專利名稱：煙草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬時表達誘導(dǎo)煙草早花的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種煙草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬時表達誘導(dǎo)煙草早花，具體涉及煙草FT (Flowering locus T)基因NtFTl及其在誘導(dǎo)煙草早花中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)中的基因領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物開花是一個非常復(fù)雜的過程，受到外部環(huán)境因素和內(nèi)部基因表達的影響調(diào)控。對擬南芥開花分子機理的研究表明，擬南芥的開花受四條途徑控制，即光周期、自主途徑、春化途徑和赤霉素途徑，光周期途徑信號經(jīng)CO (CONSTANCE)傳遞給FT(Flowering LocusT)，春化途徑和自主途徑信號經(jīng)FLC (Flowering Locus C)傳遞給FT，F(xiàn)T基因的表達誘導(dǎo)誘導(dǎo)花分生組織特異基因APl的表達，從而誘導(dǎo)開花。FT基因是控制植物開花信號的匯集點，所以FT基因在誘導(dǎo)植物早花的基因工程研究中應(yīng)用也最為廣泛、最為有效。FT基因編碼的蛋白質(zhì)屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)家族。不同作物的FT基因高度保守，這為分離克隆FT基因提供了方便。轉(zhuǎn)基因研究表明，過量表達FT基因能夠誘導(dǎo)擬南芥早花。另外從水稻、番茄、楊樹、柑橘等中克隆的FT基因的同源基因Hd3a、SFT、PtFTl和CiFT等也都能夠誘導(dǎo)植物早花。利用植物病毒載體表達外源基因是新近發(fā)展起來的一種基因瞬時表達方法。與轉(zhuǎn)基因方法相比，該方法操作簡單，可在短期內(nèi)使外源基因迅速表達，而且能同時對多個品種進行感染。馬鈴薯X病毒(Potato Virus X，PVX)作為外源基因的病毒表達載體被廣泛應(yīng)用。其載體構(gòu)建策略是將外源基因插入重復(fù)的CP (Coat Protein)啟動子之間，利用CP基因的啟動子來指導(dǎo)外源基因 的表達。煙草是我國主要經(jīng)濟作物之一。普通栽培煙草是短日照作物。我國煙草育種工作雖然取得了明顯的成績，但目前生產(chǎn)上的主栽品種比較單一。急需加大煙草品種選育工作的進度。煙草生育期比較長，是限制煙草育種進程的一個主要因素。擬南芥FT基因能夠有效縮短煙草開花時間，而且北卡州立大學(xué)煙草育種組已經(jīng)將該技術(shù)成功應(yīng)用于煙草育種。但是，由于FT基因受國際專利保護，限制了我國煙草育種家對該基因的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種煙草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬時表達誘導(dǎo)煙草早花，將源自煙草的控制植物開花時間的NtFTl基因全長編碼序列及其編碼的蛋白序列。NtFTl基因是通過同源序列搜索，從中國煙草基因組測序計劃數(shù)據(jù)中經(jīng)Blastn比對及剪切位點分析得到的。以此序列涉及出一對NtFTl基因特異引物用半定量PCR(RT-PCR)方法，克隆了該基因。本發(fā)明另一個目的在于還構(gòu)建了 NtFTl基因的PVX病毒表達載體,構(gòu)建的病毒表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌滲濾侵染烤煙品種紅花大金元、云煙87和K326，能誘導(dǎo)這些品種早花，證明該基因具有誘導(dǎo)烤煙早花的功能。將NtFTl基因的PVX病毒瞬時表達系統(tǒng)用于煙草育種，可縮短煙草生育期、加快育成煙草新品種的年限。本發(fā)明是這樣完成的本發(fā)明提供一個首次從煙草中獲得植物開花時間調(diào)節(jié)基因的全長cDNA，命名為NtFTl，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1ο本發(fā)明提供一對從煙草中克隆煙草NtFTl的PCR引物。