn)主要采用細(xì)菌或芽孢桿菌的液體發(fā)酵法，主要缺點(diǎn)是需要底物誘導(dǎo)，且發(fā)酵工藝復(fù)雜，成本高，產(chǎn)率低，酶活性低且所產(chǎn)中性酶不適于酸性作用環(huán)境。而在飼料中應(yīng)用的甘露聚糖酶，需要在酸性條件下具有高活性(表1)，因此酸性β -甘露聚糖酶的研究與開發(fā)在飼料工業(yè)應(yīng)用中具有重要意義。表I β -甘露聚糖酶在動(dòng)物體內(nèi)的作用位點(diǎn)
Wm I嗉囊I肌胃(胃)I小腸—
M_4. 67 2. 94_5. 8 6. 20
豬 --- 丨3.0丨6.0 6.
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酸性耐熱β -甘露聚糖酶。本發(fā)明再一目的是提供酸性耐熱β -甘露聚糖酶的全基因。本發(fā)明再一目的是提供一種產(chǎn)酸性耐熱β -甘露聚糖酶的工程菌株。
本發(fā)明再一目的是提供一種酸性耐熱β -甘露聚糖酶的表達(dá)方法。本發(fā)明的目的是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的酸性β-甘露聚糖酶，來源于黑曲霉和刺孢曲霉，是具有下述氨基酸序列之一的蛋白質(zhì)
序列表中的SEQ ID No. I ；
將序列表中的SEQ ID No. I的氨基酸殘基序列經(jīng)過二十七個(gè)氨基酸殘基的替換、缺失或重復(fù)所獲得的具有對(duì)甘露聚糖降解活性的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID No. 2所示。將序列表中經(jīng)過改造的SEQ ID No. I序列與SEQ ID No. 2的氨基酸序列通過片段切割、重組所獲得的具有對(duì)甘露聚糖降解活性的蛋白質(zhì)。 本發(fā)明的酸性β -甘露聚糖酶的基因manAsp，滿足下列要求的核苷酸序列之一 編碼具有序列SEQ ID No. I或SEQ ID No. 2的酸性β -甘露聚糖酶；
編碼序列SEQ ID No. I或SEQ ID No. 2的酸性β -甘露聚糖酶，其堿基序列如SEQ IDNo. 3所示；
編碼序列SEQ ID No. I或SEQ ID No. 2的酸性β -甘露聚糖酶，其堿基序列如SEQ IDNo. 4所示；
在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的酸性β -甘露聚糖酶工程菌為包含上述酸性β -甘露聚糖酶基因manAsp的重組載體的酸性甘露聚糖酶工程菌。本發(fā)明的酸性甘露聚糖酶工程菌的構(gòu)建方法，是將含有酸性甘露聚糖酶基因manAsp的重組載體pGAPZ a -man或pPICZ a -man導(dǎo)入畢赤酵母中獲得。上述重組載體(即畢赤酵母重組表達(dá)載體)的構(gòu)建參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克書中所述具體方法進(jìn)行。將重組載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母的方法為電擊轉(zhuǎn)化法或氯化鋰轉(zhuǎn)化法。下表2為目前研究中幾種具有代表性的微生物所產(chǎn)的β -甘露聚糖酶特性。由表2可知，同里氏木酶、硫色曲霉和枯草芽孢桿菌來源的甘露聚糖酶相比， 本發(fā)明的β-甘露聚糖酶有如下優(yōu)點(diǎn)
(1)最適pH為5.0，在3. 0-7. O間穩(wěn)定性較好，更易在豬或者是其它家禽的胃(3. O左右)和腸道(6. O左右)中發(fā)揮作用；
(2)該酶同硫色曲霉和枯草芽孢桿菌來源的β-甘露聚糖酶相比,具有更好的耐熱性，適宜于飼料添加劑制備過程中的熱處理；本發(fā)明的甘露聚糖酶可以在90°C濕熱條件下耐受10分鐘，殘留70%以上酶活，而以硫色曲霉和枯草芽孢桿菌為來源的β -甘露聚糖酶的最高耐熱溫度為80°C。
(3)同里氏木酶、硫色曲霉來源的β-甘露聚糖酶相比，該酶為family26糖苷水解酶家族，對(duì)β -半乳甘露聚糖(即豆柏-玉米等種子飼料中甘露聚糖的主要存在形式)具有更好的特異性。表2幾種微生物所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶特性比較_I
幾種不同微生拗來源β -甘靈聚糖酶特性卜
來源微生…
P 溫度P分子重P所居家族^ 參考文獻(xiàn)P
物,3
最適ρΗ5.0， 最適溫度80O，
韋躍華等，
E民木爾P 5-0-0· O 時(shí)爾攝 801C保溫 SOmiri 麗 SOkDa^ f amily5^·Λ^ν-ννν >·Λ· -·Λ ννΛΑ5ν^ΛΛΗ Λ< ^ · ·*
2005.* >
_WMm -適勝____
最適pH2.4,在最適溫度K)°C，
陳小玲等，
