專利名稱：自發(fā)性HHcy相關動脈粥樣硬化轉基因小鼠動物模型及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及轉基因小鼠動物模型領域，更具體地講，涉及一種自發(fā)性HHcy相關動脈粥樣硬化轉基因小鼠動物模型及其制備方法。
背景技術：
諸多流行病學和臨床觀察研究結果表明，高同型半胱氨酸血癥 (hyperhomocysteinemia, HHcy)增加心腦血管疾病和動脈粥樣硬化發(fā)生的風險，血漿Hcy 每升高3umol/L，缺血性心臟病發(fā)生率增加11%，卒中發(fā)生率增加19%。Hhcy是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動因素之一，其誘發(fā)的動脈粥樣硬化的炎癥反應進程一旦啟動，最終會導致不可逆的動脈粥樣硬化斑塊的形成。
雖然一些循證醫(yī)學證據(jù)(2005年公布的NORVIT試驗和2006年報道的H0PE2試驗) 表明葉酸聯(lián)合B族維生素降低血Hcy水平對業(yè)已形成動脈粥樣硬化患者一級終點的改善并無明顯作用，但是降低血Hcy水平，有可能改善僅有高同型半胱氨酸危險因素(尚未形成動脈粥樣硬化斑塊)所致的血管內(nèi)皮功能損傷，從而阻遏動脈粥樣硬化的發(fā)生和/或發(fā)展。 Hhcy對心腦血管系統(tǒng)造成的損害仍不容小覷。到目前為止，Hhcy導致動脈粥樣硬化的機制仍未完全闡明。
最近國內(nèi)外研究表明，Hcy可能通過促進氧化應激，介導炎癥和免疫反應，促平滑肌細胞增殖，影響血管內(nèi)皮功能，激活血小板凝血系統(tǒng)，影響脂代謝等機制參與AS的發(fā)生發(fā)展。深入研究同型半胱氨酸致動脈粥樣化損傷的作用機制以及采取有效的干預措施，迫切需要一種能最真實地反映人類動脈粥樣硬化疾病進展過程且重復性好的動物模型。目前國際上普遍采用的建立HHcy動物模型的方法主要有1、飲食中添加高蛋氨酸/同型半胱氨酸或葉酸、維生素B12缺失誘導HHcy形成；2、采用基因缺陷小鼠常用于敲除的基因有核心家庭胱硫瞇β-合酶(CBQ、甲烯四氫葉酸還原酶(MTHFR)、載脂蛋白E (ApoE)0采用飲食誘導的方法成本較低，但是個體差異較大，重復性差，可控性低；而將同型半胱氨酸代謝過程中的關鍵酶作用缺失后形成的HHcy模型因其性狀穩(wěn)定，重復性好，已被廣泛應用。純合CBS基因缺陷小鼠的血漿Hcy水平可以達到正常水平的40倍以上，伴有嚴重的生長發(fā)育遲滯，肝脂肪變性，晶狀體錯位。雜和CBS基因缺陷小鼠血漿Hcy升高在2倍以上，且不伴有各種生長缺陷，因此成為研究輕度HHcy的理想模型。但是，多項研究表明，雖然出現(xiàn)了內(nèi)皮損傷，在CBS基因缺陷小鼠模型上并未觀察到動脈粥樣硬化病理損害發(fā)生。MTHFR基因缺陷小鼠的表現(xiàn)型與CBS基因缺陷小鼠相似，但發(fā)生動脈粥樣硬化的傾向更大。純合和雜和的MTHFR基因缺陷HHcy小鼠經(jīng)飲食誘導后都可以觀察到類似動脈粥樣硬化早期病變的主動脈脂質(zhì)沉積，而小鼠的血脂水平都在正常范圍，因此，MTHFR基因缺陷小鼠似乎可以成為單純輕度Hcy增高致動脈粥樣硬化的動物模型。
研究發(fā)現(xiàn)，給予高蛋氨酸或同型半胱氨酸飲食后，apoE基因缺陷小鼠可以形成大且結構復雜的多發(fā)動脈粥樣硬化斑塊。且飲食誘導對斑塊大小和數(shù)量的影響在前三個月即可出現(xiàn)，因此apoE基因缺陷小鼠可以用來研究HHcy在動脈粥樣硬化硬化早期階段的影響。 目前也已有研究成功構建了 apoE基因缺陷小鼠HHcy動脈粥樣硬化模型，并指出高蛋氨酸誘導兩月后已有動脈粥樣硬化病理改變，并發(fā)現(xiàn)其動脈粥樣硬化斑塊是不穩(wěn)定的。
綜上所述，三種基因缺陷小鼠模型均各有利弊。雖然MTHFR基因缺陷或者apoE基因缺陷HHcy小鼠可以觀察到類似動脈粥樣硬化早期病變的主動脈脂質(zhì)沉積，但也必須經(jīng)過飲食誘導。飲食誘導無非是在飲水或食物中添加蛋氨酸/同型半胱氨酸，或者使葉酸或維生素B12缺乏。這種方法可控性差，個體差異較大。一定濃度的蛋氨酸灌胃可以控制小鼠攝入的蛋氨酸劑量，但對小鼠的刺激較大，非藥物因素致死率增加。因此建立一種重復性高、可控性好的HHcy動脈粥樣硬化模型勢在必行。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種自發(fā)性HHcy相關動脈粥樣硬化轉基因小鼠動物模型的制備方法。