引物序列為正向引物NtFT1-F: ATGCCAAGAGAACGTGAACC，反向引物 NtFT1-R: TCAATCGGCAGACCTTCTAC。本發(fā)明提供一種從煙草中克隆煙草NtFTl基因的方法。具體而言，首先利用擬南芥FT基因序列作為搜索序列，在Genbank煙草GSS數(shù)據(jù)庫中用tblastx程序進行比對，獲得一致性最高的煙草基因組序列(FH969747.1)，利用該序列搜索中國煙草基因組計劃測序數(shù)據(jù)庫，將該序列向兩側(cè)延伸得到IOOOObp左右的基因組序列信息。通過剪切位點分析，獲得候選煙草FT基因的cDNA序列，如序列SEQ ID NO:1所示。根據(jù)候選序列設(shè)計PCR引物NtFTl-F和NtFTl-R。取黑煙草Narrow leaf madole即將開花煙株的葉片，利用Trizon(Invitrogen)試劑提取 RNA,用 SuperScript RT Kit (Invitrogen)合成 cDNA 第一鏈,然后用NtFTl-F和NtFTl-R進行RT-PCR (圖1)，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與候選序列100%—致。擴增所述基因的全長或基因中任一片段的引物對屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明還提供了 NtFTl基因編碼的多肽序列，其特征在于具有如SEQ ID N0:2所示的177個氨基酸序列。本發(fā)明的另一目的是這樣完成的構(gòu)建煙草NtFTl基因的病毒瞬時表達載體具體過程如下，將已構(gòu)建的擬南芥FT基因的PVX表達載體pCAM pGR106-FT的FT基因用Cla I和Sal I切下，回收大片段`質(zhì)粒片段。由于NtFTl基因里有Sal I酶切位點，所以在擴增NtFTl cDNA片段的正反引物上分別引物Cla I和Xho I (F: ATCGATATGCCAAGAGAACGTGAACC，下劃線所示為 Cla I 酶切位點；R: CTCGAGTCAATCGGCAGACCTTCTAC,下劃線所示為Xho I酶切位點)，Xho I是Sal I的同尾酶。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗證后與上述回收的載體片段連接，獲得NtFTl PVX瞬時表達載體pCAM pGR106_NtFTl。構(gòu)建好的載體進行酶切驗證(圖2)。本發(fā)明還提供了 NtFTl基因在調(diào)節(jié)煙草開花中的應(yīng)用。將上述PVX病毒表達載體pCAM pGR106-NtFT轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，經(jīng)農(nóng)桿菌滲濾后，使NtFTl在受體煙株中瞬時表達，促使煙草在滲濾后40 50天開花。構(gòu)建的重組載體(pCAM pGR106_NtFTl)能夠誘導(dǎo)煙草早花，應(yīng)用于煙草育種，可以縮短煙草開花時間，達到縮短育種年限的目的，這方面的應(yīng)用同時受本發(fā)明的保護。除上述構(gòu)建的PVX病毒載體外，利用所述基因構(gòu)建的其他瞬時表達載體、轉(zhuǎn)基因植物表達載體或利用所述基因任何部分片段構(gòu)建的RNA干涉載體，都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明還保護利用所述基因及任何部分片段進行的轉(zhuǎn)基因研究。


圖1為NtFTl基因全長cDNA片段的RT-PCR擴增電泳圖譜。圖2為NtFTl基因PVX瞬時表達載體的酶切驗證電泳圖譜。其中pCAM pGR106-NtFT酶切驗證，用Cla I和Sal I酶切得到389bp片段。