硫魚曲蕞2.4-8.0 間穩(wěn)定60 保溫 30min 完 43kDa。familyB^
2007*+τ
性較好P全喪失酶活力P
最適P冊(cè)■ O,最適溫度65”， Zheng - ■
枯草芽孢 、一
5. 5-10.1TBTC-fSfM 30min ^ SS-OkDa^i family26 :' gian^ Jiang
桿菌p …v.,v.一
為ft定*.3賺太90%*; 等，2006^
最適5.0，在最適溫度40"O，
黑曲霉3.0-7.0 具有較 δΟ - β 30minfJ5 40kDai；! family^St3 本發(fā)明w
好的穩(wěn)定性一有60%!^上


圖I為本發(fā)明畢赤酵母重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖譜；
圖2為本發(fā)明酸性β-甘露聚糖酶全基因合成片斷拼接鑒定結(jié)果；
1-4泳道為分為4段基因片段的第一次PCR連接產(chǎn)物；5-8泳道為以各分段第一次PCR連接產(chǎn)物做模板的PCR產(chǎn)物；10、11泳道為4段基因片段連接成全基因片段；12泳道為空白對(duì)照；
圖3為本發(fā)明畢赤酵母重組質(zhì)粒酶切鑒定圖譜；
泳道I為pPICZ a -man酶切鑒定圖譜，泳道2為pGAPZ a -man酶切圖譜。圖4為本發(fā)明重組畢赤酵母X-33/pGAPZ a -man中酸性β -甘露聚糖酶基因遺傳穩(wěn)定性的PCR鑒定結(jié)果；
I、2、3、4、5泳道分別為重組畢赤酵母X-33/pGAPZ-man傳代5、10、15、20、25次后提取酵母基因組作模板擴(kuò)增β -甘露聚糖酶基因的PCR產(chǎn)物，M為marker，6泳道為陰性對(duì)照。圖5為本發(fā)明重組菌株X-33/pGAPZ a -man表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果；
圖6為本發(fā)明表達(dá)的黑曲霉β -甘露聚糖酶的最適pH檢測(cè)結(jié)果；
圖7為本發(fā)明表達(dá)的黑曲霉β-甘露聚糖酶的最適溫度檢測(cè)結(jié)果；
圖8為本發(fā)明表達(dá)的黑曲霉β_甘露聚糖酶的溫度穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果；圖9為本發(fā)明表達(dá)的黑曲霉β -甘露聚糖酶的pH穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明，以便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更了解本發(fā)明，但并不以此限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中所用方法如無特殊說明均為本領(lǐng)域內(nèi)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法，參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克書中所述具體方法進(jìn)行。實(shí)施例I來自于黑曲霉CBS 513. 88的β -甘露聚糖酶全基因的獲得 基因片斷的截取
在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得黑曲霉Aspergillus niger CBS 513. 88菌株的β -甘露聚糖酶基因Anl5g07760，分析其序列并根據(jù)畢赤酵母密碼子偏愛性和mRNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化該基因序列，采用SignalP 3.0 Server在線分析軟件分析該基因所編碼蛋白的信號(hào)肽并將編碼 信號(hào)肽的基因序列切除，在5’端添加XhoI酶切位點(diǎn)(C~TCGAG)和CG保護(hù)堿基、3’端添加XbaI (T'CTAGA)酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基GC，獲得優(yōu)化的β-甘露聚糖酶基因。設(shè)計(jì)三條引物Fn-Man GACCGCTCGAGAAGAGAGCTTCTAATC ；
Rn-Manl GCTCTAGAGCAGCACCTTCCCAATTC ；
Rn-Man2 GCTCTAGAGCTTAAGCACCTTCCCAATTC 基因片斷的合成
將優(yōu)化后的β -甘露聚糖酶基因用在線分析軟件Gene201igO進(jìn)行在線分析切割成54個(gè)片段，并交予南京金斯瑞生物科技有限公司合成短基因片段。基因片段的拼接
采用Assembly-PCR、DA-PCR和LCR技術(shù)拼接合成的短基因片段，獲得優(yōu)化后的β _甘露聚糖酶基因。Assembly PCR和 DA-PCR
