專利名稱：一種用于防治棉鈴疫病的萎縮芽孢桿菌及其微生物菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及一種用于防治棉鈴疫病的萎縮芽孢桿菌和含有該萎縮芽孢桿菌的微生物菌劑，以及它們在防治棉鈴疫病上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
棉鈴疫病是一種嚴(yán)重的棉花病害，由芒麻疫霉(Phytophthora boehmeriaesawada)引起，它不僅直接為害棉鈴，而且為其它病原菌提供了侵染條件。防治棉鈴疫病的方法主要是推株并壟、早摘爛鈴等栽培措施和化學(xué)藥劑防治。目前，我國種植棉花的經(jīng)濟(jì)效益較低，而且人工費(fèi)較高，農(nóng)民不愿投入太多精力來推株并攏；早摘爛鈴只能保住部分產(chǎn)量，不足以防控棉鈴疫??；化學(xué)藥劑雖然防治效果較好，但存在容易產(chǎn)生抗藥性，化學(xué)藥劑價格較貴，增加生產(chǎn)成本，以及環(huán)境污染等問題。因此，亟需尋找一種省時省力、高效并且成 本低廉的防治方法。利用有益微生物對植物病害進(jìn)行生物防治，因具有針對性強(qiáng)、防效高且環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)越來越受到重視。特別是在蔬菜氣傳病害和作物土傳病害上應(yīng)用較多。有關(guān)棉鈴疫病的生物防治方面研究很少。馬平等(馬平等.生物防治通報.1993.9(3))發(fā)現(xiàn)木霉菌和腐霉菌對棉鈴疫病具有一定防治效果，并篩選到生防細(xì)菌MB-3和MB-7，其發(fā)酵液10倍稀釋液對棉鈴疫病田間防治效果分別為34. 9%和45. 4% (馬平等 中國生物防治 1998. 14(2))。芽孢桿菌(Bacillus)具有分布廣、易分離培養(yǎng)、能產(chǎn)生抗逆性較強(qiáng)的芽孢、貯藏期長和使用方便等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的生防微生物，相比其他類型的生防因子，更有利于菌劑的生產(chǎn)，劑型加工，在環(huán)境中存活、定殖與繁殖。因此，篩選對病原菌具有抑制作用的芽孢桿菌是防治有關(guān)植物病害的最有效方法之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于防治棉鈴疫病的萎縮芽孢桿菌菌株，該菌株具有高效、廣譜殺菌活性等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明第二目的在于提供一種微生物菌劑。本發(fā)明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。本發(fā)明第四目的在于提供上述萎縮芽孢桿菌菌株在防治棉鈴疫病上的用途。本發(fā)明第五目的在于提供上述微生物菌劑在防治棉鈴疫病上的用途。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種萎縮芽抱桿菌(Bacillus atrophaeus)菌株 HMB22922,己于 2011 年 12 月 20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號為CGMCC No. 5614。一種微生物菌劑，其活性成分為萎縮芽孢桿菌HMB22922菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物。上述微生物菌劑可以為液體制劑。
上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟菌種活化，種子液制備和發(fā)酵培養(yǎng)。上述微生物菌劑的制備方法，具體包括如下步驟(I)菌種活化將低溫保存的HMB22922菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)24 36小時，得活化的菌株；(2)種子液制備用無菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟(I)活化的菌株接種到IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，在26 34°C、搖床轉(zhuǎn)速為170 210rpm條件下培養(yǎng)22 25小時，得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)按照體積比為0. 5% 3. 0%的比例將步驟⑵的種子液接入到蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基(PH值為5. 8 6. 2)中，在溫度為28 34°C、搖床轉(zhuǎn)速為170 210rpm 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)36 54h，得發(fā)酵液；所述的蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基，其組成成分及其重量百分比為:蔗糖 2. 0 3. 0%，豆餅粉 I. 6 2. 4%，NaCl 0. I 0. 2%，CaCO3 0. I 0. 3%，KH2PO4 0. 01 0. 03%和 MgSO4 7H20 0. 01 0. 03%，其余為水；(4)檢測發(fā)酵液中菌體和芽孢數(shù)量，待發(fā)酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌體總數(shù)的90%時停止發(fā)酵培養(yǎng)；所得即為HMB22922菌株的液體制劑。上述制備方法步驟(2)和(3)中所述的溫度優(yōu)選為30 32°C ;所述的搖床轉(zhuǎn)速優(yōu)選為210rpm ;所述的培養(yǎng)時間優(yōu)選為48h。所述的LB平板培養(yǎng)基、LB斜面培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基等按照常規(guī)方法制備。