圖3來源于不同植物的FT基因的多序列比對。圖4 A為煙草FT基因NtFTl基因的PVX系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)烤煙紅花大金元。圖4 B為煙草FT基因NtFTl基因的PVX系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)烤煙云煙87。圖4 C為煙草FT基因NtFTl基因的PVX系統(tǒng)能夠誘導(dǎo)烤煙K326早花。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。任何在本發(fā)明基本精神上地改進或替代，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求書所要求保護地范圍。下述實施例中地實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用到地試驗試劑，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑。NtFTl基因cDNA序列信息的獲得首先利用擬南芥FT基因氨基酸序列(AEE34381.1)作為搜索序列，在Genbank煙草GSS數(shù)據(jù)庫中用tblastn程序進行比對，獲得一致性最高的煙草基因組序列(FH969747.1),一致性為68%。利用該序列搜索中國煙草基因組計劃測序數(shù)據(jù)庫，將該序列向兩側(cè)延伸，得到IOOOObp左右的基因組序列信息。通過剪切位點分析，獲得候選煙草FT基因的⑶S區(qū)序列。根據(jù)候選序列設(shè)計擴 增基因全長cDNA的PCR引物，正向引物=NtFTl-F:ATGCCAAGAGAACGTGAACC，反向引物 NtFT1-R: TCAATCGGCAGACCTTCTAC。NtFTl基因全長CDS的克隆取黑煙草Narrow leaf madole即將開花煙株的葉片，利用Trizon( InvitrogenHi劑提取RNA,具體步驟如下葉片用液氮研磨IOOmg葉片成粉末后,轉(zhuǎn)入已加有Iml Trizol的1.5ml離心管中，劇烈震蕩使粉末分散，使細胞裂解完全。15 3°C孵育5 min，加入
0.2ml氯仿，用力振搖15 sec。15 30°C下孵育2 3min, 12，OOOg 4°C離心15min,小心吸取上層無色液體移入一新的1. 5ml離心管中。加入O. 5ml異丙醇，混勻，15 30°C下孵育IOmin, 12, OOOg 4°C離心15min。去上清，沉淀加入Iml DEPC水配制的75%乙醇，輕微振蕩15 sec, 7, 500g 4°C離心5min。小心去上清,管內(nèi)沉淀在超凈臺中鼓風(fēng)靜置干燥3 5min。加入30 50μ1 DEPC水溶解，_80°C冰箱保存。提取的RNA經(jīng)分光光度計(NenoDrop)測定濃度并用甲醛變性電泳檢測完整性。用SuperScript RT Kit (Invitrogen)合成 cDNA 第一鏈，然后用 NtFTl-F 和NtFTl-R 進行 RT-PCR (圖 1)，PCR 反應(yīng)體系cDNA 模板 μ ，5Χ Phusion HF Buffer 4μ1,dNTP (10mM)0. 4μ1,正反向引物各 μ (10M-M), Phusion DNA Polymerase 0·2μ1,滅菌蒸懼水補足20μ1。PCR擴增條件為98°C預(yù)變性30sec ;98°C變性lOsec，58°C退火30sec，72°C延伸15sec，35個循環(huán)；72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的條帶后連接、測序。測序結(jié)果與候選序列100%—致，序列見SEQ ID NO:1。NtFTl序列分析FT基因?qū)儆诹字Ｒ掖及方Y(jié)合蛋白(PEBP)家族，利用預(yù)測的NtFTl蛋白序列在NCBI利用Protein Blast搜索同源序列，NtFTl蛋白序列與番茄(AA031792，一致性95%, E value :le-120)、黃瓜(BAH28253，一致性 88%，E value :7e_113)、梅(BAH82787，一致性 89%，E value :6e-112)、番木瓜(ACX85427，一致性 90%，E value :4e_112)、荔枝(AEU08962，一致性87%，E value :le-111)等的FT基因同源性較高。將以上序列及擬南芥FT基因(AF152096)進行多序列比對，NtFTl含有PEBP家族典型的保守結(jié)構(gòu)域DPDxP、氨基酸殘基Hi s、GxHR, χΥΝ、氨基酸殘基Q等(圖3 )。NtFTl PVX病毒表達載體的構(gòu)建構(gòu)建了 NtFTl基因的PVX瞬時表達載體。具體過程如下，將載體pCAM PGR106-FT用Cla I和Sal I切下，回收大片段質(zhì)粒片段。