將54個(gè)片段分成14、14、14和12個(gè)片段進(jìn)行PCR連接擴(kuò)增。反應(yīng)體系為=IXBuffer;MgS04, 2. 5mM ；dNTPs, 200μΜ ；VentR DNA polymerase O. 5U ;兩端引物，O. 4μΜ ;內(nèi)部基因片段，O. 05μΜ ;補(bǔ)滅菌雙蒸水至總體系20μ 。PCR擴(kuò)增程序94°C，2min ;35個(gè)循環(huán)(94°C，30s ；48°C ,40s,每個(gè)循環(huán)降 O. 3°C ;651，308，每個(gè)循環(huán)降0.61，時(shí)間增加48) ；94°C,2min ；20個(gè)循環(huán)(94°C，30s ；65°C,30s ；72°C,90s) ；72°C, IOmin ;4。。，hold。以第一次PCR產(chǎn)物稀釋作模板、以每段基因的兩端片段作引物進(jìn)行第二次PCR，體系同上。反應(yīng)程序94°C,5min ；94°C,40s ；60°C,40s ;72°C，lmin，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C,IOmin ;4°C，保存。取四段基因第二次PCR產(chǎn)物等倍稀釋、取等量混合作模板，反應(yīng)體系同上。反應(yīng)程序94°C，5min ；94°C，40s ；38°C, 40s ；55°C, 2min 30s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C，IOmin ；4°C，保存。PCR產(chǎn)物即為完整的β-甘露聚糖酶基因。LCR
將54個(gè)片斷分別磷酸化。反應(yīng)體系為lXBuffer ；T4 DNA kinase;基因片斷IOM(反應(yīng)前先將片斷75°C水浴5分鐘后，冰浴冷卻，能提高磷酸化的效果);補(bǔ)滅菌雙蒸水至ΙΟμ 。37°C，水浴30min，然后65°C，水浴20min滅活。
再將磷酸化后的片斷分成20、20、20個(gè)片斷進(jìn)行過夜連接。反應(yīng)體系為IXBuffer ；T4 DNA ligase ;模板片斷O. 4 M ;補(bǔ)滅菌雙蒸水至25μ 。22°C，低溫水浴過夜。以過夜連接產(chǎn)物為模板，以每段基因的連段片段作引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為IXBuffer ;MgS04, 2. 5mM ;dNTPs，20(^M ;VentR DNA polymerase 0. 5U ;兩端引物，0· 4μΜ ;內(nèi)部基因片段，0. 05μΜ;補(bǔ)滅菌雙蒸水至總體系20μ 。反應(yīng)程序94°C，5min ;94°C，40s ；60°C,40s ;72°C，lmin，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C, IOmin ;4°C，保存。取三段基因PCR產(chǎn)物等倍稀釋、取等量混合作模板，反應(yīng)體系同上。反應(yīng)程序94°C,5min ；94°C,40s ；38°C,40s ;55°C，2min30s，共 30 個(gè)循環(huán)；72°C, IOmin ；4°C,hold0 PCR產(chǎn)物即為完整的β_甘露聚糖酶基因。全長(zhǎng)基因的獲得、鑒定與測(cè)序
用加酶切位點(diǎn)的上下游引物、Assembly PCR產(chǎn)物做模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系和PCR運(yùn)行程序同上。 將上述PCR產(chǎn)物跑電泳進(jìn)行切膠回收純化，將純化產(chǎn)物用Taq DNA polymerase處理，在兩端加腺苷酸。將處理后產(chǎn)物進(jìn)行電泳切膠回收純化。純化產(chǎn)物連接到pGEM-T載體中，連接體系2XBuffer，5μ ;pGEM_T，Ιμ ；PCR純化產(chǎn)物，3μ ；Τ4連接酶， μ ;16°C水浴16h。重組質(zhì)粒命名為pGEM_Man。轉(zhuǎn)化取連接到pGEM-T的連接產(chǎn)物3μ ，采用化學(xué)法轉(zhuǎn)化到DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。利用藍(lán)白斑篩選到陽性克隆的克隆子。菌落PCR鑒定陽性克隆挑取白斑進(jìn)行菌落PCR，PCR得到IOOObp左右的條帶的克隆為陽性克隆。測(cè)序鑒定挑取5個(gè)陽性克隆子送去上海桑尼生物科技有限公司，測(cè)序結(jié)果顯示各克隆子均存在突變位點(diǎn)。無突變?nèi)L(zhǎng)基因的獲得
