專利名稱：一種雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于雜交水稻種子測定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法。
背景技術(shù)：
種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最基本的生產(chǎn)資料，種子活力是種子重要的質(zhì)量性狀，高活力種子具有明顯的生長優(yōu)勢和生產(chǎn)潛力，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有十分重要的意義。隨著種子產(chǎn)業(yè)化和信息化的發(fā)展，種子活力快速測定在種子質(zhì)量檢測和種子貿(mào)易中顯得越來越重要。目前種子活力的檢測方法可分為幼苗生長特性測定、逆境抗性測定和生化測定三大類，其中最常用的活力測定方法有幼苗生長測定、抗冷測定、低溫發(fā)芽、加速老化、種子浸出液電導(dǎo)率測定和ATP含量測定等。目前水稻種子活力測定最常用的方法仍然是基于發(fā)芽試驗的生長測定，常用發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等指標來評價其活力狀況。但在種子發(fā)芽試驗中常遇到種子因水分偏差、病菌蔓延等原因造成的爛床、霉變，從而導(dǎo)致發(fā)芽率不可靠的現(xiàn)象，并且·標準發(fā)芽試驗存在手續(xù)煩，設(shè)備多，時間長等缺點。多年來，許多種子科學(xué)家都在尋找快速方法來代替發(fā)芽試驗。例如，在豌豆種子活力測定中的標準化方法電導(dǎo)法已廣泛應(yīng)用于大豆、棉花、玉米等種子的活力測定。但電導(dǎo)法在水稻種子活力測定中因穩(wěn)定性差，因此它主要作為輔助補充方法。經(jīng)世界許多種子科學(xué)家用標準發(fā)芽與四唑測定的對比試驗表明，四唑測定結(jié)果與標準發(fā)芽率一般很接近，但檢測過程較繁瑣，且需要檢測者相當(dāng)?shù)慕?jīng)驗，檢測效率低。由此可見，目前的活力測定方法無法適應(yīng)現(xiàn)代規(guī)?；拇笈糠N子的快速測定。氧傳感技術(shù)(Q2技術(shù))是荷蘭ASTEC Global公司基于熒光猝滅原理開發(fā)的，通過測定種子萌發(fā)過程中的耗氧量來鑒定種子的質(zhì)量水平。其自動化檢測的特點為種子活力的快速檢測提供了有效途徑。但目前氧傳感技術(shù)目前僅用于少數(shù)幾個植物(如甜菜、番茄、辣椒、杉木、馬尾松等)種子的活力檢測。筆者多年的研究結(jié)果表明，氧代謝指標IMT(萌發(fā)啟動時間)與杉木和馬尾松種子活力相關(guān)關(guān)系不穩(wěn)定，但其它指標如氧氣消耗速率(OMR)與它們的活力呈正相關(guān)、與理論萌發(fā)時間(RGT)、關(guān)鍵氧氣壓力(COP)呈負相關(guān)。筆者利用氧傳感技術(shù)檢測引發(fā)后番茄種子的活力獲得了與發(fā)芽試驗一致的結(jié)果，引發(fā)后番茄種子的活力顯著提高(MT、RGT值降低，OMR值增加)，與發(fā)芽試驗中發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)反映的結(jié)果一致。但并不是所有的氧代謝指標均能較好的反映其活力狀況，一些氧代謝指標與上述植物種子活力之間的關(guān)系并不密切，氧傳感檢測方法的準確性還有待進一步驗證。但水稻種子目前還沒有專門的氧傳感測定程序，且迄今未見應(yīng)用氧傳感技術(shù)檢測雜交水稻種子活力的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明實施例的目的在于提供一種快速、準確的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法。本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，所述測定方法包括以下步驟稱取瓊脂，加入超純水，配制瓊脂溶液，加熱至全溶，每個塑料試管加入瓊脂溶液，待冷卻；夾取種子，放入裝有已凝固瓊脂的塑料試管中，每個塑料試管中裝一粒水稻種子，在托板的邊緣貼上標簽，標注樣品及重復(fù)；待種子全部放入塑料試管后，統(tǒng)一蓋上蓋子，最后將托板按樣品及重復(fù)依次擺放在Q2儀(氧傳感儀)上；打開Q2的運行程序，創(chuàng)建新程序，對每個托板進行設(shè)置；設(shè)置運行時間、測定間隔時間、運行溫度等參數(shù)信息，以及樣品名稱、重復(fù)編號；開始自動化測量，每次測量記錄I次氧氣濃度，Q2軟件會根據(jù)測定的氧氣濃度和時間繪制成耗氧曲線，計算氧代謝指標。進一步，所述瓊脂溶液的配置方法為稱取瓊脂5. 0g，加入IOOOml超純水，配制O. 4% O. 6%瓊脂溶液，加熱至全溶，每個塑料試管加入瓊脂溶液1000 μ 1，待冷卻。進一步，所述雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，根據(jù)水稻種子大小選用