由于NtFTl基因里有Sal I酶切位點，所以在擴增NtFTl cDNA片段的正反引物上分別引入Cla I和Xho I (F: ATCGATATGCCAAGAGAACGTGAACC，下劃線所示為 Cla I 酶切位點；R: CTCGAGTCAATCGGCAGACCTTCTAC,下劃線所示為Xho I酶切位點)酶切位點，Xho I是Sal I的同尾酶。PCR產(chǎn)物經(jīng)測回收后連入PCR2.1載體，并測序。測序結(jié)果正確的克隆提取DNA，進行酶切，并與上述回收的載體片段連接，獲得NtFTl PVX瞬時表達載體pCAM pGR106_NtFTl。構(gòu)建好的載體進行酶切驗證(圖2)。表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞置于冰上解凍，加入2Pg pCAM pGR106_NtFT質(zhì)粒DNA，輕敲離心管混勻，冰上放置30min，置于液氮中l(wèi)min，迅速轉(zhuǎn)入37°C水浴5min，在冰上放置2min左右，加入Iml不含抗生素的LB培養(yǎng)基，于28°C振蕩培養(yǎng)2h ;取200μ1涂布于含卡那霉素(100mg/L)和利福平(25mg/L)的LB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2天。利用菌落PCR方法檢測陽性克隆。農(nóng)桿菌滲濾使NtFTl瞬時表達誘導(dǎo)煙草早花滲濾液準備將穿刺培養(yǎng)的含有pCAM pGR106-NtFT的農(nóng)桿菌菌種接種于3ml含有卡那霉素的YEP培養(yǎng)基，28°C過夜振蕩培養(yǎng)；第二天，將Iml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入50ml含有MES 和抗生素的 YEP 培養(yǎng)基(45ml YEP，5ml IOOmM 的 MES，50μ1 25 mg/L 的利福平，50μ1100 mg/L的卡那霉素，6. 67μ1 150mM)，28°C過夜振蕩培養(yǎng)；第三天，分光光度計檢測培養(yǎng)物00_，600(^，41離心15 111丨11，去上清，利用滲濾131^€61 (IOmM MgCL2, IOmM MES, 150μΜacetosyrigone)重懸菌體,并調(diào)整菌液濃度(OD6tltl大約為I)。煙草農(nóng)桿菌滲濾煙草品種為紅花大金元、云煙87和K326,利用4 5片葉的煙苗(播種后40天左右)進行滲濾。選取下部兩片葉進行滲濾，并提前用記號筆標記。具體滲濾過程為，用3ml一次性注射器吸取滲濾液，輕輕壓注射器，用手指在葉片正面支撐，使?jié)B濾液輕輕滲入葉片背面，可能需要多次操作，直到整個葉面濕潤為止。以空載體pCAM pGR106和滲濾buffer為對照。滲濾pCAM pGR106-NtFTl處理在滲濾后40 50天開花，而空質(zhì)粒(pCAM PGR106)和buffer處理仍處于營養(yǎng)生長階段(圖4)。說明NtFTl具有促進煙草開花的功能。
權(quán)利要求
1.一種煙草NtFTl基因的CDNA序列及其瞬時表達誘導(dǎo)煙草早花，其特征在于從煙草中獲得植物開花時間調(diào)節(jié)基因的全長cDNA，命名為NtFTl，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬時表達誘導(dǎo)煙草早花，其特征在于所述的NtFTl基因編碼的多肽序列，具有如SEQ ID NO:2所示的177個氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的煙草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬時表達誘導(dǎo)煙草早花，其特征在從煙草中克隆煙草NtFTl的PCR引物，引物序列為正向引物NtFTl-F: ATGCCAAGAGAACGTGAACC ；反向引物 NtFT1-R: TCAATCGGCAGACCTTCTAC。