專利名稱：一種復(fù)合抗凍液及其應(yīng)用和使用該抗凍液保存人羊膜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織細(xì)胞保存技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合抗凍液及其在人羊膜液氮保存中的應(yīng)用和使用該抗凍液保存人羊膜的方法。
背景技術(shù)：
人羊膜(以下簡稱羊膜)分為上皮層、基底膜層、致密層、纖維母細(xì)胞層和海綿層，其中后三層又稱為基質(zhì)層。羊膜中有細(xì)胞與基質(zhì)，其中細(xì)胞又分為羊膜上皮細(xì)胞(為干細(xì)胞，分布在上皮層)和羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(分布在基質(zhì)層)，羊膜的這二種干細(xì)胞已被證明均具有進(jìn)一步向不同組織細(xì)胞分化以及分泌多種細(xì)胞因子的干細(xì)胞特性。其基質(zhì)也是良好的細(xì)胞支架材料。另外，羊膜還具有抗原性弱、無致瘤性、不受來源與倫理限制的優(yōu)勢。因此，羊膜在醫(yī)學(xué)多個領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛、需求也越來越大。解決羊膜在多個領(lǐng)域越來越大的需求之措施是將新鮮羊膜長期保存并建立羊膜庫，并使保存的羊膜細(xì)胞及基質(zhì)活性與新鮮羊膜相似，一旦需要隨時將保存羊膜復(fù)溫即可應(yīng)用。目前羊膜的保存分為常溫與深低溫保存二大類1、常溫保存方法簡單，就是將新鮮羊膜放在某些培養(yǎng)液中置于普通冰箱保存，但保存時間短、I 2周后其活性基本喪失，該方法顯然只能對新鮮羊膜進(jìn)行短暫的保存。2、深低溫保存方法又分為_80°C低溫冰箱保存與-196°C液氮保存，因后者較前者保存時間更長(理論上可“永久”保存)而用于羊膜的長期保存。國外 Lee 和 Tseng 米用 DMEM(Dulbeccc)' s modified Eagle' s medium)/甘油為抗凍劑成功地將羊膜在-80°C條件下儲存，此法被美國食品藥品管理局所推薦；但也有研究表明DMEM /甘油深低溫保存的羊膜活性銳減，其原因可能是在_80°C條件下分子運(yùn)動未完全受抑制、細(xì)胞代謝(包括酶代謝)過程并未完全停止，隨著保存時間的延長細(xì)胞活性減低乃至死亡、羊膜細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的功能也因此受到影響或障礙。而在_196°C液氮條件下，細(xì)胞內(nèi)各種代謝接近于“冬眠”或停止，理論上可“永久”保存羊膜細(xì)胞活性。目前國內(nèi)有學(xué)者采用簡化一步保存法(以(M199液/10%DMS0為抗凍劑)將羊膜儲存于液氮中，該方法屬于慢降溫法是將羊膜經(jīng)抗凍劑預(yù)處理后先用程序降溫儀(期間用液氮降溫)將羊膜逐步降到_80°C后再放入液氮保存。慢降溫法需要昂貴的程序降溫儀，其操作步驟多、耗時長、被污染的環(huán)節(jié)與費(fèi)用也增加，尤其是要大量保存羊膜并建立羊膜庫時，簡化一步保存法的不足顯而易見。如能研究一種無需程序降溫儀、保存效果好的快速降溫方法，即將經(jīng)抗凍劑預(yù)處理的羊膜直接放入液氮保存即可，其優(yōu)勢是不言而喻的。然而在液氮保存羊膜時，冰凍降溫與復(fù)溫二個階段都會對羊膜干細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，使保存的羊膜干細(xì)胞活性及其分泌功能受到明顯的影響。為減輕低溫對羊膜干細(xì)胞損傷，公認(rèn)的方法是先用抗凍劑對羊膜進(jìn)行預(yù)處理再進(jìn)行凍存?？箖鰟p輕冷凍過程中對組織損傷的作用機(jī)制較復(fù)雜，可能與下列因素有關(guān)1、減低冰晶形成速度與大小，從而減輕冰晶對細(xì)胞的直接損傷；2、減輕了細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成帶來的細(xì)胞內(nèi)外通透性變化；3、穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞膜流動性，減輕細(xì)胞膜損傷；4、二甲基亞砜(DMSO)還具有氧自由基清除作用。