I.5ml的塑料試管。進一步，所述的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法在加瓊脂溶液的過程中，根據(jù)水稻種子的呼吸強度在每個塑料試管中加入瓊脂溶液1000 μ I。進一步，每次程序運行16個托板，每次取4個水稻品種，每個品種設(shè)4次重復(fù)，一個托板48粒種子為一次重復(fù)。進一步，用鑷子夾取種子，放入裝有已凝固瓊脂的塑料試管中，每個塑料試管中裝一粒水稻種子，以靠近種胚部分接觸瓊脂面為宜。進一步，所述快速測定方法中水稻種子以O(shè). 5%的濃度為最佳。進一步，放置在密閉試管中的雜交水稻種子在不同的光溫條件下的耗氧曲線是不同的，水稻種子在20-30°C，光照或黑暗條件下均比較合適，尤以25°C黑暗條件下最適宜。進一步，檢測時間的確定方法為為保證每次重復(fù)48粒種子萌發(fā)，雜交秈稻和雜交粳稻種子在密閉試管中需分別培養(yǎng)60h和140h ;此外，為保證耗氧曲線的完整性，每次檢測間隔的時間以30min最佳。進一步，確定1.5ml試管后，還需選擇試管蓋的大小。試管蓋除與試管匹配外，擰緊后其空間空氣體積以300 μ I為宜。最后將熒光染料涂在試管蓋頂端內(nèi)側(cè)，以利于儀器掃描。本發(fā)明提供了一種快速、準確的水稻種子活力測定方法，該方法將為我國水稻種子質(zhì)量檢測水平提升、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展并加強其核心競爭力具有重要意義。此外，還可幫助我們正確掌握種子質(zhì)量狀況，確保安全貯藏；可以做到精確播種、節(jié)約用種；可以通過農(nóng)業(yè)行政主管部門正確、合理地行使質(zhì)量監(jiān)督權(quán)限，扶優(yōu)治劣，保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全用種。


圖I是本發(fā)明實施例提供的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法的流程圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。I、本發(fā)明實施例提供的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，該測定方法包括以下步驟在步驟SlOl中，稱取Q2專用瓊脂5.0g，加入IOOOml超純水，配制O. 4% O. 6%瓊脂溶液，放入微波爐加熱至全溶，每個塑料試管(I. 5ml)加入瓊脂溶液1000 μ 1，待冷卻；在步驟S102中，夾取種子，放入裝有已凝固瓊脂的塑料試管中，每個塑料試管中裝一粒水稻種子，在托板的邊緣貼上標簽，標注樣品及重復(fù)；在步驟S103中，待種子全部放入塑料試管后，統(tǒng)一蓋上頂端內(nèi)側(cè)涂有熒光染料的 蓋子；最后將托板按樣品和重復(fù)依次放在Q2儀(氧傳感儀)上；在步驟S104中，打開Q2的運行程序，創(chuàng)建新程序，對每個托板進行設(shè)置；設(shè)置運行時間、測定間隔時間、運行溫度等信息，以及樣品名稱、重復(fù)編號；在步驟S105中，開始自動化測量，每次測量記錄I次氧氣濃度，Q2軟件會根據(jù)測定的氧氣濃度和時間繪制成耗氧曲線，計算氧代謝指標。在步驟S106中，以下結(jié)合21個雜交秈稻品種和20個雜交粳稻品種具體的實驗方法和實驗結(jié)果分析對本發(fā)明作進一步的說明。2、不同檢測方法的雜交水稻種子活力比較2. I試驗方法2. I. I氧傳感檢測I、試管大小的選擇用于氧傳感檢測的種子需在密閉的試管中進行，試管需擺放在48孔托板中。目前試管規(guī)格有O. 5ml、l. 5ml,2. Oml等3種。根據(jù)水稻種子的實際大小，雖均可擺放在3中試管中，但I. 5ml試管大小適中,最適合水稻種子的檢測。2、試管蓋大小的選擇和填涂熒光染料部位的確定確定I. 5ml試管后，還需選擇試管蓋的大小。試管蓋除與試管匹配外，擰緊后其空間空氣體積以300 μ I為宜。最后將熒光染料涂在試管蓋頂端內(nèi)側(cè)，以利于儀器掃描。3、配備瓊脂溶液瓊脂溶液作為種子的吸水介質(zhì)，可以提供種子萌發(fā)過程中所需的水分，同時凝固后可以支撐種子作為發(fā)芽基質(zhì)。