專利名稱:一種用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種利用酶促顯色反應(yīng)快速檢測(cè)樣品中過氧化氫含量的酶試紙,屬于生物技術(shù)領(lǐng)域酶法分析領(lǐng)域。
背景技術(shù):
過氧化氫,俗稱雙氧水,在攪動(dòng)和光照等條件下可以分解為水和氧氣,具有極強(qiáng)的氧化性和腐蝕性,因而被廣泛地用作食品的消毒劑和漂白劑。按照我國(guó)《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定,允許食品級(jí)雙氧水在食品生產(chǎn)中作為加工助劑使用,但在制成成品前應(yīng)設(shè)法清除,并嚴(yán)格控制殘留。食品中過氧化氫地殘留過高,會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重傷害,如損傷消化道、導(dǎo)致癌變、加速人體衰老、誘發(fā)心血管疾病等,同時(shí)還會(huì)因殺死消化道中的有益細(xì)菌,而引起腸道功能紊亂等。目前在食品過氧化氫殘留上的另一個(gè)嚴(yán)峻問題是市場(chǎng)上許多不法分子濫用過氧化氫來漂白牛百葉、鳳爪和竹筍等水發(fā)食品,甚至還用來漂白和消除變質(zhì)海產(chǎn)品的異味等。過氧化氫在食品加工尤其是保存上的濫用已嚴(yán)重危害了人們的身體健康,因此迫切需要發(fā)展一種快速、簡(jiǎn)便而靈敏的過氧化氫檢測(cè)方法。
目前檢測(cè)過氧化氫含量的方法很多,如利用過氧化氫在酸性溶液中能與鈦離子生成橙色絡(luò)合物的特性,通過比色法來測(cè)定過氧化氫含量;又有根據(jù)過氧化氫在稀硫酸溶液中能被高錳酸鉀氧化生成氧氣的特性來測(cè)定過氧化氫含量的方法等。但這些方法操作比較繁瑣,并且需要分光光度計(jì)等專門的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備,因而不利于在食品工業(yè)及其它監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的廣泛使用。
本發(fā)明的目的是在于建立一種快速、簡(jiǎn)便而靈敏的過氧化氫酶法檢測(cè)技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是利用酶促顯色反應(yīng)原理,制備一種便于攜帶、經(jīng)濟(jì)適用、同時(shí)又能夠快速檢測(cè)樣品中過氧化氫含量的酶試紙條。
本發(fā)明的酶試紙是通過帶陰離子載體的吸附作用,將帶正電荷的辣根過氧化物酶和顯色劑同時(shí)吸附并固定在載體上的方法制備而成。該試紙可以檢測(cè)到濃度低至0.5μmol/L的過氧化氫的存在。具體地說,實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是將定性濾紙等固體載體浸泡在0.5%-2.0%的羧甲基纖維素或硝酸纖維素陰離子水溶液中,充分吸脹后(當(dāng)用羧甲基纖維膜或硝酸纖維膜作為固體載體時(shí),因?yàn)檫@些載體本身就已有帶負(fù)電的陰離子基團(tuán),如羧甲基和硝酸根基團(tuán),所以不必再用羧甲基纖維素水溶液等浸泡處理),取出晾干,然后將紙張等固體載體浸泡在含辣根過氧化物酶和顯色劑的混合溶液中,其中辣根過氧化物酶的使用濃度范圍為0.01~0.10g/L,顯色劑為0.020~0.10M的苯酚和0.0050~0.050M的4-氨基安替吡啉或N,N-二甲基苯胺或2,4-二氯酚或鄰二苯酚。振搖60min,使得辣根過氧化物酶和顯色液被共同吸附到紙張載體上,將紙張取出低溫風(fēng)干,剪成一定大小的試紙條,并置于密閉和避光的塑料袋中低溫保存,即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。該試紙?jiān)?℃-10℃下保存30天后,仍可檢測(cè)到樣品中0.5μmol/L過氧化氫的存在。
按照本發(fā)明優(yōu)選的方案,含有辣根過氧化物酶和顯色劑的混合溶液中各組分的濃度如下苯酚0.025M、4-氨基安替吡啉0.0075M、辣根過氧化氫酶0.025g/L(W/V),氨芐青霉素100mg/L(W/V)。