但抗凍劑(尤其是高濃度穿透性抗凍劑)本身也會造成細(xì)胞損傷?，F(xiàn)有技術(shù)中，將抗凍劑分為穿透性與非穿透性二種，常用的抗凍劑有二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇、甘油等，各種抗凍劑作用機(jī)制有所不同。由于單一抗凍劑很難達(dá)到冷凍保護(hù)的要求且毒性也大，因此目前常采用多種不同作用機(jī)制的抗凍劑聯(lián)合組成深低溫凍存的保護(hù)劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種復(fù)合抗凍液及其應(yīng)用和使用該抗凍液保存人羊膜的方法。采用本發(fā)明所述復(fù)合抗凍液對新鮮人羊 膜進(jìn)行預(yù)處理后不需使用程序降溫儀降溫即可直接置于液氮中保存，在簡化步驟、節(jié)約成本的同時縮短了預(yù)處理的時間、減少了污染，并可長期有效維持羊膜活性。本發(fā)明所述的一種復(fù)合抗凍液，它由基礎(chǔ)抗凍液和海藻糖組成，所述的基礎(chǔ)抗凍液由DMEM培養(yǎng)液、甘油和二甲基亞砜按4. 5 5. 5 :3. 5 4. 5 :0. 5 I. 5的體積比組成，所述海藻糖在復(fù)合抗凍液中的濃度為0. 05 0. 15mol/L。上述復(fù)合抗凍液配方中，所述基礎(chǔ)抗凍液優(yōu)選由DMEM培養(yǎng)液、甘油和二甲基亞砜按5 :4 :1的優(yōu)選體積比組成。其中DMEM培養(yǎng)液可以是高糖型的也可以是低糖型的，優(yōu)選低糖型。所述海藻糖在復(fù)合抗凍液中的濃度優(yōu)選為0. lmol/L。上述復(fù)合抗凍液只需要按配比量量取相應(yīng)組分混合均勻即可，具體為先按4. 5 5. 5 :3. 5 4. 5 :0. 5 I. 5的體積比量取DMEM培養(yǎng)液、甘油和二甲基亞砜，混合均勻，得到基礎(chǔ)抗凍液，然后再向基礎(chǔ)抗凍液添加海藻糖，控制海藻糖在復(fù)合抗凍液中的濃度為 0.05 0. 15mol/L。本發(fā)明還包括上述復(fù)合抗凍液在保存羊膜活性中的應(yīng)用。本發(fā)明還包括用上述復(fù)合抗凍液保存人羊膜的方法，具體是將人羊膜浸于0 4°C復(fù)合抗凍液中3 lOmin，取出，平鋪于兩層無菌塑料薄膜之間并用封口機(jī)封口，于密封后的塑料薄膜上平鋪一層塑料管，將密封后的塑料膜和塑料管卷成筒狀，外套橡皮筋固定，編號后立即置入液氮罐中保存。通過在密封后的塑料薄膜上平鋪一層塑料管再卷成筒狀，使得在冷凍時包含有羊膜的塑料薄膜的內(nèi)、外層受冷均勻。采用上述方法保存的人羊膜的復(fù)溫方法為取出人羊膜在40 42°C無菌生理鹽水水浴中復(fù)溫90 120s，再放入0 4°C無菌生理鹽水中清除人羊膜上的復(fù)合抗凍液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的特點(diǎn)在于I、所述抗凍液選用穿透性抗凍劑(甘油、二甲基亞砜)和非穿透性抗凍劑(海藻糖)結(jié)合，前者通過迅速滲透入細(xì)胞內(nèi)部，稀釋胞內(nèi)電解質(zhì)，降低冷凍過程中的溶液效應(yīng)，改變水分子的排列，從而改變胞內(nèi)外的冰晶結(jié)構(gòu)；而海藻糖則在冷凍前使細(xì)胞脫水、避免防凍劑滲入細(xì)胞從而導(dǎo)致細(xì)胞的過度膨脹和滲透性損傷，從而達(dá)到降低膜相變溫度、穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)生物大分子結(jié)構(gòu)以及達(dá)到良好的玻璃化特性的目的。