專利名稱：玉米抗病相關(guān)基因npr1的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是玉米抗病相關(guān)基因NPRl的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米(Zea mays L.)是世界上分布最廣泛的糧食作物之一，也是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。在我國，其分布范圍和種植面積都很大，是我國旱谷地區(qū)人民的主要糧食之一。但是每年由于病蟲害的侵染給人類帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失，雖然田間管理以及藥劑防治等傳統(tǒng)方法在一定程度上抑制了病蟲害的威脅，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力且污染環(huán)境，存在很大的局限性。隨著人類環(huán)保意識(shí)的加強(qiáng)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，怎樣利用生物學(xué)技術(shù)培養(yǎng)穩(wěn)定的高效抗病品種、成為一種趨勢。1961年Rose等在研究煙草抵御煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)時(shí)首先提出系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance, SAR),為培養(yǎng)植物廣譜抗病品種奠定了理論基礎(chǔ)。SAR是一種依賴于一種發(fā)病相關(guān)蛋白(pathogenesis-related protein,PR protein)的表達(dá)，當(dāng)植物受到病原微生物侵害時(shí)，通過一系列的反應(yīng)使整株植株在較長時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出對(duì)較廣泛的病原微生物的抵抗力的一種抗病機(jī)制。這種抗性具有系統(tǒng)、持久和廣譜的特點(diǎn)。1994年，Cao等人從擬南芥中分離獲得了一種NPRl突變體，這種突變體不能表達(dá)水楊酸(salicylic acid, SA)和 2,6- 二氯異煙餅(2,6-dichloroiso_nicotinicacid, INA),當(dāng)用SA或類似SA結(jié)構(gòu)的化學(xué)物質(zhì)處理這種突變體時(shí)，突變體抵御病原體的能力增強(qiáng)。后來證實(shí)NPRl是SAR系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因。關(guān)于SAR的反應(yīng)模型以及其與NPRl基因的關(guān)系，在擬南芥中已經(jīng)有一個(gè)簡單的模型首先，當(dāng)病原微生物侵染植株時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)植株體內(nèi)水楊酸含量的迅速提高；然后，作為正調(diào)控因子的NPRl被激活并向細(xì)胞核內(nèi)移動(dòng)，與核內(nèi)TGA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)而誘導(dǎo)核內(nèi)相關(guān)的抵抗基因的表達(dá)，從而使植株獲得抗性。NPR類基因編碼的蛋白含有兩個(gè)功能區(qū)域BTB/POZ (Broad-Complex, Tramtrack, and Bric-a-brac/Pox virus and Zinc nger)和錨蛋白重復(fù)區(qū)域(an ankyrin repeat domain)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都涉及到蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用，其中錨蛋白重復(fù)序列對(duì)NPRl基因發(fā)揮其功能的作用極為重要。擬南芥NPRl基因最早是從模式植物擬南芥中獲得，在花椰菜、甘藍(lán)、煙草、番茄、馬鈴薯、小麥、水稻、玉米等中存在其同源基因。2005年Mawsheng Chern等人構(gòu)建了水稻的NPRl過量表達(dá)載體并且證明了過量表達(dá)的NPRl轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)X. oryzae pv. Oryzae的抗性明顯增強(qiáng)。目前在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)六種NPR基因。水稻中存在五種，玉米NPRl基因NCBI登錄號(hào)NM_ 001154115，但關(guān)于玉米NPRl基因在研究和提高玉米廣譜抗病性中的作用還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種分離的多核苷酸。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種上述多核苷酸的用途。
本發(fā)明的另一的目的是，提供一種RNAi載體。本發(fā)明的第四個(gè)目的是，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的第五個(gè)目的是，提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸選自下列中的一種a)由部分或全部SEQ IDNO. 7所示的序列構(gòu)成的 核苷酸序列；或b)與a)中所限定的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。所述的多核苷酸的長度為250-600bp。優(yōu)選地,所述的多核苷酸選自下列中的一種a)由SEQ ID NO. 8所示的序列構(gòu)成的核苷酸序列；或b)與a)中所限定的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是如上所述的多核苷酸在降低或提高植物對(duì)病原物敏感性中的應(yīng)用。及如上所述的多核苷酸在增加或減少植物體內(nèi)水楊酸含量中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是所述的RNAi載體含有如上任一所述的多核苷酸的正向序列和反向序列。為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有如上所述的RNAi載體；或其基因組中整合有外源的如上任一所述的多核苷酸的正向序列和反向序列。為實(shí)現(xiàn)上述第五個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是所述的方法是把如上所述的RNAi載體導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官，并篩選出整合有如上任一所述的多核苷酸的正向序列和反向序列的植物細(xì)胞、組織或器官。所述的植物為禾本科植物。所述的禾本科植物選自玉米、水稻、小麥、大麥或高粱。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供了可用于改變玉米體內(nèi)水楊酸含量、進(jìn)一步改變其對(duì)病原物敏感性的干涉片段，構(gòu)建了有效的RNAi載體，證實(shí)了玉米基因NPRl在增強(qiáng)玉米抗病性中的作用，為提高玉米對(duì)病原物抵抗能力提供了一種新方法，同時(shí)可獲得玉米基因NPRl沉默的模式植物，對(duì)于研究玉米的廣譜抗病性有著非常積極的意義。