所述的蔗糖豆餅培養(yǎng)基的制備方法，按照重量百分比將蔗糖、豆餅粉、NaCl、CaCO3> KH2PO4和MgSO4 7H20混合，再加水，攪拌均勻即可。上述微生物菌劑，其萎縮芽孢桿菌HMB22922的活菌數(shù)大于8. 37 X 108cfu/mL。所述的萎縮芽孢桿菌HMB22922在防治棉鈴疫病上的應(yīng)用。上述微生物菌劑在防治棉鈴疫病上的應(yīng)用。本發(fā)明微生物菌劑的使用方法將上述所得微生物菌劑用水稀釋至活菌數(shù)為107cfu/mL，于棉鈴疫病發(fā)病前進(jìn)行棉鈴表面、中下部葉片噴霧，即可達(dá)到控制棉鈴疫病的目的。HMB22922菌株的篩選分離過程HMB22922菌株是河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從河北省辛集市玉米田土壤中分離得到的。2010年河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所從河北省辛集市玉米田中五點(diǎn)采集根際土壤，混勻后稱取5g放到250mL的滅菌三角瓶中，加入IOOmL無菌水,放到搖床上，170r/min振蕩30min，靜置2h，取上清液ImL加無菌水9mL，即成lOmLlO—2倍土壤微生物懸液，繼而將土壤懸液稀釋成10_3、10_4、10_5、10_6倍稀釋液，各濃度取200 u L微生物懸液涂于LB和KB培養(yǎng)基平板上，每個濃度3次重復(fù)，在28°C恒溫培養(yǎng)ld_3d，進(jìn)行細(xì)菌的分離和純化。并以棉鈴疫病為靶標(biāo)，利用平板對峙和離體青鈴人工接種進(jìn)行生防菌的篩選。結(jié)果從中篩選出一個對靶標(biāo)病害具有明顯防治效果的細(xì)菌菌株，定名為HMB22922。HMB22922菌株的分類鑒定(I)形態(tài)特征鑒定在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌體為桿狀，培養(yǎng)IOh后產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，橢圓形，孢囊不膨大，抗酸染色陰性，無伴孢晶體，能運(yùn)動，鞭毛周生。在營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤；培養(yǎng)后期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺；在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線培養(yǎng)，呈直線形；在液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)，表面形成白色菌膜。與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠等編著，科學(xué)出版社，2001年)中描述的芽孢桿菌屬形態(tài)特征基本一致，初步判斷菌株HMB22922屬于芽孢桿菌(Bacillus)o(2)利用16S rDNA序列鑒定分類以HMB22922的基因組DNA為模板，以F27和R1492為引物對16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的引物序列為F27 5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG3，； (SEQ ID No 2),R1492 :5’ GGCTACCTTGTTACGACTT3’ ； (SEQ ID No 3)；16S rDNA 的擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50 y L:10XPCR Buffer (Mg2+) 5 u L ；dNTPMixture(2. 5mM) 5 u L ；Taq(5U/u L) I u L, F27(10 u mol/L) I u L, R1492(10 u mol/ L)luL ；HMB22922 的基因組 DNA 50ng ；ddH20 補(bǔ)足至 50 y L。PCR 的反應(yīng)條件為 95 °C 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C I. 5min，30個循環(huán)-,1 TC IOmin0將所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，送交上海生工生物工程有限公司測序，得到HMB22922的16S rDNA序列(見SEQ ID No I)。將所得HMB22922的16S rDNA序列在Genbank中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果菌株HMB22922與芽孢桿菌屬的16S rDNA同源性達(dá)到99% (見圖3);構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)，HMB22922與萎縮芽孢桿菌聚合到一起，說明HMB22922是萎縮芽孢桿菌(B. atrophaeus)。(3)利用生理生化特征鑒定分類利用Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)可以測試菌株HMB22922對95種碳源的利用情況從而進(jìn)一步確定其種屬特征，提高菌株鑒定的可靠性。先將待測菌株的純培養(yǎng)菌落接入無菌水中，振蕩器震蕩制成細(xì)胞懸液，然后用多道移液槍接種于96孔GNIII鑒定板上培養(yǎng)，再用Biolog Microstation軟件讀取數(shù)據(jù),確定碳源利用情況。通過與BIOLOG系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫MicroLog software (Release Version 4.20.04)比對，可知待測菌株的分類。