2、用上述復(fù)合抗凍液對新鮮羊膜預(yù)處理后直接快速置于液氮中的方法，主要是基于羊膜是由單層上皮細(xì)胞及基質(zhì)組成的非常薄的具有半通透性的半透明膜，對抗凍劑通透性好，快速降溫后可使抗凍劑形成一種具有高黏度的介于液態(tài)和固態(tài)之間的、非晶體狀態(tài)的、雜亂無章的、透明的玻璃狀態(tài)，胞內(nèi)外的液體可迅速通過-5 -15°C的冷凍敏感區(qū)，避免了凍存過程中的冰晶形成，減少了對羊膜上皮細(xì)胞的損傷；另外，在_196°C條件下分子運(yùn)動完全受到抑制，細(xì)胞全部的生理和生化反應(yīng)幾乎完全停止，因而細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，從而可以長期有效地保存羊膜活性。3、使用本發(fā)明所述復(fù)合抗凍液對新鮮羊膜進(jìn)行處理后不需使用程序降溫儀降溫即可直接置于液氮中保存，操作簡單、成本低、減少了污染機(jī)會。



圖I為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中未經(jīng)任何處理的新鮮羊膜進(jìn)行HE染色后羊膜的細(xì)胞形態(tài)(光學(xué)顯微鏡X 400)；圖2為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中A組羊膜保存I個月后進(jìn)行HE染色后羊膜的細(xì)胞形態(tài)(光學(xué)顯微鏡X 400)；圖3為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中A組羊膜保存3個月后進(jìn)行HE染色后羊膜的細(xì)胞形態(tài)(光學(xué)顯微鏡X 400)；圖4為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中B組羊膜保存I個月后進(jìn)行HE染色后羊膜的細(xì)胞形態(tài)(光學(xué)顯微鏡X 400)；圖5為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中B組羊膜保存3個月后進(jìn)行HE染色后羊膜的細(xì)胞形態(tài)(光學(xué)顯微鏡X 400)；圖6為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中C組羊膜保存I個月后進(jìn)行HE染色后羊膜的細(xì)胞形態(tài)(光學(xué)顯微鏡X 400)；圖7為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中C組羊膜保存3個月后進(jìn)行HE染色后羊膜的細(xì)胞形態(tài)(光學(xué)顯微鏡X 400)；圖8為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中D組羊膜保存I個月后進(jìn)行HE染色后羊膜的細(xì)胞形態(tài)(光學(xué)顯微鏡X 400)；圖9為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中D組羊膜保存3個月后進(jìn)行HE染色后羊膜的細(xì)胞形態(tài)(光學(xué)顯微鏡X 400)；圖10為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中未經(jīng)任何處理的新鮮羊膜進(jìn)行臺盼藍(lán)染色后羊膜上皮細(xì)胞的存活情況(光學(xué)顯微鏡X 200)；圖11為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中A組羊膜保存I個月后進(jìn)行臺盼藍(lán)染色后羊膜上皮細(xì)胞的存活情況(光學(xué)顯微鏡X 200)；圖12為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中A組羊膜保存3個月后進(jìn)行臺盼藍(lán)染色后羊膜上皮細(xì)胞的存活情況(光學(xué)顯微鏡X 200)；圖13為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中B組羊膜保存I個月后進(jìn)行臺盼藍(lán)染色后羊膜上皮細(xì)胞的存活情況(光學(xué)顯微鏡X 