按照本發(fā)明,固定載體可以是各種纖維素或其衍生物紙張,如濾紙、羧甲基纖維膜和硝酸纖維膜等。顯色劑可選用苯酚和4-氨基安替吡啉的組合,或其單獨(dú)與N,N-二甲基苯胺、2,4-二氯酚、鄰二苯酚等組合,它們均是能使過氧化氫在過氧化物酶作用下顯色的試劑。其中若選用4-氨基安替吡啉則顯紅色(見圖1),選用2,4-二氯酚時(shí)則顯紫褐色,選用2,4-二氯酚時(shí)則顯藍(lán)色、而選用鄰二苯酚則為棕紅色。
有益效果本發(fā)明試紙反應(yīng)響應(yīng)時(shí)間為1分鐘。可以方便快捷地測(cè)定樣品中過氧化氫的含量。同時(shí)本發(fā)明試紙便于攜帶,適于流動(dòng)作業(yè)。
圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中的酶試紙用于檢測(cè)不同濃度過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)水溶液的顯色情況。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
制備實(shí)施例實(shí)施例1用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制備取厚定性濾紙將其剪成1cm×3cm大小,浸泡在1%羧甲基纖維素水溶液中,浸泡約60分鐘,充分吸脹后,晾干,然后將濾紙條浸泡在20ml含有顯色劑和辣根過氧化物酶的混合液中,其中混合液的組成為苯酚0.025M、4-氨基安替吡啉0.0075M、辣根過氧化氫酶0.025g/L(W/V),氨芐青霉素100mg/L(W/V)。4℃下震蕩60分鐘后,取出濾紙片,低溫晾干,最后置于密閉的塑料袋中低溫避光保存。即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。
實(shí)施例2用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制備將羧甲基纖維膜剪成1cm×3cm大小(因?yàn)檩d體本身就是羧甲基纖維素,已具備帶負(fù)電的陰離子基團(tuán),所以不必再浸泡在羧甲基纖維素水溶液中),隨后浸泡在20ml顯色劑和辣根過氧化物酶的混合液中,其中混合液的組成為苯酚0.02M、4-氨基安替吡啉0.005M、辣根過氧化氫酶0.01g/L(W/V),四環(huán)素10mg/L(W/V)。4℃下震蕩60分鐘后,取出濾紙片,低溫晾干,最后置于密閉的塑料袋中低溫避光保存。即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。
實(shí)施例3用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制備將硝酸纖維膜剪成1cm×3cm大小(因?yàn)檩d體本身就是硝酸纖維素,已具備帶負(fù)電的陰離子基團(tuán),所以不必再浸泡在羧甲基纖維素水溶液中),隨后浸泡在20ml顯色劑和辣根過氧化物酶的混合液中,其中混合液的組成為苯酚0.10M、4-氨基安替吡啉0.05M、辣根過氧化氫酶0.025g/L(W/V),卡那霉素50mg/L(W/V)。4℃下震蕩60分鐘后,取出濾紙片,低溫晾干,最后置于密閉的塑料袋中低溫避光保存。即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。
實(shí)施例4用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制備將厚定性濾紙剪成1cm×3cm大小,浸泡在1%硝酸纖維素的水溶液中,浸泡約60分鐘,充分吸脹后,晾干。隨后浸泡在20ml顯色劑和辣根過氧化物酶的混合液中,其中混合液的組成為苯酚0.010M、2,4-二氯酚0.0075M、辣根過氧化氫酶0.025g/L(W/V),慶大霉素50mg/L(W/V)。4℃下震蕩60分鐘后,取出濾紙片,低溫晾干,最后置于密閉的塑料袋中低溫避光保存。即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。
實(shí)施例5用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制備取厚定性濾紙將其剪成1cm×3cm大小,浸泡在1%羧甲基纖維素水溶液中,浸泡約60分鐘,充分吸脹后,晾干,然后將濾紙條浸泡在20ml含有顯色劑和辣根過氧化物酶的混合液中,其中混合液的組成為苯酚0.025M、2,4-二氯酚0.005M、辣根過氧化氫酶0.025g/L(W/V),氨芐青霉素100mg/L(W/V)。4℃下震蕩60分鐘后,取出濾紙片,低溫晾干,最后置于密閉的塑料袋中低溫避光保存。即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。