瓊脂溶液濃度一般為O. 4% O. 6%，不同植物種子適宜濃度不同，水稻種子以O(shè). 5%的濃度為最佳。稱取瓊脂5. 0g，加水1000ml，放入微波爐加熱至全溶。4、管內(nèi)空間大小的確定不同植物的種子，萌發(fā)過程中的耗氧量存在明顯差異。因此，除考慮種子的大小夕卜，還需考慮種子的呼吸強度。對于呼吸旺盛的種子，密閉試管內(nèi)的空間要大；呼吸強度不大的種子，密閉試管內(nèi)的空間要?。幻荛]試管內(nèi)合適的空間大小可以保證密閉試管內(nèi)的氧氣在種子萌發(fā)后剛好被消耗殆盡，種子耗氧曲線具備典型的反“S”型消耗型，從而保證分析的結(jié)果更可靠。在試驗過程中，我們可以通過控制加入試管中瓊脂溶液的量來調(diào)整密閉試管中殘留空氣的體積。水稻種子大小適中,耗氧量適中,在I. 5ml試管中加入900-1100 μ I瓊脂溶液比較適宜，尤以ΙΟΟΟμ I最適宜。這樣保證擰緊試管蓋后空管內(nèi)殘留空氣的體積在800 μ I為宜。5、種子的擺放由于每次程序運行16托板，每次取4個水稻品種，每個品種設(shè)4次重復(fù)，一個托板為I次重復(fù)，即48粒種子為I次重復(fù)。用鑷子夾取種子，放入裝有已凝固瓊脂的塑料試管中，每個塑料試管中裝一粒水稻種子，以靠近種胚部分接觸瓊脂面為宜。在托板的邊緣貼上標簽，標注樣品及重復(fù)。待種子全部放入塑料試管后，統(tǒng)一蓋上頂端內(nèi)側(cè)涂有熒光染料的蓋子。最后將托板按品種和重復(fù)依次擺放在Q2儀(氧傳感儀，荷蘭ASTEC Global公司提供)上。6、發(fā)芽條件的確定
放置在密閉試管中的雜交水稻種子在不同的光溫條件下的耗氧曲線是不同的。水稻種子在20-30°C，光照或黑暗條件下均比較合適，尤以25°C黑暗條件下最適宜。7、檢測時間的確定秈型水稻和粳型水稻種子的呼吸強度不一，因此完成萌發(fā)的時間有別。為保證每次重復(fù)48粒種子萌發(fā)，雜交秈稻和雜交粳稻種子在密閉試管中需分別培養(yǎng)60h和140h。此外，為保證耗氧曲線的完整性，每次檢測間隔的時間以30min最佳。8、試驗正負對照的確定為保證試驗的對比性，需設(shè)置正負對照。我們在Q2儀的正負對照孔中分別放置空管作為正對照，放置加Na2S03過飽和溶液的試管作為負對照。9、程序設(shè)置、運行與數(shù)據(jù)分析打開Q2的運行程序，創(chuàng)建新程序，設(shè)置不同雜交稻類型對每個托板進行參數(shù)設(shè)置；設(shè)置試管總體積、瓊脂濃度及體積、管內(nèi)殘留空氣的體積、運行時間、每次測定間隔時間、運行溫度等參數(shù)信息，以及樣品名稱，重復(fù)編號(A、B、C、D)。啟動運行按鈕，開始自動化測量，每次測量記錄I次氧氣濃度，Q2軟件會根據(jù)測定的氧氣濃度和運行時間繪制成耗氧曲線。然后通過軟件分析試管中氧氣濃度隨時間變化的曲線，得到幾個曲線的特征指標，即氧代謝指標。萌發(fā)啟動時間IMT(increased metabolism time)表示氧氣消耗速率從開始的緩慢速度開始增加的時間，這個指標反映了種子吸脹萌動至胚根突破種皮的快慢。氧氣消耗速率OMR(oxygen metabolism rate)是種子胚根突破種皮后到受低氧脅迫氧氣消耗速率變慢之間的呼吸速率，反映了種子萌發(fā)過程的代謝活動強弱。關(guān)鍵氧氣壓力C0P(criticaloxygen pressure)是呼吸速率開始減速時氧氣百分比濃度,反應(yīng)了種子耐低氧脅迫萌發(fā)的能力。理論萌發(fā)時間RGT(relativegermination time)為假設(shè)在非低氧脅迫條件下氧氣消耗到零時推斷的發(fā)芽時間，與種子的實際發(fā)芽時間直接相關(guān)。理論萌發(fā)率RGR(relativegerminationrate)是與理論萌發(fā)時間相對應(yīng)的推斷出來的發(fā)芽率，與種子的實際發(fā)芽率直接相關(guān)。一般來說，OMR、RGR與種子活力呈正相關(guān)，MT、COP、RGT與種子活力呈負相關(guān)。2. I. 2發(fā)芽檢測I、發(fā)芽方法發(fā)芽試驗按國家種子質(zhì)量檢驗標準(GB/T3543. 4-1995)進行。種子以100粒為一重復(fù)，試驗為4次重復(fù)，種子在發(fā)芽床上的分布要均勻，粒與粒之間保持一定距離，既防止發(fā)霉種子的相互感染，又能保證正常種子足夠的生長空間。紙床充分吸足水分后浙去多余水分，防止水分過多，增加種子霉爛和病菌感染的幾率。在發(fā)芽盒的側(cè)面貼上標簽，注明樣品名稱和重復(fù)序號及置床日期。