20)；圖14為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中B組羊膜保存3個月后進(jìn)行臺盼藍(lán)染色后羊膜上皮細(xì)胞的存活情況(光學(xué)顯微鏡X 200)；圖15為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中C組羊膜保存I個月后進(jìn)行臺盼藍(lán)染色后羊膜上皮細(xì)胞的存活情況(光學(xué)顯微鏡X 200)；圖16為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中C組羊膜保存3個月后進(jìn)行臺盼藍(lán)染色后羊膜上皮細(xì)胞的存活情況(光學(xué)顯微鏡X 200)；圖17為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中D組羊膜保存I個月后進(jìn)行臺盼藍(lán)染色后羊膜上皮細(xì)胞的存活情況(光學(xué)顯微鏡X 200)；圖18為本發(fā)明所述實(shí)驗(yàn)例中D組羊膜保存3個月后進(jìn)行臺盼藍(lán)染色后羊膜上皮細(xì)胞的存活情況(光學(xué)顯微鏡X 200)。
具體實(shí)施方式
下面以具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例I :復(fù)合抗凍液按5 :4 :1的體積比量取DMEM培養(yǎng)液、甘油和二甲基亞砜，混合均勻，得到基礎(chǔ)抗凍液，然后再向基礎(chǔ)抗凍液中加入海藻糖，控制海藻糖在復(fù)合抗凍液中的濃度為0. lmol/L,得到海藻糖終濃度為0. lmol/L的復(fù)合抗凍液。實(shí)施例2 :復(fù)合抗凍液按4. 5 :4. 5 :1的體積比量取DMEM培養(yǎng)液、甘油和二甲基亞砜，混合均勻，得到基礎(chǔ)抗凍液，然后再向基礎(chǔ)抗凍液中加入海藻糖，控制海藻糖在復(fù)合抗凍液中的濃度為0. lmol/L，得到海藻糖終濃度為0. lmol/L的復(fù)合抗凍液。實(shí)施例3 :復(fù)合抗凍液按5. 5 :3. 5 :1. 5的體積比量取DMEM培養(yǎng)液、甘油和二甲基亞砜，混合均勻，得到基礎(chǔ)抗凍液，然后再向基礎(chǔ)抗凍液中加入海藻糖，控制海藻糖在復(fù)合抗凍液中的濃度為0. 05mol/L，得到海藻糖終濃度為0. 05mol/L的復(fù)合抗凍液。實(shí)施例4 :復(fù)合抗凍液按5 :3. 5 :0. 5的體積比量取DMEM培養(yǎng)液、甘油和二甲基亞砜，混合均勻，得到基礎(chǔ)抗凍液，然后再向基礎(chǔ)抗凍液中加入海藻糖，控制海藻糖在復(fù)合抗凍液中的濃度為0. 15mol/L，得到海藻糖終濃度為0. 15mol/L的復(fù)合抗凍液。實(shí)驗(yàn)例保存羊膜的實(shí)驗(yàn)I、實(shí)驗(yàn)用材料桂林某醫(yī)院剖宮產(chǎn)新鮮人胎盤12只，均為足月妊娠孕婦，年齡25 30歲獲取胎盤時間為術(shù)后0. 5 lh。產(chǎn)前通過血清學(xué)檢查孕婦無人免疫缺陷病毒，乙型、丙型肝炎病毒和梅毒感染。將胎盤用含有50iig / ml青霉素、50iig / ml鏈霉素、100 ii g / ml新霉素和2. g / ml 二性霉素B的無菌生理鹽水反復(fù)沖洗以去除積血，上皮面積血和基底面殘存的絨毛膜和血管組織，鈍性分離并剪下完整羊膜置一無菌平盤中，此時肉眼觀察其呈一半透明乳白色薄膜。然后用無菌剪將其剪成5. OcmX 5. Ocm大小方形塊備用。2、實(shí)驗(yàn)用抗凍液復(fù)合抗凍液I :取8ml DMEM培養(yǎng)液(低糖型，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司)和8ml甘油(DMEM :甘油=1 :1，體積)混合均勻，即得。復(fù)合抗凍液2 -M IOml DMEM培養(yǎng)液(低糖型，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司)、8ml甘油和2ml 二甲基亞砜(DMEM :甘油二甲基亞砜=5 4 體積)混合均勻，即得。