本發(fā)明的第二個目的是，提供一種利用上述制備方法制備獲得的轉基因小鼠動物模型。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種自發(fā)性HHcy相關動脈粥樣硬化轉基因小鼠動物模型的制備方法，包括以下步驟(1)選取U9/S6/SvEv品系雄性小鼠的ES細胞SCR012作為基因打靶所用細胞，并構建 Mthfr打靶載體；(2)利用電穿孔法進行基因打靶，篩選陽性ES克?。?3)利用顯微注射方法將陽性ES克隆植入C57BL/6J小鼠的囊胚；(4)利用嵌合體制備方法將注射后的囊胚移植入C57BL/6J雄性小鼠與CBA雌性小鼠的雜交一代假孕小鼠受體子宮內(nèi)；(5)將嵌合率大于50%的成熟小鼠與C57BL/6J雌性小鼠進行交配，后代小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進行PCR鑒定，獲得Mthfr基因剔除雜合小鼠。
為實現(xiàn)本發(fā)明第二個目的，本發(fā)明提供一種利用上述制備方法獲得的轉基因小鼠動物模型，所述轉基因小鼠動物模型為apoE和Mthfr雙重基因缺陷的HHcy相關動脈粥樣硬化轉基因小鼠動物模型。
本發(fā)明的優(yōu)點在于，apoE和MTHFR雙重基因缺陷的HHcy動脈粥樣硬化模型更好地結合了兩種基因缺失模型的特性，既可使其能夠自發(fā)形成HHcy血癥并發(fā)展為動脈粥樣硬化，又最大程度地避免了除Hcy以外其他致動脈粥樣硬化因素的作用。該動物模型重復性高、可控性好，易于飼養(yǎng)繁殖，彌補了現(xiàn)有動物模型的不足，且更穩(wěn)定、更符合臨床特點， 為HHcy相關動脈粥樣硬化的發(fā)生機制研究及干預措施的探索提供了更好的平臺。利用這個平臺，對于HHcy動脈粥樣硬化相關性以及藥物治療的研究將進一步深入且更加科學。


圖1為打靶質(zhì)粒構建示意圖。
圖2為質(zhì)粒酶切鑒定圖，打靶載體用EcoRI、HindIII酶切，目的條帶分別為 EcoRI :173bp、5641bp、7407bp ；HindIII :5999bp、7222bp。
圖3為ES克隆鑒定結果PCR電泳圖，Marker: Ikb ladder ;PCR陽性條帶4071bp。
圖4為ES克隆鑒定結果PCR電泳圖，Marker: Ikb ladder ;PCR陽性條帶2779bp。
圖5為小鼠尾巴DNA PCR 5’ arm鑒定圖。
圖6為小鼠尾巴DNA PCR 3’ arm鑒定圖。
圖7為apoE和MTHFR雙重基因缺陷小鼠及對照組小鼠。
圖8為各組小鼠血漿Hcy濃度，與ApoE (-\-)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE (_\_) *MTHFR(+\_)小鼠Hcy水平顯著增高，呈現(xiàn)統(tǒng)計學意義(P<0. 05)。
圖9為各組小鼠血漿TC、TG水平，其TC、TG水平較野生型和MTHFR (+\_)小鼠有顯著升高，但與ApoE(_\_)小鼠相比無明顯差異。
圖10為各組小鼠主動脈根部形態(tài)學改變(X 200)，其中圖10AU0B為4月齡野生型小鼠和ApoE(-\_)小鼠，其主動脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)彈力膜呈波浪狀；圖IOC為MTHFR(+\_)小鼠，其主動脈內(nèi)膜增厚，欠光滑，但未見斑塊生成；圖IOD為ApoE (-\-)*MTHFR(+\_)小鼠， 其主動脈根部出現(xiàn)斑塊，體積較大，表面覆蓋一層薄的纖維帽，并有大量炎性細胞浸潤，斑塊中膠原比例明顯增高，且有斑塊內(nèi)埋藏纖維帽和斑塊內(nèi)出血。
圖11為各組小鼠主動脈根部BiP和CHOP mRNA表達，RT-PCR結果表明，與ApoE (-\-)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE(-\-)*MTHFR(+\_)小鼠主動脈根部 BiP 和 CHOP 的 mRNA 表達水平顯著增高，半定量結果有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)。