將發(fā)芽盒蓋好，放入30°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)14d。種子開始發(fā)芽后，每天統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)。即從第2d開始計數(shù)，計數(shù)時把發(fā)芽合格的種子從發(fā)芽床中揀出，記錄每天每盒揀出數(shù)，即為當(dāng)天發(fā)芽種子數(shù)。2、結(jié)果計算根據(jù)以上數(shù)據(jù)，分別計算與種子活力相關(guān)的發(fā)芽測定指標。發(fā)芽率是檢測種子質(zhì)量的重要指標之一，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常常依此來計算用種量，發(fā)芽率用每天正常發(fā)芽種子總數(shù)占檢測種子總數(shù)的百分比來表示。發(fā)芽勢為種子發(fā)芽速度和整齊度，是水稻種子活力測定的重要指標，計算從發(fā)芽開始到第5d發(fā)芽高峰時段內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)占檢測種子總數(shù)的百分比。發(fā)芽指數(shù)是每天正常發(fā)芽種子數(shù)除以當(dāng)天天數(shù)之商的累加值，反映了種子的發(fā)芽速度，比發(fā)芽勢更能體現(xiàn)種子的活力狀況?！?br> 2. 2結(jié)果分析2. 2. I不同檢測方法的雜交秈稻種子質(zhì)量的比較由表I的方差分析結(jié)果可以看出，雜交秈稻中，MT值表現(xiàn)活力較強的是秈優(yōu)64、協(xié)優(yōu)413、中優(yōu)208、中優(yōu)205、內(nèi)5優(yōu)8015、II優(yōu)7954、株兩優(yōu)609、株兩優(yōu)06、錢優(yōu)0506等品種，活力較差的是汕優(yōu)48-2等品種；0MR值表現(xiàn)活力較強的是錢優(yōu)0506、株兩優(yōu)06、II優(yōu)7954等品種，活力較差的是汕優(yōu)48-2等品種；C0P值表現(xiàn)活力較強的是株兩優(yōu)609、浙輻兩優(yōu)12等品種，活力較差的是錢優(yōu)0506、II優(yōu)7954、中優(yōu)208、中優(yōu)205、新兩優(yōu)6號、協(xié)優(yōu)413、秈優(yōu)64等品種；RGT值表現(xiàn)活力較強的是錢優(yōu)0506、株兩優(yōu)06、II優(yōu)7954、內(nèi)5優(yōu)8015、浙輻兩優(yōu)12、Y兩優(yōu)689、錢優(yōu)I號、中優(yōu)205、中優(yōu)208、新兩優(yōu)6號、協(xié)優(yōu)413、中浙優(yōu)8號、II優(yōu)1259、豐兩優(yōu)I號、協(xié)優(yōu)982等品種，活力較差的是汕優(yōu)48_2等品種；RGR值表現(xiàn)活力較高的是錢優(yōu)0506、株兩優(yōu)06、株兩優(yōu)609、內(nèi)5優(yōu)8015、II優(yōu)7954、浙輻兩優(yōu)12、Y兩優(yōu)689、錢優(yōu)I號、中優(yōu)205、中優(yōu)208、新兩優(yōu)6號、協(xié)優(yōu)413、C兩優(yōu)87、中浙優(yōu)8號、II優(yōu)1259、秈優(yōu)64、協(xié)優(yōu)982等品種，活力較差的是汕優(yōu)48-2、兩優(yōu)培九、豐兩優(yōu)香I號等品種。綜上各項氧代謝指標，雜交秈稻種子活力較高為錢優(yōu)0506、株兩優(yōu)06、株兩優(yōu)609、II優(yōu)7954、浙輻兩優(yōu)12等品種,而活力較差的是汕優(yōu)48-2、兩優(yōu)培九、豐兩優(yōu)香I號、C兩優(yōu)87等品種，其他品種種子活力中等。表I雜交秈稻種子氧代謝指標的比較
權(quán)利要求
1.一種雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，其特征在于，所述測定方法包括以下步驟 稱取瓊脂，加入超純水，配制瓊脂溶液，加熱至全溶，每個塑料試管加入瓊脂溶液，待冷卻； 夾取種子，放入裝有已凝固瓊脂的塑料試管中，每個塑料試管中裝一粒水稻種子，在托板的邊緣貼上標簽，標注樣品及重復(fù)； 待種子全部放入塑料試管后，統(tǒng)一蓋上蓋子，最后將托板按樣品及重復(fù)依次擺放在Q2儀(氧傳感儀)上； 打開Q2的運行程序，創(chuàng)建新程序，對每個托板進行設(shè)置；設(shè)置運行時間、測定間隔時間、運行溫度等參數(shù)信息，以及樣品名稱、重復(fù)編號； 開始自動化測量，每次測量記錄I次氧氣濃度，Q2軟件會根據(jù)測定的氧氣濃度和時間繪制成耗氧曲線，計算氧代謝指標。