復(fù)合抗凍液3 :取IOml DMEM培養(yǎng)液(低糖型，賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司)、8ml甘油和2ml 二甲基亞砜(DMEM :甘油二甲基亞砜=5 4 :1，體積)混合均勻,得到基礎(chǔ)抗凍液，然后再向基礎(chǔ)抗凍液添加0. 684g的海藻糖，得到海藻糖終濃度為0. lmol/L的復(fù)合抗凍液。3、實(shí)驗(yàn)分組及保存方法將上述取得的新鮮羊膜分成A組、B組、C組和D組，其中A組作為對照組，將其浸沒于0 4°C生理鹽水中5min，取出，平鋪于兩層無菌塑料薄膜之間并用封口機(jī)封口，于密封后的塑料薄膜上平鋪 一層塑料管，將密封后的塑料膜和塑料管卷成筒狀，外套橡皮筋固定，編號后立即置入液氮罐中保存。B組、C組和D組作為實(shí)驗(yàn)組，將B組、C組和D組分別用上述復(fù)合抗凍液I、復(fù)合抗凍液2和復(fù)合抗凍液3進(jìn)行預(yù)處理后直接置于液氮中保存，具體方法為將B組、C組和D組羊膜分別浸沒于0 4°C生理鹽水中5min，取出，分別平鋪于兩層無菌塑料薄膜之間并用封口機(jī)封口，分別于密封后的塑料薄膜上平鋪一層塑料管，將密封后的塑料膜和塑料管卷成筒狀，外套橡皮筋固定，編號后立即置入液氮罐中保存。4、復(fù)溫方法將各組羊膜從液氮取出后迅速置于40 42°C無菌生理鹽水中復(fù)溫100秒，再將各組羊膜分別放入4°C無菌生理鹽水中清除羊膜上的復(fù)合抗凍液。5、羊膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)、活性及其分泌功能檢測方法及結(jié)果5. IHE染色方法及檢測結(jié)果取上述新鮮羊膜(未經(jīng)任何處理)進(jìn)行HE染色(HE染色方法參照病理檢驗(yàn)技術(shù)，鄧步華，高等教育出版社，2005年第I版80-83，下同)，并對羊膜細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行檢查(光學(xué)顯微鏡下X400)，如圖I所示，可見，上皮層由單層立方上皮細(xì)胞組成，細(xì)胞形態(tài)完好，胞核清晰居中，排列整齊緊密，其下可見一層連續(xù)、均質(zhì)紅染的基底膜。將上述A組、B組、C組和D組按上述3中所述方法保存I個月和3個月后，分別進(jìn)行取樣，樣品復(fù)溫后分別進(jìn)行染色，并對各組羊膜的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較(光學(xué)顯微鏡下X400)，其結(jié)果如下A組保存I個月可見上皮細(xì)胞變形，大小不一，細(xì)胞間距增加，胞核深染皺縮，細(xì)胞膜較清晰，基底膜略完整，具體如圖2所示；保存3個月可見上皮細(xì)胞變形嚴(yán)重，排列稀疏、部分脫落，胞核不規(guī)則，部分細(xì)胞核消失，細(xì)胞膜欠清，細(xì)胞融合，基底膜模糊不清，具體如圖3所示。B組保存I個月可見上皮細(xì)胞扁化、排列較緊密，細(xì)胞核略有皺縮，基底膜較完整，具體如圖4所示；保存3個月可見上皮細(xì)胞變形，排列緊湊，胞核固縮，部分靠近細(xì)胞基底部，部分細(xì)胞融合，基底膜變薄且不連續(xù)，具體如圖5所示。C組保存I個月可見上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，基底膜連續(xù)，具體如圖6所示；保存3個月可見細(xì)胞及胞核扁平化，細(xì)胞間距加大，基底膜較完整，具體如圖7所示。D組保存I個月可見上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好，胞核形態(tài)正常，細(xì)胞排列緊湊，基底膜保存完整，形態(tài)結(jié)構(gòu)更接近新鮮羊膜，具體如圖8所示；保存3個月細(xì)胞結(jié)構(gòu)與保存I個月相近，具體如圖9所示。