采用重組PCR將上述無突變位點(diǎn)的基因片段連接起來。然后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，獲得DH5a陽性克隆，方法同上。藍(lán)白斑篩選到陽性克隆經(jīng)菌落PCR鑒定后送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果無突變的克隆保存?zhèn)溆?。?shí)施例2黑曲霉β -甘露聚糖酶表達(dá)工程菌的構(gòu)建 β-甘露聚糖酶基因擴(kuò)增載體的構(gòu)建與基因擴(kuò)增
將經(jīng)Assembly PCR和LCR獲得的完整β -甘露聚糖酶基因，連接到pGEM_T載體中，然后轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，方法同上。挑取白斑經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性克隆后，送去上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序鑒定無突變的甘露聚糖酶基因重組質(zhì)?？寺”２貍溆谩＆?-甘露聚糖酶基因畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 甲醇誘導(dǎo)型表達(dá)載體pPICZ a -man
培養(yǎng)重組甘露聚糖酶基因的DH5a克隆子，采用堿裂解法提取pGEM-man (采用《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J.薩姆布魯克書中所述具體方法進(jìn)行)。采用同樣方法提取pPICZ a A 質(zhì)粒。用Xho I 和 Xba I 雙酶切 pGEM-man 和 pPICZ a A 質(zhì)粒，酶切體系10 X BufferTango, 2μ ;pGEM_man/pPICZ a A, μ ；Xho I Λ ； Xho I， μ ;37°C溫浴 8h。酶切產(chǎn)物跑電泳后切膠純化回收。將酶切后的甘露聚糖酶基因和pPICZ a A進(jìn)行連接，連接方法同上。組成型表達(dá)載體pGAPZ a -man
用Xho I和Xba I雙酶切pGEM-man和pGAPZ a A質(zhì)粒，酶切體系和方法同上，酶切產(chǎn)物跑電泳后切膠純化回收。將酶切后的β -甘露聚糖酶基因和pGAPZ a A進(jìn)行連接，連接方法同上。黑曲霉β -甘露聚糖酶工程菌的獲得
線形化含有黑曲霉β_甘露聚糖酶基因的重組質(zhì)粒pPICZ a A-man/pPICZ a A 和 pGAPZ a A/pGAPZ a Aian 質(zhì)粒的線性化。反應(yīng)體系10 X Tango Buffer, 10 μ L ;重組質(zhì)粒 pPICZ a A-man/pPICZ α A /pGAPZ α A/pGAPZ α A_man，2(^L;Bgl ΙΙ，5μ ;補(bǔ)滅菌雙蒸水至總體積ΙΟΟμ ?；靹蛏鲜龇磻?yīng)體系，37°C酶切4-5 h。以
O.8%瓊脂搪凝膠電泳檢測(cè)是否酶切完全，切膠回收純化線性化質(zhì)粒。畢赤酵母X-33感受態(tài)細(xì)胞的制備
挑取酵母單菌落，接種至含有5 mL Yro培養(yǎng)基的50mL搖瓶中，28-30°C，250-300 rpm培養(yǎng)過夜。取50 μ 的培養(yǎng)物接種至含有50 mL新鮮培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28-30°C，250-300 rpm培養(yǎng)過夜，至0D600值達(dá)到I. 3-1. 5。將細(xì)胞培養(yǎng)物于4°C，1500g離心5 min,用500 mL冰預(yù)冷滅菌水將菌體沉淀重懸。4°C，1500g離心5 min，用250 mL冰預(yù)冷的滅菌水將菌體沉淀重懸。4°C，1500 g離心5 min，用20 mL冰預(yù)冷的3 moL/L的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸。40C , 1500g離心5 min，用I mL冰預(yù)冷的3 moL/L的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為I. 5 mL。每管80 μ 分裝，-70°C保存。電擊轉(zhuǎn)化