實(shí)施例6用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制備將硝酸纖維膜剪成1cm×3cm大小(因?yàn)檩d體本身就是硝酸纖維素,已具備帶負(fù)電的陰離子基團(tuán),所以不必再浸泡在羧甲基纖維素水溶液中),隨后浸泡在20ml顯色劑和辣根過氧化物酶的混合液中,其中混合液的組成為苯酚0.10M、2,4-二氯酚0.05M、辣根過氧化氫酶0.025g/L(W/V),卡那霉素50mg/L(W/V)。4℃下震蕩60分鐘后,取出濾紙片,低溫晾干,最后置于密閉的塑料袋中低溫避光保存。即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。
實(shí)施例7用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制備取厚定性濾紙將其剪成1cm×3cm大小,浸泡在0.5%硝酸纖維素水溶液中,浸泡約60分鐘,充分吸脹后,晾干,然后將濾紙條浸泡在20ml含有顯色劑和辣根過氧化物酶的混合液中,其中混合液的組成為苯酚0.025M、N,N-二甲基苯胺0.005M、辣根過氧化氫酶0.025g/L(W/V),卡那霉素50mg/L(W/V)。4℃下震蕩60分鐘后,取出濾紙片,低溫晾干,最后置于密閉的塑料袋中低溫避光保存。即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。
實(shí)施例8用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制備取厚定性濾紙將其剪成1cm×3cm大小,浸泡在2%硝酸纖維素水溶液中,浸泡約60分鐘,充分吸脹后,晾干,然后將濾紙條浸泡在20ml含有顯色劑和辣根過氧化物酶的混合液中,其中混合液的組成為苯酚0.025M、N,N-二甲基苯胺0.05M、辣根過氧化氫酶0.025g/L(W/V),氨芐青霉素100mg/L(W/V)。4℃下震蕩60分鐘后,取出濾紙片,低溫晾干,最后置于密閉的塑料袋中低溫避光保存。即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。
實(shí)施例9用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制備取厚定性濾紙將其剪成1cm×3cm大小,浸泡在2.0%羧甲基纖維素水溶液中,浸泡約60分鐘,充分吸脹后,晾干,然后將濾紙條浸泡在20ml含有顯色劑和辣根過氧化物酶的混合液中,其中混合液的組成為苯酚0.05M、N,N-二甲基苯胺0.0075M、辣根過氧化氫酶0.025g/L(W/V),氨芐青霉素100mg/L(W/V)。4℃下震蕩60分鐘后,取出濾紙片,低溫晾干,最后置于密閉的塑料袋中低溫避光保存。即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。
實(shí)施例10用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制備取厚定性濾紙將其剪成1cm×3cm大小,浸泡在0.5%羧甲基纖維素水溶液中,浸泡約60分鐘,充分吸脹后,晾干,然后將濾紙條浸泡在20ml含有顯色劑和辣根過氧化物酶的混合液中,其中混合液的組成為苯酚0.075M、鄰二苯酚0.0075M、辣根過氧化氫酶0.075g/L(W/V),氨芐青霉素100mg/L(W/V)。4℃下震蕩60分鐘后,取出濾紙片,低溫晾干,最后置于密閉的塑料袋中低溫避光保存。即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。
實(shí)施例11用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制備將羧甲基纖維膜剪成1cm×3cm大小(因?yàn)檩d體本身就是羧甲基纖維素,已具備帶負(fù)電的陰離子基團(tuán),所以不必再浸泡在羧甲基纖維素水溶液中),隨后浸泡在20ml顯色劑和辣根過氧化物酶的混合液中,其中混合液的組成為苯酚0.02M、鄰二苯酚0.005M、辣根過氧化氫酶0.01g/L(W/V),四環(huán)素10mg/L(W/V)。4℃下震蕩60分鐘后,取出濾紙片,低溫晾干,最后置于密閉的塑料袋中低溫避光保存。即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。