5. 2臺盼藍(lán)染色對上述取得的新鮮羊膜(未經(jīng)任何處理)進(jìn)行臺盼藍(lán)染色(臺盼藍(lán)染色參照許麗英，陳家棋，周世有等，新鮮羊膜的活性維持方法研究，中國實(shí)用眼科雜志，2002，2 (20)137-139.，下同)，其存活情況如圖10所示，可見上皮細(xì)胞全部存活，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，分布均勻(光學(xué)顯微鏡下X 200)。將上述A組、B組、C組和D組按上述3中所述方法保存I個月和3個月后，分別進(jìn)行取樣，樣品復(fù)溫后分別進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，并對各組羊膜的存活情況進(jìn)行比較(光學(xué)顯微鏡下X 200)，其結(jié)果如下 A組保存I個月可見上皮細(xì)胞多數(shù)死亡(藍(lán)染)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，具體如圖11所示；保存3個月可見絕大多數(shù)羊膜的上皮細(xì)胞死亡，部分細(xì)胞破碎，具體如圖12所示。B組保存I個月可見羊膜上皮細(xì)胞部分死亡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，分布均勻，具體如圖13所示；保存3個月可見上皮細(xì)胞大面積死亡，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，部分細(xì)胞破碎，具體如圖14所示。C組保存I個月可見羊膜上皮細(xì)胞大部分存活，少量細(xì)胞死亡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，分布均勻，具體如圖15所示；保存3個月可見上皮細(xì)胞死亡數(shù)量增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，少量細(xì)胞破碎，具體如圖16所示。D組保存I個月可見絕大多數(shù)羊膜上皮細(xì)胞存活，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，分布均勻，具體如圖17所示；保存3個月羊膜上皮細(xì)胞存活良好，與保存I個月結(jié)果相近，具體如圖18所
/Jn o參考臺盼藍(lán)染色排除法的改良方法，將羊膜塊平鋪在培養(yǎng)皿上(上皮面向上)，PBS液漂洗兩次，直接加入0. 1%臺盼蘭染料，室溫下(20 22°C )浸染3分鐘，取出羊膜塊再次用PBS液沖洗lmin。將羊膜平鋪在載玻片上，光學(xué)顯微鏡下(X200)計算上皮細(xì)胞被染成藍(lán)色的死亡細(xì)胞百分比，每次隨機(jī)選擇6個區(qū)域，每個區(qū)域共計算1000個細(xì)胞。羊膜細(xì)胞活性檢測結(jié)果如下述表I所示。表I :各組保存羊膜上皮細(xì)胞死亡率測定結(jié)果(Y 土SM
SI樣本數(shù)保存I個月(n=6) 保存3個月(n=6) Fl~
IWi639.96 ±5.84**81.50 土4.50**13. 796~
B 組621.61 ±6.65*36.76±10.72*2.940
C 組614.08±3.21*29.68±8. 19*4. 344
I)組68. 51±112. 70±5.70I IllD 組與各組比較，**P < 0. 01 ;*P < 0. 05。由表I數(shù)據(jù)可知，D組方法保存的羊膜上皮細(xì)胞成活率最高、保存效果最好。5. 3免疫組織化學(xué)檢測及結(jié)果取各組羊膜塊用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后連續(xù)切片，厚度約4 y m。EGF免疫組織化學(xué)染色石蠟切片酶消化程序如下石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水新鮮配置3%H202，室溫10分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水洗2分鐘X 3次。