圖12為各組小鼠主動脈根部BiP和CHOP蛋白水平的表達，Western-blot的結果表明，與 ApoE (-\-)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE (_\_) *MTHFR(+\_)小鼠主動脈根部 BiP 和CHOP的蛋白表達水平顯著增高，有統(tǒng)計學意義(P<0. 05)。
具體實施方式
下面結合附圖詳細說明本發(fā)明提供的自發(fā)性HHcy相關動脈粥樣硬化轉基因小鼠動物模型的制備方法的具體實施方式
，應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
實施例1、制備自發(fā)性HHcy相關動脈粥樣硬化轉基因小鼠動物模型 1.選取基因打靶所用細胞U9/S6/SvEv品系雄性小鼠ES細胞SCR012。
2.構建Mthfr打靶載體質(zhì)粒(見圖1)，質(zhì)粒酶切鑒定(見圖2)。
3.將打靶載體線性化將80ug Mthfr KO Vector質(zhì)粒DNA用NotI(酶用量100U) 酶切線形化，酶切體積200ul、37°C消化過夜；走膠分離純化，(膠回收試劑盒用QIAquick Gel Extraction Kit (Cat No. 28706))；隨后乙醇沉淀，IOOul 無菌的 PBS 重懸。
4. ES細胞打靶及篩選E S細胞SCR012 ；DNA量35 μ g ；電轉儀型號Bio — Rad Gene Pulser (Cat. No. 165-2105)；電穿孔條件電壓240 ν，電容500 μ F;實際通電時間 10. 5ms，實際電壓256 ν ；克隆篩選條件300 μ g/ml G418、2uM GanC篩選8天；挑取抗性克隆共96個，提供DNA樣本96份。
5. ES細胞基因組鑒定 1)鑒定策略(圖1)5，PCR鑒定鑒定引物5L&ne0R，目的片段為4071bp，退火溫度65°C ； PCR 引物序列Neo-R: CTGAGCCCAGAAAGCGAAGGA ；5L: GTGGCCCCACACTCTTCAAAGTTT。
3，PCR鑒定鑒定引物3R&neoF,目的片段為2779bp,退火溫度:65°C ； PCR 引物序列Neo-F: CCTCCCCCGTGCCTTCCTTGAC ；3R: CATGAAGGCCAGGCCAGGGTATTGG。
2) ES克隆鑒定結果共鑒定藥物抗性克隆96個，其中雙臂均發(fā)生正確同源克隆數(shù)12個，陽性率為12. 5%。 PCR電泳圖見圖3、圖4。
6.利用顯微注射方法將陽性ES克隆植入小鼠的囊胚。顯微注射用囊胚來源于 C57BL/6J小鼠超數(shù)排卵，自然受孕，體內(nèi)發(fā)育至囊胚階段。
利用嵌合體制備方法將注射后的囊胚移植入C57BL/6J( $ )與CBA(早)的雜交一代假孕小鼠受體子宮內(nèi)。將嵌合率大于50 %的成熟小鼠與C57BL/6J雌性小鼠進行交配，后代灰色小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進行鑒定(鑒定策略同上)，獲得本發(fā)明所述小鼠7只。
小鼠尾巴DNA PCR鑒定見圖5、圖6。
鑒定的引物和條件重組-Pl :GGGGAACTTCCTGACTAGGG ； 公共-P2:ATAACACGTTCCAGGCGAAG ； 野生-P3 CCCAGGGATGGATAACAGTG ；條帶大小homo:560bp heter 560+354bp wt 354bp tm: 60 度 30s，30cycles。
實施例2、驗證ApoE/MTHFR雙重基因缺陷小鼠是否會導致自發(fā)性HHcy相關動脈粥樣硬化(1)檢測模型Hcy和血脂譜的測定如圖 8 所示，與 ApoE(-\-)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE(-\-)*MTHFR(+\_)小鼠 Hcy 水平顯著增高，呈現(xiàn)統(tǒng)計學意義(P<0. 05);如圖9所示，其TC、TG水平較野生型和MTHFR(+\_) 小鼠有顯著升高，但與ApoE (-\-)小鼠相比無明顯差異。