將浸泡在70%乙醇中的電轉(zhuǎn)化杯取出，用無水乙醇沖洗三遍，在滅過菌的超凈臺(tái)中晾干殘余乙醇，將電轉(zhuǎn)化杯轉(zhuǎn)至冰中預(yù)冷10 min。將5-20 Pg的線性化DNA溶解在5_10 μ 滅菌雙蒸水中，與80μ 的感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)至0. 2 cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5 min后進(jìn)行電擊。電擊完畢后，加入I mL冰預(yù)冷的I mol/L的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至50 mL離心管中，28°C溫育3 h將菌體懸液涂布于YPDS平板上(含Zeocin濃度為100Pg/mL、50(^g/mL 和 lOOOPg/mL)，每 100_200μ 涂布一塊平板，于 30°C培養(yǎng) 2-3 d。穩(wěn)定重組菌的鑒定、篩選
提取重組酵母基因組DNA，按照酵母基因組DNA提取試劑盒提供的方法進(jìn)行。以基因組DNA為模板，Rn-Manl和Fn-Man為引物，對(duì)重組子進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)體系如下I XBuffer ;MgC12, 2. 5mM ；dNTPs, 200M-M ；pfu Taq DNA polymerase 0. 5U ;基因組DNA, 2 ；Rn-ManI和Fn-Man, 0. 5μΜ ;補(bǔ)滅菌雙蒸水至總體系20μ 。按以上體系混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94°C，3 min； 35個(gè)循環(huán)(94°C，30 s ;55°C，45s ;72°C，lmin)，最后72°C延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。切膠回收純化PCR產(chǎn)物，送上海桑尼生物科技公司測(cè)序，確定序列正確無突變。培養(yǎng)收集穩(wěn)定重組菌株保存于_70°C備用。
實(shí)施例3 黑曲霉β_甘露聚糖酶的誘導(dǎo)型表達(dá)
挑取穩(wěn)定重組單克隆菌株，接種至含25mL BMGY的250mL搖瓶中，28_30°C、250_300rpm培養(yǎng)至0D600=2-6 (約16-18小時(shí))。將25mL培養(yǎng)基接種至含IL BMGY的3L搖瓶中，28-30度劇烈振蕩(250-300rpm)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(0D600=2_6)。用滅菌離心管，室溫1500_3000g離心5min收集細(xì)胞。去除上清，用BMMY重懸細(xì)胞至0D600=1. O (2-6)。分裝培養(yǎng)基至3個(gè)3L隔板搖瓶，用2層滅菌紗布或干酪包布蓋住，放入搖床28-30°C繼續(xù)培養(yǎng)。每24小時(shí)，力口甲醇至O. 5%濃度，直至到達(dá)最佳誘導(dǎo)時(shí)間。按時(shí)間點(diǎn)分別取菌液樣品((24 h, 48 h, 60h, 72h、96 h ),取樣量為I mL,置于I. 5 mL離心管中，常溫，12000 rpm離心5 min,收集上清，分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。用12% SDS-PAGE電泳和活性檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)和酶活力。實(shí)施例4黑曲霉β-甘露聚糖酶的組成型表達(dá)
挑取穩(wěn)定重組的單克隆菌株至ImL含100 μ g/mL Zeocin的YPD中34°C振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，-70°C凍存保藏備用，同時(shí)作對(duì)照試驗(yàn)，方法同上。 電轉(zhuǎn)后的單克隆凍存菌經(jīng)過夜活化后，以1:100接種于IOOmLYPD培養(yǎng)液中，30°C振蕩培養(yǎng)，每隔24h取菌液，取樣量為I mL，置于I. 5 mL離心管中，常溫，12000 rpm離心5min，收集上清，分析目的蛋白的表達(dá)量和菌液最佳收獲時(shí)間。用12% SDS-PAGE電泳和活性檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)和酶活力。實(shí)施例5 黑曲霉甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析 最適pH與pH穩(wěn)定性分析