滴加復(fù)合消化液，放人37°C水浴箱內(nèi)20分鐘，蒸餾水洗2分鐘X3次。滴加山羊血清封閉液，室溫20分鐘，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。甩去多余液體，不洗。滴加EGF-抗(兔IgG)，37°C水浴箱內(nèi)孵育I. 5小時，0. OlMPBS洗2分鐘X 3次。PBS代替I抗染色作為陰性對照。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37°C水浴箱內(nèi)20分鐘，0. OlM PBS洗2分鐘X 3次，滴加試劑SABC, 37°C 20分鐘。0. OlM PBS洗10分鐘X 4次。DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，約5分鐘。蒸餾水洗滌5 7分鐘。脫水、透明、封片。顯微鏡觀察、照相，每組隨機(jī)選擇6個高倍視野，并應(yīng)用圖象分析系統(tǒng)(Image-Pix)Plus 6.0)測量羊膜上皮層的平均積分光密度值。羊膜細(xì)胞因子(EGF)的表達(dá)(免疫組化)如下述表2所示。表2各組不同保存時間羊膜EGF表達(dá)組內(nèi)比較(IOD/iim2，Y 土S)
權(quán)利要求
1.ー種復(fù)合抗凍液，其特征在于它由基礎(chǔ)抗凍液和海藻糖組成，所述的基礎(chǔ)抗凍液由DMEM培養(yǎng)液、甘油和ニ甲基亞砜按4. 5 5. 5 :3. 5 4. 5 :0. 5 I. 5的體積比組成，所述海藻糖在復(fù)合抗凍液中的濃度為0. 05 0. 15mol/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的復(fù)合抗凍液，其特征在于所述的基礎(chǔ)抗凍液由DMEM培養(yǎng)液、甘油和ニ甲基亞砜按5 4 1的體積比組成。
3.權(quán)利要求I或2所述的復(fù)合抗凍液，其特征在于所述海藻糖在復(fù)合抗凍液中的濃度為 0. lmol/L。
4.權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的復(fù)合抗凍液在保存人羊膜活性中的應(yīng)用。
5.使用權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的復(fù)合抗凍液保存人羊膜的方法，其特征在于是將人羊膜浸于0 4°C復(fù)合抗凍液中3 lOmin，取出，平鋪于兩層無菌塑料薄膜之間并用封ロ機(jī)封ロ，于密封后的塑料薄膜上平鋪ー層塑料管，將密封后的塑料膜和塑料管卷成筒狀，外套橡皮筋固定，編號后立即置入液氮罐中保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于經(jīng)保存的人羊膜的復(fù)溫方法為取出人羊膜在40 42°C無菌生理鹽水水浴中復(fù)溫90 120s，再放入0 4°C無菌生理鹽水中清除人羊膜上的復(fù)合抗凍液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復(fù)合抗凍液及其應(yīng)用和使用該抗凍液保存人羊膜的方法。其中所述的復(fù)合抗凍液，是由基礎(chǔ)抗凍液和海藻糖組成，所述的基礎(chǔ)抗凍液由DMEM培養(yǎng)液、甘油和二甲基亞砜按4.5～5.5∶3.5～4.5∶0.5～1.5的體積比組成，所述海藻糖在復(fù)合抗凍液中的濃度為0.05～0.15mol/L。采用本發(fā)明所述復(fù)合抗凍液對新鮮人羊膜進(jìn)行預(yù)處理后不需使用程序降溫儀降溫即可直接置于液氮中保存，在簡化步驟、節(jié)約成本的同時縮短了預(yù)處理的時間、減少了污染，并可長期有效維持羊膜活性。
文檔編號A01N1/02GK102763639SQ201210250809
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者馮小艷, 呂禮芳, 朱富軍, 朱金紅, 楊文賢, 童亞林, 詹球, 辛海明 申請人:童亞林