附圖I是PUC19載體圖譜。附圖2是pUCCRNAi載體載體圖譜。附圖3是pEASY-T3載體圖譜。附圖4是CPB載體圖譜。附圖5是野生植株和轉(zhuǎn)基因植株中SA含量比較結(jié)果，此含量的數(shù)值是利用高效液相色譜技術(shù)測定的結(jié)果經(jīng)過換算得來的，即用水楊酸的峰面積比內(nèi)參物質(zhì)的峰面積，內(nèi)參物質(zhì)的含量是一定的，由此來確定水楊酸含量的高低，I :野生型植株；2-5 :四株ZmNPRlR轉(zhuǎn)基因植株。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。實(shí)施例I一、材料
RNAiso Plus、AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司；Reverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Promega公司；pUC19載體(圖譜見圖I)、pUCCRNAi載體(圖譜見圖2)、CPB載體(圖譜見圖4)購于寶生物工程(大連)有限公司；PEASY-T3 (圖譜見圖3)購于北京全式金生物科技有限公司；DH5a感受態(tài)細(xì)胞購于寶生物工程(大連)有限公司，AGIO感受態(tài)農(nóng)桿菌購于Takara公司；植物基因組DNA提取試劑盒為康為世紀(jì)新型植物基因組DNA提取試劑盒；除草劑basta購于上海生工。YEP液體培養(yǎng)基配方牛肉浸膏10 g，酵母提取液10 g，NaCl 5 g，pH 7.0，對(duì)應(yīng)的固定培養(yǎng)基添加I. 5%的瓊脂；1/4MS培養(yǎng)基購于上海鼎杰生物科技有限公司。二、方法和結(jié)果 UTrizol法提取玉米齊319自交系葉片總RNA
實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中種植玉米齊319自交系，待生長至4葉期時(shí)將葉片剪下，液氮冷凍后于-70°C保存，即為提取材料。也可隨提隨取。取葉片O. lg，于液氮中研磨至粉末狀；加21111 RNAiso Plus，覆蓋樣品表面，室溫靜置至樣品完全融化，研棒研磨至裂解液透明狀為止；將勻衆(zhòng)轉(zhuǎn)移至I. 5ml eppendorf管中，每Iml —管，室溫靜置5min ;4°C下，12000rpm離心5min,吸取上清于另一干凈eppendorf管中，加200μ1氯仿異戊醇(24 1)，劇烈震蕩15s，室溫靜置5min ;4°C下，12000rpm離心15min，吸取上層水相于另一干凈管中，加600 μ I異丙醇，上下顛倒混勻，15_30°C下靜置IOmin ;4°C下，12000rpm 離心 IOmin ;去上清,力口 Iml 75% 乙醇，4°C 12000rpm 離心 5min,再去上清，重復(fù)此步驟一次；去乙醇，室溫干燥2-5min，使乙醇盡量去干凈，加20μ I RNA free水溶解RNA，-70°C中保存。2、反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為
MgCla, 25mM丨4 μ I
ReverseTranscriptionlO X Buffer2 μ I
dNTPMixture, IOmM2 μ I
RecombinantRNasinRibonucleaseInhibitor0. 5 μ I
AMVReverseTranscriptase(HighConc. )O. 5 μ I
Oligo (dT) 15PrimerI μ I
TotalRNA2 μ I
Nuclease-Freeffater8 μ I
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序是42°C，15min ；95°C，5min ；4°C，5min。3、PCR獲得候選基因
3.1引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)軟件為Primer Premier 5. O,引物序列如下
ZmNPRl-S (SEQ ID NO. I) GCCTTGATCACCTCTGGGCATAC ；
ZmNPRl-X (SEQ ID NO. 2) CAAGATGGAGGATCTCGTTCCC,
目的片段長度為1434bp。3. 2 PCR反應(yīng)體系如下
IOXPCRbuffer|5μ I
IOmMdNTPs4 μ I
引物 ZmNPRl-S1μ I
引物 ZmNPRl-X| μ I
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸選自下列中的一種 a)由部分或全部SEQID NO. 7所示的序列構(gòu)成的核苷酸序列；或 b)與a)中所限定的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸的長度為250_600bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸選自下列中的一種 a)由SEQID NO. 8所示的序列構(gòu)成的核苷酸序列；或 b)與a)中所限定的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的多核苷酸在降低或提高植物對(duì)病原物敏感性中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求1-3任一所述的多核苷酸在增加或減少植物體內(nèi)水楊酸含量中的應(yīng)用。
6.—種RNAi載體,其特征在于,所述的RNAi載體含有如權(quán)利要求1_3任一所述的多核苷酸的正向序列和反向序列。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞 含有如權(quán)利要求6所述的RNAi載體；或 其基因組中整合有外源的如權(quán)利要求1-3任一所述的多核苷酸的正向序列和反向序列。
8.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，所述的方法是把如權(quán)利要求6所述的RNAi載體導(dǎo)入植物細(xì)胞、組織或器官，并篩選出整合有如權(quán)利要求1-3任一所述的多核苷酸的正向序列和反向序列的植物細(xì)胞、組織或器官。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的植物為禾本科植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的禾本科植物選自玉米、水稻、小麥、大麥或高粱。
全文摘要
本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸選自下列中的一種a)由部分或全部SEQ ID NO.7所示的序列構(gòu)成的核苷酸序列；或b)與a)中所限定的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供上述多核苷酸在增加或減少植物體內(nèi)水楊酸含量、降低或提高植物對(duì)病原物敏感性中的應(yīng)用，并提供了有效的RNAi載體，證實(shí)了玉米基因NPR1在增強(qiáng)玉米抗病性中的作用，為提高玉米對(duì)病原物抵抗能力提供了一種新方法，同時(shí)可獲得玉米基因NPR1沉默的模式植物，對(duì)于研究玉米的廣譜抗病性有著非常積極的意義。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102703471SQ20121016973
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者彭曉劍, 朱蘇文, 江海洋, 洪玲, 程備久, 趙陽, 馬慶 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)