最適PH值的確定將稀釋好的純酶液置于不同pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸(2. 2-8. O)中測(cè)定酶的活力。pH值穩(wěn)定性的確定純酶樣品置于不同pH值的磷酸氫二鈉一檸檬酸(2. 2-8. O)緩沖液中處理24h后，測(cè)定殘留的酶活力。結(jié)果見圖6與圖9。結(jié)果顯示該酶在pH 3-7范圍內(nèi)能正常工作，在pH 3. 5-6. 5范圍內(nèi)保留有50%以上最高酶活。同時(shí)PH耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該酶在pH 2-8范圍內(nèi)耐受12小時(shí)可以殘留65%以上酶活。最適溫度與溫度穩(wěn)定性分析
最適溫度的確定純酶樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，分別在10°C、15 °C、20°C、25°C、30°C、35oC>40oC>45oC>50oC>55oC>60oC>65oC>70oC>75oC>80oC>85oC>90oC>95°CiP 100°C 測(cè)定酶的活力。溫度穩(wěn)定性的確定純酶樣品置于80V和90V下保溫30min,測(cè)定殘留的酶活力。結(jié)果見圖7和8。結(jié)果顯示該酶在0_60°C范圍內(nèi)皆能正常工作，保留有30%以上最高酶活。同時(shí)在80°C濕熱處理10分鐘和90°C濕熱處理10分鐘后仍能殘留60%以上
最聞酶活。實(shí)施例6甘露聚糖酶在飼料中的應(yīng)用
我國(guó)豬雞的主要日糧是玉米一豆柏型日糧，其主要的抗消化粘性多糖是甘露聚糖。玉米和豆柏中甘露聚糖占非淀粉多糖的比例分別為11. 7%和22. 7%。β -甘露聚糖酶是對(duì)玉米一豆柏型日糧非常有效的飼用酶制劑，它可以降解其含有的抗消化粘性多糖，促生長(zhǎng)提高飼料利用效率的效果非常顯著(表3)。表3 β _甘露聚糖酶對(duì)玉米一豆柏型日糧的應(yīng)用效果
權(quán)利要求
1.ー種酸性β-甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列通過點(diǎn)突變和隨機(jī)重組后的序列如SEQ ID No. I所示。
2.如權(quán)利要求I所述的ー種酸性甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列通過點(diǎn)突變和隨機(jī)重組后的序列如SEQ ID No. 2所示。
3.如權(quán)利要求I或2所述的酸性β-甘露聚糖酶，其特征在于，所述的酸性β-甘露聚糖酶最適作用PH 5. O，最適作用溫度40°C，在pH3. O 7. O范圍內(nèi)保留酶活比例達(dá)到50%以上，酶液在90°C高溫處理5分鐘殘留酶活70%以上，比活達(dá)到1256 U/mg。
4.ー種酸性甘露聚糖酶基因manAsp，其特征在于滿足下列要求的核苷酸序列之 編碼權(quán)利要求I或2所述的酸性β-甘露聚糖酶； 編碼權(quán)利要求I或2所述的酸性β -甘露聚糖酶，其堿基序列如SEQ ID No. 3所示； 編碼權(quán)利要求I或2所述的酸性β -甘露聚糖酶，其堿基序列如SEQ ID No. 4所示； 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.包含如權(quán)利要求4所述酸性β-甘露聚糖酶基因manAsp的重組載體pGAPZ a -man或 pPICZa -man。
6.包含如權(quán)利要求5所述酸性β-甘露聚糖酶基因manAsp的重組載體的酸性β -甘露聚糖酶工程菌。
7.權(quán)利要求I或2所述的酸性β-甘露聚糖酶在動(dòng)物飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酸性耐熱β-甘露聚糖酶基因的改造、合成、拼接及含有此基因的工程菌構(gòu)建，編碼基因具有如SEQIDNO.3或4所示的核苷酸序列，編碼獲得的酸性β-甘露聚糖酶具有如SEQIDNO.1或2所示的氨基酸序列。工程菌的構(gòu)建是將含有該酸性β-甘露聚糖酶編碼基因序列的畢赤酵母組成型表達(dá)載體(pGAPZα-man)導(dǎo)入畢赤酵母中得到的。本發(fā)明的酸性β-甘露聚糖酶具有以下性質(zhì)最適作用pH5.0，最適作用溫度40℃。在pH3.0～7.0范圍內(nèi)結(jié)構(gòu)良好性質(zhì)穩(wěn)定，酶液90℃高溫處理5分鐘殘留酶活70%以上，同時(shí)具有高比活和較好的蛋白酶抗性；該工程菌實(shí)現(xiàn)了酸性β-甘露聚糖酶的高效表達(dá)，發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，提取成本低廉，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A23K1/165GK102676477SQ20111023971
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月19日
發(fā)明者郭芳坤 申請(qǐng)人:濟(jì)南諾能生物工程有限公司