實(shí)施例12用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙的制備取厚定性濾紙將其剪成1cm×3cm大小,浸泡在1%羧甲基纖維素水溶液中,浸泡約60分鐘,充分吸脹后,晾干,然后將濾紙條浸泡在20ml含有顯色劑和辣根過氧化物酶的混合液中,其中混合液的組成為苯酚0.025M、鄰二苯酚0.05M、辣根過氧化氫酶0.025g/L(W/V),氨芐青霉素100mg/L(W/V)。4℃下震蕩60分鐘后,取出濾紙片,低溫晾干,最后置于密閉的塑料袋中低溫避光保存。即制得可用于過氧化氫濃度測(cè)定的酶試紙。
效果實(shí)施例實(shí)施例13實(shí)施例1中所制得的酶試紙用于檢測(cè)過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)水溶液和待測(cè)樣品配制8μmol/L,4μmol/L,2μmol/L,1μmol/L,0.5μmol/L等一系列濃度的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)水溶液,分別用實(shí)施例1中所制成的試紙快速蘸取樣品,等待1分鐘后試紙呈現(xiàn)不同深淺的紅色,其中過氧化氫濃度越高,試紙顯現(xiàn)的紅色越深。具體如圖1所示。
3個(gè)待測(cè)的樣品分別為廣州市天河區(qū)某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)攤擋上2個(gè)浸泡牛百葉的水樣和1個(gè)浸泡竹筍的水樣,分別用上述制成的試紙快速蘸樣品,等待1分鐘后觀察試紙顏色,并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)過氧化氫溶液的顯色程度即可大致確定樣品中過氧化氫濃度范圍。結(jié)果是其中2個(gè)浸泡牛百葉的水樣中檢測(cè)到有不同濃度過氧化氫的存在。
該試紙密封包裝,置于冰箱中保存,30天后仍然能檢測(cè)到0.5μmol/L的過氧化氫存在。
實(shí)施例14實(shí)施例4所制得的酶試紙用于檢測(cè)過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)水溶液配制8μmol/L,4μmol/L,2μmol/L,1μmol/L,0.5μmol/L等一系列濃度的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)水溶液,用實(shí)施例4中所制成的試紙快速蘸樣品,等待1分鐘后試紙均呈現(xiàn)程度不同的藍(lán)色,而過氧化氫濃度越高顯色越深。該試紙密封包裝,置于冰箱中保存,30天后仍然能檢測(cè)到0.5μmol/L的過氧化氫存在。
實(shí)施例15實(shí)施例7所制得的酶試紙用于檢測(cè)過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)水溶液配制8μmol/L,4μmol/L,2μmol/L,1μmol/L,0.5μmol/L等一系列濃度的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)水溶液,用實(shí)施例7中所制成的試紙快速蘸樣品,等待1分鐘后試紙均呈現(xiàn)程度不同的紫褐色,而過氧化氫濃度越高顯色越深。
該試紙密封包裝,置于冰箱中保存,30天后仍然能檢測(cè)到0.5μmol/L的過氧化氫存在。
實(shí)施例16實(shí)施例10所制得的酶試紙用于檢測(cè)過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)水溶液配制8μmol/L,4μmol/L,2μmol/L,1μmol/L,0.5μmol/L等一系列濃度的過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)水溶液,用實(shí)施例10中所制成的試紙快速蘸樣品,等待1分鐘后試紙均呈現(xiàn)程度不同的顏色棕紅色,而過氧化氫濃度越高顯色越深。
該試紙密封包裝,置于冰箱中保存,30天后仍然能檢測(cè)到0.5μmol/L的過氧化氫存在。