將 HMB22922菌株送交中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，利用Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定分類，鑒定結(jié)果表明HMB22922屬于萎縮芽抱桿菌(B. atrophaeus)。綜合以上形態(tài)特征、16S rDNA序列同源性對比分析，以及生理生化特征鑒定的結(jié)果，可知HMB22922屬于萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus),并且和現(xiàn)有的芽孢桿菌菌株不同，是一個新的萎縮芽孢桿菌菌株。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果(I)本發(fā)明為防治棉鈴疫病提供了一種有效的生物防治途徑；(2)本發(fā)明對棉鈴疫病的防治效果好，平均防效在80%以上，且針對性強(qiáng)；(3)本發(fā)明微生物菌劑對人、畜安全，沒有環(huán)境污染；(4)利用本發(fā)明防治棉鈴疫病不易產(chǎn)生抗藥性；(5)本發(fā)明微生物菌劑制備方法簡單、成本低、使用方便。


圖I.為萎縮芽孢桿菌HMB22922對棉鈴疫病菌的拮抗作用圖，其中A為萎縮芽孢桿菌HMB22922，B為棉鈴疫病菌。圖2.為HMB22922菌株根據(jù)16S rDNA序列獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。圖3.為本發(fā)明HMB22922菌株與萎縮芽孢桿菌1942菌株(B. atrophaeus 1942)的16S rDNA基因序列同源性比較圖譜；其中萎縮芽孢桿菌1942菌株序列中表示與HMB22922相應(yīng)的堿基相同，“g、a、C、t”表示萎縮芽孢桿菌1942菌株序列中與HMB22922相應(yīng)位點(diǎn)的堿基為g、a、c、t ”表示對應(yīng)位點(diǎn)的堿基缺失。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例IHMB22922微生物菌劑的制備，按照如下步驟進(jìn)行(I)菌種活化將保存于-40 °C的菌株HMB22922 (萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)菌株HMB22922已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5614)在LB平板培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為胰蛋白胨Ig酵母提取物0. 5g，氯化鈉lg，瓊脂粉15g，水IOOOmL)上進(jìn)行活化(30°C )，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為胰蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，、氯化鈉lg，瓊脂粉15g，水IOOOmL)上，在30°C下培養(yǎng)24 36小時；得活化的菌株；(2)種子液的制備按常規(guī)方法制作LB液體培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為胰蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，氯化鈉lg，水IOOOmL)，在250mL三角瓶中裝入LB液體培養(yǎng)基IOOmL,高壓濕熱滅菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入步驟⑴中一接種環(huán)活化好的菌株，在搖床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速190rpm、3(TC下培養(yǎng)24h，所得為種子液；(3)蔗糖豆餅培養(yǎng)基的制備按照重量百分比將蔗糖3.0%，豆餅粉2%，NaClO. I %, CaCO3 0. 3%, KH2PO4 0. 02% 和 MgSO4 7H20 0. 03% 加入水中，攪拌混合均勻，即得蔗糖豆餅培養(yǎng)基；分裝于500mL三角瓶中，每瓶200mL ;在121°C對蔗糖豆餅培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌30分鐘，再降溫到30°C備用；(4)發(fā)酵培養(yǎng)向步驟(3)所得每瓶蔗糖豆餅培養(yǎng)基200mL中接種步驟⑵所得種子液2mL ;在30°C、搖床轉(zhuǎn)速190rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)36h，以后每隔30分鐘從三角瓶中取樣進(jìn)行鏡檢，對視野中的芽孢和總菌體數(shù)進(jìn)行計數(shù)，并計算芽孢率(芽孢率(％)=成熟芽孢數(shù)/(成熟芽孢數(shù)+菌體數(shù))X 100);芽孢率達(dá)到90%即可停止發(fā)酵培養(yǎng)；共發(fā)酵培養(yǎng)約45 50h，即得萎縮芽孢桿菌HMB22922液體制劑。實(shí)施例2萎縮芽孢桿菌HMB22922對棉鈴疫病菌的拮抗作用試驗(yàn)(一 )、試驗(yàn)時間和地點(diǎn)2010年8月上旬在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。( 二)試驗(yàn)方法(I)供試棉鈴疫病菌來源棉鈴疫病菌5-1采自河北省滄州市獻(xiàn)縣河街鎮(zhèn)河街村棉株病鈴，經(jīng)河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離純化，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病理系鑒定為芒麻疫霉(Phytophthora boehmeriae),致病力測定表現(xiàn)為強(qiáng)致病力。