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的煙草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬時表達誘導(dǎo)煙草早花，其特征在從煙草中克隆煙草NtFTl基因的具體方法如下，首先利用擬南芥FT基因序列作為搜索序列，在Genbank煙草GSS數(shù)據(jù)庫中用tblastx程序進行比對，獲得一致性最高的煙草基因組序列(FH969747.1),利用該序列搜索中國煙草基因組計劃測序數(shù)據(jù)庫，將該序列向兩側(cè)延伸得到IOOOObp左右的基因組序列 目息；通過剪切位點分析，獲得候選煙草FT基因的cDNA序列，如序列SEQ ID NO:1 ；根據(jù)候選序列設(shè)計PCR引物NtFTl-F和NtFTl-R,取黑煙草Narrow leaf madole即將開花煙株的葉片，利用Trizon (Invitrogen)試劑提取RNA,用SuperScript RT Kit(Invitrogen)合成cDNA第一鏈，然后用NtFTl-F和NtFTl-R進行RT-PCR，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與候選序列100%—致。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的煙草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬時表達誘導(dǎo)煙草早花，其特征在擴增所述基因的全長或基因中任一片段的引物對。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的煙草NtFTl基因的cDNA序列及其瞬時表達誘導(dǎo)煙草早花，其特征在構(gòu)建煙草NtFTl基因的病毒瞬時表達載體具體過程如下，將已構(gòu)建的擬南芥FT基因的PVX表達載體pCAM pGR106-FT的FT基因用Cla I和Sal I切下，回收大片段質(zhì)粒片段；NtFTl基因里有Sal I酶切位點，在擴增NtFTl cDNA片段的正反引物上分別引物ClaI和 Xho IF: ATCGAT ATGCCAAGAGAACGTGAACC，下劃線所示為 Cla I 酶切位點；R: CTCGAGTCAATCGGCAGACCTTCTAC,下劃線所示為 Xho I 酶切位點，Xho I是Sal I的同尾酶；PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗證后與上述回收的載體片段連接，獲得NtFTl PVX瞬時表達載體pCAM pGR106-NtFTl。
7.煙草NtFTl基因在調(diào)節(jié)煙草開花中的應(yīng)用，其特征在于將上述PVX病毒表達載體pCAM pGR106-NtFT轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，經(jīng)農(nóng)桿菌滲濾后，使NtFTl在受體煙株中瞬時表達，促使煙草在滲濾后40 50天開花。
8.構(gòu)建的重組載體(pCAM pGR106-NtFTl)作為能夠誘導(dǎo)煙草早花，應(yīng)用于煙草育種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種煙草NtFT1基因的cDNA序列及其瞬時表達誘導(dǎo)煙草早花，具體涉及煙草FT(Flowering locus T)基因NtFT1及其在誘導(dǎo)煙草早花中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)中的基因領(lǐng)域。本發(fā)明公開了源自煙草的控制植物開花時間的NtFT1基因全長編碼序列及其編碼的蛋白序列。NtFT1基因是通過同源序列搜索，從中國煙草基因組測序計劃數(shù)據(jù)中經(jīng)Blastn比對及剪切位點分析得到的。以此序列涉及出一對NtFT1基因特異引物用半定量PCR(RT-PCR)方法，克隆了該基因。本發(fā)明還構(gòu)建了NtFT1基因的PVX病毒表達載體，構(gòu)建的病毒表達載體經(jīng)農(nóng)桿菌滲濾侵染烤煙品種紅花大金元、云煙87和K326，能誘導(dǎo)這些品種早花，證明該基因具有誘導(dǎo)烤煙早花的功能。將NtFT1基因的PVX病毒瞬時表達系統(tǒng)用于煙草育種，可縮短煙草生育期、加快育成煙草新品種的年限。
文檔編號A01H5/00GK103045609SQ20121046213
公開日2013年4月17日 申請日期2012年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月16日
發(fā)明者高玉龍, 謝賀, 肖炳光, 李永平 申請人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院