實(shí)施例17用實(shí)施例1之酶試紙法和傳統(tǒng)測(cè)定方法分別測(cè)定樣品過氧化氫濃度配制20μmol/L,5μmol/L,1μmol/L等3個(gè)濃度的過氧化氫水溶液100ml,分別用實(shí)施例1中所制成的酶試紙、高錳酸鉀滴定法和鈦離子顯色法測(cè)定它們的濃度。
用精密移液器各量取10μl上述過氧化氫水溶液,分別滴在三塊不同的本發(fā)明之酶試紙上,等待1分鐘后試紙呈現(xiàn)不同深淺的紅色,其中過氧化氫濃度越高,試紙顯現(xiàn)的紅色越深。
高錳酸鉀滴定法和鈦離子顯色法參照《食品成分分析手冊(cè)》(寧正祥主編,1998年,北京,輕工業(yè)出版社)。在高錳酸鉀滴定法中,以滴定至溶液呈現(xiàn)微紅色并在1分鐘內(nèi)不褪色為終點(diǎn)。鈦離子顯色法則是根據(jù)鈦離子與過氧化氫能在酸性介質(zhì)中生成橙色絡(luò)合物,而后以分光光度計(jì)于波長(zhǎng)420nm處測(cè)其溶液的吸光度。
結(jié)果表明,使用本發(fā)明之酶試紙進(jìn)行過氧化氫測(cè)定,只需要10μl的樣品量,2分鐘即完成實(shí)驗(yàn),并且實(shí)驗(yàn)不需要任何特別設(shè)備。而高錳酸鉀滴定法至少需要20毫升的樣品,鈦離子顯色法則至少需要1.0ml的樣品。同時(shí)高錳酸鉀滴定法和鈦離子顯色法需要特定的化學(xué)滴定儀器和精密的分光光度儀,只能在實(shí)驗(yàn)室完成。無法進(jìn)行移動(dòng)作業(yè)。此外,使用本發(fā)明之酶試紙可以達(dá)到更高的檢測(cè)靈敏度。
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定過氧化氫濃度的酶試紙,其特征在于通過利用陰離子吸附劑的作用,將帶正電荷的辣根過氧化物酶和顯色劑同時(shí)固定在載體上制備而成。
2.如權(quán)利要求1所說的酶試紙,其中顯色劑可以是苯酚和4-氨基安替吡啉的組合、或是苯酚單獨(dú)與N,N-二甲基苯胺、2,4-二氯酚、鄰二苯酚等其中任何一個(gè)的組合。
3.如權(quán)利要求1所說的酶試紙,其中載體可以是各種纖維素或其衍生物紙張。
4.如權(quán)利要求3所說的酶試紙,其中載體為羧甲基纖維膜或硝酸纖維膜。
5.如權(quán)利1要求所說的酶試紙,其中吸附劑可以是羧甲基纖維素或硝酸纖維素陰離子吸附劑。
6.如權(quán)利要求1至5之任一所說的酶試紙,其中辣根過氧化物酶的使用濃度范圍為0.01~0.10g/L。
7.如權(quán)利要求1至5之任一所說的酶試紙,其中吸附劑羧甲基纖維素的使用濃度為0.5%-2.0%。
8.如權(quán)利要求1至5之任一所說的酶試紙,其中吸附劑硝酸纖維素的使用濃度為0.5%-2.0%。
9.如權(quán)利要求2至5之任一所說的酶試紙,其中顯色劑為0.020~0.10M的苯酚和0.0050~0.050M的4-氨基安替吡啉或N,N-二甲基苯胺或2,4-二氯酚或鄰二苯酚。
10.如權(quán)利要求1至5之任一所說的酶試紙,其中顯色劑混合液中含有作為防腐劑的氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素或慶大霉素等其它抗生素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶促顯色反應(yīng)制備能快速檢測(cè)樣品中過氧化氫含量的酶試紙。該試紙是利用帶陰離子載體的吸附作用,將帶正電荷的辣根過氧化物酶和顯色劑同時(shí)固定在載體上的方法制備而成。該試紙可以檢測(cè)到樣品中濃度低至0.5μmol/L的過氧化氫的存在。檢測(cè)時(shí)該試紙的響應(yīng)時(shí)間為1分鐘??梢苑奖憧旖莸販y(cè)定樣品中過氧化氫的含量。同時(shí)本發(fā)明試紙便于攜帶,適于流動(dòng)作業(yè)。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1821754SQ200610011568
公開日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2006年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月27日
發(fā)明者王煒軍, 呂志, 劉娥娥, 方穎, 徐鳳彩 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)