利用人的抗逆基因HsGST提高植物的抗逆性的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及作物遺傳育種領(lǐng)域，具體地說，利用農(nóng)桿菌將人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基 因轉(zhuǎn)化到植物中，使之能在植物中高效表達(dá)，提高植物的抗逆性。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然界中，由于不同的地理位置、氣候條件以及人類活動(dòng)等多方面原因，造成了各 種逆境，植物常在不利的環(huán)境條件下生長，如干旱、水澇、鹽害、低溫、高溫、病蟲害等。對農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)來說，各種逆境是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)最直接、最重要的因素。因此，加強(qiáng)植物抗性 生理的研宄，探明植物在逆境下的生命活動(dòng)規(guī)律并加以人為調(diào)控，培育具有抵抗不良環(huán)境 性狀的優(yōu)良品種，以提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，對于獲得農(nóng)業(yè)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。
[0003]谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase，簡稱GST，EC2. 5. 1. 18)是廣 泛分布于動(dòng)物、植物、鳥類、昆蟲及微生物體內(nèi)的一組多功能同工酶，其主要功能是催化各 種親電子化合物(如各種環(huán)境致癌物、污染物、藥物等）與還原型谷胱甘肽的巰基偶聯(lián)，增加 其疏水性而易于穿越細(xì)胞膜，分解后排出體外，從而達(dá)到解毒的作用。GST有多種亞型，其 中GSTA是人肝臟中主要的亞型，包括GSTA1，GSTA2,GSTA3,GSTA4,GSTA5五種亞型，占肝臟 GST的65% - 80%，具有重要的解毒功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的新用途，將該基因轉(zhuǎn)入植 物中，可提高植物對鹽、干旱的耐受性。
[0005] 所說的人抗逆相關(guān)基因，是HsGSTA3,它具有SEQIDNol的序列。
[0006] 上述基因編碼的蛋白質(zhì)，它具有SEQIDN〇2的氨基酸序列。
[0007] 上述基因HsGSTA3能用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，在制備抗逆的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0008] 上述所說的人抗逆相關(guān)基因HSGSTA3,是通過以下方法得到： 1.PTDS方法獲得人抗逆相關(guān)基因HsGSTA3 PTDS方法參照Xiong AS等[Xiong AS, Yao QH, Peng RH, Li X，F(xiàn)an HQ, Cheng ZM, Li Y (2004) A simple, rapid, high-fidelity and cost-effective PCR-based two-step DNA synthesis method for long gene sequence. Nucleic Acids. Res 32， e98]〇
[0009] 該方法共設(shè)計(jì)16對引物用于基因的合成。在50沿反應(yīng)體系中，內(nèi)側(cè)引物 (P2-P31)的添加量為10ng，外側(cè)引物（P1，P32)添加量為100ng，擴(kuò)增條件為：94 °C預(yù) 熱 10min;94 °C，30s;54 °C，30s;72 °C，40s;35 個(gè)循環(huán)；最后 72 °C延伸 10min。使 用的TaqDNA聚合酶為K0DFXtaq酶（Toyobo公司日本）擴(kuò)增目的基因。經(jīng)過1. 0%的瓊 脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物為一條約700bp的片段。
[0010] 2?引物的設(shè)計(jì)與合成 本發(fā)明設(shè)計(jì)16對引物，外側(cè)引物兩端分別引入和feci的酶切位點(diǎn)。引物順序 為5，一3，。
[0011] PI: AAGGATCCATGGCAGGGAAGCCCAAGCTTCACTACTTCAATGGACGGGGCAGAATGGAGCCCATC CGG P2: CCAGCTGCAGCCAAGAGCCACCGGATGGGCTCCATTCTGCCCCGTCCATTGAAGTAGTGA P3: GCAGAATGGAGCCCATCCGGTGGCTCTTGGCTGCAGCTGGAGTGGAGTTTGAAGAGAAAT P4: ATCTTCTGCAGATCCTATAAATTTCTCTTCAAACTCCACTCCAGCTGCAGCCAAGAGCCA P5: AGTGGAGTTTGAAGAGAAATTTATAGGATCTGCAGAAGATTTGGGAAAGTTAAGAAATGA P6: GCTGGAACATCAAACTCCCATCATTTCTTAACTTTCCCAAATCTTCTGCAGATCCTATAA P7: TTGGGAAAGTTAAGAAATGATGGGAGTTTGATGTTCCAGCAAGTACCAATGGTTGAGATT P8: TGTACCAACTTCATCCCATCAATCTCAACCATTGGTACTTGCTGGAACATCAAACTCCCA P9: TGGGAGTTTGATGTTCCAGCAAGTACCAATGGTTGAGATTGATGGGATGAAGTTGGTACA P10: AGTTGAGAATGGCTCTGGTCTGTACCAACTTCATCCCATCAATCTCAACCATTGGTACTT P11: GATGGGATGAAGTTGGTACAGACCAGAGCCATTCTCAACTACATTGCCAGCAAATACAAC P12: TTTATGTCTTTCCCGTAGAGGTTGTATTTGCTGGCAATGTAGTTGAGAATGGCTCTGGTC P13: ACATTGCCAGCAAATACAACCTCTACGGGAAAGACATAAAGGAGAGAGCCCTAATTGATA P14: TGCCATACCTTCTGTATACATATCAATTAGGGCTCTCTCCTTTATGTCTTTCCCGTAGAG P15: GGAGAGAGCCCTAATTGATATGTATACAGAAGGTATGGCAGATTTGAATGAAATGATCCT P16: GTCGACATAAGGGCAGAAGAAGGATCATTTCATTCAAATCTGCCATACCTTCTGTATACA P17: GATTTGAATGAAATGATCCTTCTTCTGCCCTTATGTCGACCTGAGGAAAAAGATGCCAA P18: TTCTCTTTGATCAAGGCAATCTTGGCATCTTTTTCCTCAGGTCGACATAAGGGCAGAAGA P19: CTGAGGAAAAAGATGCCAAGATTGCCTTGATCAAAGAGAAAACAAAAAGTCGCTATTTCC P20: TAACACTTTTTCGAAGGCAGGGAAATAGCGACTTTTTGTTTTCTCTTTGATCAAGGCAAT P21: AACAAAAAGTCGCTATTTCCCTGCCTTCGAAAAAGTGTTACAGAGCCATGGACAAGACTA P22: TCAGCTTGTTGCCAACAAGGTAGTCTTGTCCATGGCTCTGTAACACTTTTTCGAAGGCAG P23: CAGAGCCATGGACAAGACTACCTTGTTGGCAACAAGCTGAGCCGGGCTGACATTAGCCTG P24: ACATAGTAGAGAAGTTCCACCAGGCTAATGTCAGCCCGGCTCAGCTTGTTGCCAACAAGG P25: GCCGGGCTGACATTAGCCTGGTGGAACTTCTCTACTATGTGGAAGAGCTTGACTCCAGCC P26: CAGAGGGAAGTTGGAGATAAGGCTGGAGTCAAGCTCTTCCACATAGTAGAGAAGTTCCAC P27: GGAAGAGCTTGACTCCAGCCTTATCTCCAACTTCCCTCTGCTGAAGGCCCTGAAAACCAG P28: CCGTGGGCAGGTTGCTGATTCTGGTTTTCAGGGCCTTCAGCAGAGGGAAGTTGGAGATAA P29: CTGAAGGCCCTGAAAACCAGAATCAGCAACCTGCCCACGGTGAAGAAGTTTCTACAGCCT P30: GGAGGCTTCCTTGGGCTGCCAGGCTGTAGAAACTTCTTCACCGTGGGCAGGTTGCTGATT P31: TGAAGAAGTTTCTACAGCCTGGCAGCCCAAGGAAGCCTCCCGCAGATGCAAAAGCTTTAG P32: AAGAGCTCCTGAAAATCTTTCTGGCTTCTTCTAAAGCTTTTGCATCTGCGGGAGGCTTCCTTGGGCTG CC 引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成（http://www. sangon. com)。
[0012] 3.克隆鑒定與序列測定 擴(kuò)增片段采用愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州）有限公司（http://axygenbio. com) DNA瓊 脂糖凝膠回收試劑盒回收后，克隆到大連寶生物有限公司（http://takara.com.cn)的 pMD-18-SimpleT載體上進(jìn)行克隆鑒定和序列測定。
[0013] 4?序列分析 本發(fā)明通過核苷酸序列測定分析，最終獲得人抗逆相關(guān)基因HsGSTA3,其核苷酸序列信 息如SEQIDNol所示，其氨基酸序列如SEQIDNo2所示。
[0014] 本發(fā)明所述的抗逆基因HsGSTA3能用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，在培育提高抗逆性植物中 的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的有益效果： 本發(fā)明克隆了人HsGSTA3基因，為了進(jìn)一步分析該基因在鹽、干旱逆境中的作用與功 能，我們比較了轉(zhuǎn)HsGSTA3基因的擬南芥植株和野生型擬南芥植株對鹽、干旱脅迫的耐受 性。結(jié)果表明，野生型擬南芥和轉(zhuǎn)HsGSTA3基因的擬南芥植株在存活率上有明顯的差異，轉(zhuǎn) 基因植株比野生型植株有明顯的抗鹽、抗干旱能力，這也表明HsGSTA3基因的轉(zhuǎn)入提高了 擬南芥植株的抗鹽、抗干旱能力。
【附圖說明】
[0016]圖1 :瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。
[0018] 下述實(shí)施例中，所用的試驗(yàn)材料及其來源包括： 擬南芥L.)的種子經(jīng)過2.5% (￥八）〇3(010)2消毒后種植在 黑土：蛭石：珍珠巖（3 :9 :1)的混合基質(zhì)中，22 °C，16h光照培養(yǎng)（16h光照，8h黑暗，冷 光源）生長至抽薹。
[0019] 大腸桿菌（fccAericAiaco7i)DH5a由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研宄所植物基 因工程研宄室保存?？寺≥d體PMD-18-SimpleT、各類限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶、連接酶、 dNTP、10XPCRbuffer和DNAmarker購自寶生物工程大連有限公司。所有的化學(xué)試劑都 從美國西格瑪化學(xué)公司和上海國藥化學(xué)試劑公司購買。
[0020] 下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作參照分子克隆文獻(xiàn)進(jìn)行【SambookJ，F(xiàn)retsEF， Mannsdes T et al. In: Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press?1989]〇
[0021] 實(shí)施例1 PTDS方法獲得人抗逆相關(guān)基因HsGSTA3基因片段 (一）試驗(yàn)方法： 本發(fā)明設(shè)計(jì)16對引物（P1 -P32)，為了克隆鑒定等構(gòu)建需要，外側(cè)引物兩端分別引入HI和5^I的酶切位點(diǎn)。弓丨物順序?yàn)?' - 3、
[0022] P1: AAGGATCCATGGCAGGGAAGCCCAAGCTTCACTACTTCAATGGACGG