(2)各組主動脈根部病理形態(tài)學改變?nèi)鐖D10所示，主動脈根部切片經(jīng)H&E染色后發(fā)現(xiàn)，4月齡野生型小鼠和ApoE(-\_)小鼠的主動脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)彈力膜呈波浪狀(圖10A，10B) ;MTHFR(+\_)小鼠的主動脈內(nèi)膜增厚，欠光滑，但未見斑塊生成(圖10C);ApoE (-\-)*MTHFR(+\_)小鼠主動脈根部出現(xiàn)斑塊， 體積較大，表面覆蓋一層薄的纖維帽，并有大量炎性細胞浸潤，斑塊中膠原比例明顯增高， 且有斑塊內(nèi)埋藏纖維帽和斑塊內(nèi)出血(圖10D)。
(3)各組小鼠主動脈根部BiP和CHOP mRNA表達如圖 11 所示，RT-PCR 結果表明與 ApoE (_\_)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE (_\_) *MTHFR (+\-)小鼠主動脈根部BiP和CHOP的mRNA表達水平顯著增高，半定量結果有統(tǒng)計學意義(Ρ<0· 05)。
(4)各組小鼠主動脈根部BiP和CHOP蛋白質(zhì)水平的表達如圖12所示，Western-blot的結果表明與ApoE (_\_)、MTHFR(+\_)小鼠相比，ApoE (-\") *MTHFR(+\_)小鼠主動脈根部BiP和CHOP的蛋白表達水平顯著增高，有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。
綜上，根據(jù)本發(fā)明提供的制備方法獲得的apoE和MTHFR雙重基因缺陷小鼠模型，由兩種基因缺失效應疊加，更好地結合了兩種基因缺失模型的特性，既可使其能夠自發(fā) HHcy并發(fā)展為動脈粥樣硬化，又最大程度地避免了除Hcy以外其他致動脈粥樣硬化因素的作用，彌補了先前各種動物模型的不足，且更穩(wěn)定、更符合臨床特點，為HHcy對動脈粥樣硬化的影響及干預措施的研究提供了更好的動物模型。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種自發(fā)性HHcy相關動脈粥樣硬化轉基因小鼠動物模型的制備方法，包括以下步驟(1)選取U9/S6/SvEv品系雄性小鼠的ES細胞SCR012作為基因打靶所用細胞，并構建 Mthfr打靶載體；(2)利用電穿孔法進行基因打靶，篩選陽性ES克??；(3)利用顯微注射方法將陽性ES克隆植入C57BL/6J小鼠的囊胚；(4)利用嵌合體制備方法將注射后的囊胚移植入C57BL/6J雄性小鼠與CBA雌性小鼠的雜交一代假孕小鼠受體子宮內(nèi)；(5)將嵌合率大于50%的成熟小鼠與C57BL/6J雌性小鼠進行交配，后代小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進行PCR鑒定，獲得Mthfr基因剔除雜合小鼠。
2.利用權利要求1所述的制備方法獲得的轉基因小鼠動物模型，其特征在于，所述轉基因小鼠動物模型為apoE和Mthfr雙重基因缺陷的HHcy相關動脈粥樣硬化轉基因小鼠動物模型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種apoE和Mthfr雙重基因缺陷的高同型半胱氨酸血癥相關動脈粥樣硬化轉基因小鼠動物模型及其制備方法，該動物模型更好地結合了兩種基因缺失模型的特性，既可使其能夠自發(fā)形成HHcy血癥并發(fā)展為動脈粥樣硬化，又最大程度地避免了除HHcy以外其他致動脈粥樣硬化因素的作用。該動物模型重復性高、可控性好，易于飼養(yǎng)繁殖，彌補了現(xiàn)有動物模型的不足，且更穩(wěn)定、更符合臨床特點，為HHcy相關動脈粥樣硬化的發(fā)生機制研究及干預措施的探索提供了更好的平臺。
文檔編號A01K67/027GK102517333SQ20111043769
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月23日 優(yōu)先權日2011年12月23日
發(fā)明者陸國平, 陳楨玥 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院