(2)平板對峙實(shí)驗(yàn)首先將棉鈴疫病菌5-1在PDA平板上活化，培養(yǎng)5天后在菌落邊緣區(qū)域，用打孔器(0=6mm)打孔制成菌片，將棉鈴疫病菌菌片轉(zhuǎn)接在另一個PDA平板中央，再將活化后的萎縮芽孢桿菌HMB22922點(diǎn)接在距指示菌菌片2. 0厘米處，設(shè)空白對照(不點(diǎn)接HMB22922菌株的棉鈴疫病菌生長情況)。25°C恒溫培養(yǎng)，待空白對照即將長滿整個培養(yǎng)皿時，測量棉鈴疫病菌的對照生長量(菌落半徑)和處理生長量(接種HMB22922后的抑制生長半徑)，用拮抗作用抑菌率(抑菌率)=(對照生長量-處理生長量)/對照生長量X 100)表/Jn o(三)結(jié)果(表I)萎縮芽孢桿菌HMB22922對棉鈴疫病菌的抑制率達(dá)85.71 % ;透明的抑菌帶寬10. 0毫米(見圖I)。說明萎縮芽孢桿菌HMB22922對棉鈴疫病具有明顯的抑制作用，具有防治棉鈴疫病的生防潛力。表I萎縮芽孢桿菌HMB22922對棉鈴疫病菌的拮抗試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種萎縮芽抱桿菌(Bacillus atrophaeus)菌株 HMB22922,已于 2011 年 12 月 20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5614。
2.一種微生物菌劑，其特征在于其活性成分為萎縮芽孢桿菌HMB22922菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物。
3.按照權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于HMB22922的活菌數(shù)大于8.37X 108cfu/mL。
4.按照權(quán)利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于為液體制劑。
5.權(quán)利要求2所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟 (1)將低溫保存的HMB22922菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)24 36小時，得活化的菌株； (2)用無菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟(I)活化的菌株接種到IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，在26 34°C、搖床轉(zhuǎn)速為170 210rpm條件下培養(yǎng)22 25小時，得種子液； (3)按照體積比為0.5% 3.0%的比例將步驟(2)的種子液接入到蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基中，在溫度為28 34°C、搖床轉(zhuǎn)速為170 210rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)36 54h，得發(fā)酵液；所述的蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基，其組成成分及其重量百分比為蔗糖2. 0 3. 0%，豆餅粉I.6 2. 4%,NaCl 0. I 0. 2%,CaCO3 0. I 0. 3%,KH2PO4 0. 01 0. 03%和 MgSO4 *7H200.01 0. 03%，其余為水； (4)檢測發(fā)酵液中菌體和芽孢數(shù)量,待發(fā)酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌體總數(shù)的90%時停止發(fā)酵培養(yǎng)。
6.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的溫度為30 32。。。
7.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的搖床轉(zhuǎn)速為210rpmo
8.按照權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的培養(yǎng)時間為48h。
9.權(quán)利要求I所述的萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)菌株HMB22922在防治棉鈴疫病上的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2所述的微生物菌劑在防治棉鈴疫病上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于防治棉鈴疫病的萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)菌株HMB22922，于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.5614。本發(fā)明還公開了利用該菌株生產(chǎn)的微生物菌劑及其制備方法，菌劑的活性成分為HMB22922菌體和它的胞外代謝產(chǎn)物。本發(fā)明HMB22922菌株對棉鈴疫病有特異的防治作用，而且防效高，平均防效在80％以上；其次，本發(fā)明微生物菌劑對人、畜安全，沒有環(huán)境污染問題；以及利用本發(fā)明防治棉鈴疫病不易產(chǎn)生抗藥性；此外，本發(fā)明微生物菌劑制備方法簡單、成本低、使用方便。
文檔編號A01N63/00GK102747005SQ20121002808
公開日2012年10月24日 申請日期2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月9日
發(fā)明者李寶慶, 李社增, 郭慶港, 馬平, 鹿秀云 申請人:河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所