2.如權(quán)利要求I所述的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，其特征在于，所述瓊脂溶液的配置方法為 稱取瓊脂5. Og，加入IOOOml超純水，配制O. 4% O. 6%瓊脂溶液，加熱至全溶，每個塑料試管加入瓊脂溶液1000 μ 1，待冷卻。
3.如權(quán)利要求I所述的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，其特征在于，所述雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，根據(jù)水稻種子大小選用1.5ml的塑料試管。
4.如權(quán)利要求I所述的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，其特征在于，所述的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法在加瓊脂溶液的過程中，根據(jù)水稻種子的呼吸強度在每個塑料試管中加入瓊脂溶液1000 μ I。
5.如權(quán)利要求I所述的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，其特征在于，每次程序運行16個托板，每次取4個水稻品種，每個品種設(shè)4次重復(fù)，一個托板48粒種子為一次重復(fù)。
6.如權(quán)利要求I所述的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，其特征在于，用鑷子夾取種子，放入裝有已凝固瓊脂的塑料試管中，每個塑料試管中裝一粒水稻種子，以靠近種胚部分接觸瓊脂面為宜。
7.如權(quán)利要求I所述的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，其特征在于，所述快速測定方法中水稻種子以O(shè). 5%的濃度為最佳。
8.如權(quán)利要求I所述的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，其特征在于，放置在密閉試管中的雜交水稻種子在不同的光溫條件下的耗氧曲線是不同的，水稻種子在20-30 0C，光照或黑暗條件下均比較合適，尤以25 °C黑暗條件下最適宜。
9.如權(quán)利要求I所述的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，其特征在于，檢測時間的確定方法為 為保證每次重復(fù)48粒種子萌發(fā)，雜交秈稻和雜交粳稻種子在密閉試管中需分別培養(yǎng)60h和140h ;此外，為保證耗氧曲線的完整性，每次檢測間隔的時間以30min最佳。
10.如權(quán)利要求I所述的雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，其特征在于，確定I.5ml試管后，還需選擇試管蓋的大小。試管蓋除與試管匹配外，擰緊后其空間空氣體積以300μ I為宜。最后將熒光染料涂在試管蓋頂端內(nèi)側(cè)，以利于儀器掃描。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雜交水稻種子活力氧傳感快速測定方法，稱取瓊脂，加水，配制瓊脂溶液，加熱至全溶，每個試管加入瓊脂溶液，待冷卻；夾取種子，放入裝有已凝固瓊脂的塑料試管中，擰緊涂有熒光染料的試管蓋；將托板按樣品及重復(fù)依次放在Q2儀上；創(chuàng)建新程序，對每個托板進行參數(shù)設(shè)置；設(shè)置試管總體積、瓊脂濃度及體積、管內(nèi)殘留空氣的體積、運行時間、每次測定間隔時間、運行溫度等信息，開始自動測量，繪制耗氧曲線，計算氧代謝指標。該方法對我國水稻種子質(zhì)量檢測水平提升、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義；還可幫助我們快速掌握種子質(zhì)量狀況，確保安全貯藏和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全用種；在種子處理方法選擇中，對處理后種子的活力狀況進行快速評判。
文檔編號A01C1/02GK102870526SQ20121039401
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月8日
發(fā)明者趙光武, 羊敏杰 申請人:浙江農(nóng)林大學(xué)