一種煙草病程相關(guān)蛋白pr10基因的特異性pcr引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種煙草病程相關(guān)蛋白PR10基因的特 異性PCR引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis-RelatedProteins,PRproteins)是植物體內(nèi)的一 類蛋白質(zhì)，受病原體或其他外界因子的脅迫而誘導(dǎo)表達(dá)，在植物抵御疾病、響應(yīng)外界壓力以 及適應(yīng)不良環(huán)境方面發(fā)揮著重要作用。根據(jù)病程相關(guān)蛋白家族成員的氨基酸組成、結(jié)構(gòu)及 生物學(xué)功能等特點(diǎn)，將其分為17類，即PR1~PR17,其中，PR10蛋白因其具有核酸酶活性及 抑菌活性成為了研究熱點(diǎn)。PR10蛋白最先是在用激發(fā)子處理過的歐芹培養(yǎng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的， 后來在辣椒、花生、水稻、刺茄、菊花、小麥、葡萄和苜蓿等20多種植物中，發(fā)現(xiàn)了其家族成 員，并進(jìn)行了基因序列特征和相關(guān)功能的研究。研究表明，PR10作為逆境應(yīng)答蛋白廣泛存 在于高等植物基因組中，大部分物種的蛋白氨基酸序列具有與核酸酶活性有關(guān)的"P-L00P" 結(jié)構(gòu)域，分子量在15~19kD之間，等電點(diǎn)偏酸性，無信號(hào)肽序列、屬胞內(nèi)蛋白。
[0003] 近年來，很多研究證實(shí)了PR10蛋白具有核酸酶活性和抑菌活性。Park等研究證 實(shí)，辣椒PR10蛋白（CaPRIO)比非磷酸化的CaPRIO具有更高的核酸酶活性，并發(fā)現(xiàn)這種核 酸酶活性在抗病毒途徑中能降解病毒RNA，抑制病毒侵染。He等發(fā)現(xiàn)，從葡萄中分離的PR10 蛋白（VpPRIO. 2)同時(shí)具有DNA酶活性和RNA酶活性。從花生中克隆的AhPRIO基因，其原 核表達(dá)的融合蛋白具有抗F.oxysporum和R.solani活性。辣椒和刺前的PR10蛋白也被證 實(shí)具有體外抑菌活性。但是，并不是所有的植物PR10蛋白都具有核酸酶活性，從人參、黃羽 扇豆、棉花、紅薯、辣椒、刺茄和花生中分離純化的PR10蛋白均證實(shí)具有體外核酸酶活性， 而從馬鈴薯、西芹和苜蓿中分離純化的PR10蛋白卻無體外核酸酶活性，這可能與PR10家族 不同成員性質(zhì)差異和結(jié)構(gòu)差異相關(guān)。
[0004]CN101781655A公開了水稻XIOsPRIO基因序列、基因編碼蛋白序列、基因在RNA 酶切降解中的應(yīng)用、基因超表達(dá)載體的構(gòu)建方法和水稻的遺傳轉(zhuǎn)化方法以及在轉(zhuǎn)基因水稻 中超表達(dá)的應(yīng)用。通過RT-PCR從水稻擴(kuò)增出XIOsPRIO基因，原核表達(dá)水稻XIOsPRIO基因 的產(chǎn)物具有RNase活性，可以用于RNA酶切降解，通過水稻遺傳轉(zhuǎn)化，獲得的XIOsPRIO基因 超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株，提高了水稻對(duì)細(xì)菌性條斑病的抗性。煙草是重要的模式植物，但未 見關(guān)于PR10蛋白特征和功能的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明致力于獲得從煙草中克隆得到的煙草病程相關(guān)蛋白PR10原核表達(dá)融合蛋 白，并進(jìn)行功能驗(yàn)證及分析，本發(fā)明提供了一種煙草病程相關(guān)蛋白PR10基因的特異性PCR 引物及其應(yīng)用。
[0006] 為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了煙草病程相關(guān)蛋白PR10基因的特異性PCR擴(kuò)增引物，所 述PCR擴(kuò)增引物的序列包括：SEQIDNO. 1所示核苷酸序列的上游引物和SEQIDN0. 2所 示核苷酸序列的下游引物；
[0008] 所述SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列的上游引物如下：5'-CATCATCATCATCATCATA TGGGTGTCACAACCTATACTCATG-3'，其中下劃線部分為pColdll載體NdeI酶切位點(diǎn)及其上游 部分序列。
[0009] 所述SEQIDN0. 2所示核苷酸序列的下游引物如下：5'-AGACTGCAGGTCGACAAGCTT TTAGGCATAGACGGTAGAATTGG-3'，其中下劃線部分為為pColdll載體HindIII酶切位點(diǎn)及其下 游部分序列。
[0010] 本發(fā)明中，通過所述引物可克隆出煙草病程相關(guān)蛋白，所述引物具有和載體相同 的一段同源臂，且上游引物含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)NdeI，下游引物具有限制性內(nèi)切酶位 點(diǎn)HindIII，從而可與經(jīng)過NdeI和HindIII雙酶切pColdll載體實(shí)現(xiàn)無縫克隆，同時(shí)上游引 物含有翻譯起始密碼子ATG，下游引物含有翻譯終止密碼子TAA，可使擴(kuò)增序列包含完整的 開放閱讀框，實(shí)現(xiàn)蛋白翻譯的起始和終止。
[0011] 優(yōu)選地，所述引物擴(kuò)增出的煙草病程相關(guān)蛋白的基因序列為SEQIDN0. 3所示的 核苷酸序列；
[0012] 所述SEQIDN0. 3所示的核苷酸序列如下：
[0013]ATGGGTGTCACAACCTATACTCATGAGGCATCAACCACAGTTGCCCCAACTAGATTATTCAAAGCTTTG GTTCTTGATGCAGATAACCTTATTCCAAAATTGATGCCACAAGTTGTTAAGAACATTGAGACTGTCGAAGGTGATGG TGGTGTTGGAAGCATCAAGAAGATGAACTTTGTGGAAGGTGGTCCAATAAAGTATTTGAAGCACAAGCTTCATGTGA TTGACGACAAGAACTTGGTAACCAAATACTCACTAATCGAAGGAGATGTTCTAGGAGACAAATTGGAATCCATTACC TATGATGTTAAATTCGAAACCTCTGCAAAAGGAGGTTGTATTTGCAAGACATCAACTGAGTACCACACAAAAGGTGA TTATGTTTTTAAGGAAGAAGAACATAATGAAGGCAAAGAGAAAGCCATGGAACTTTTCAAGGTTGTTGAAGACTACC TTCTTGCCAATTCTACCGTCTATGCCTAA。
[0014] 優(yōu)選地，所述引物擴(kuò)增出的煙草病程相關(guān)蛋白PR10基因得到的融合蛋白氨基酸 序列為SEQIDN0. 4所示的氨基酸序列；
[0015] 所述SEQIDN0. 4所示的氨基酸序列如下：
[0016]MGVTTYTHEASTTVAPTRLFKALVLDADNLIPKLMPQVVKNIETVE⑶GGVGSIKKMNFVEGGPIKY LKHKLHVIDDKNLVTKYSLIE⑶VL⑶KLESITYDVKFETSAKGGCICKTSTEYHTK⑶YVFKEEEHNEGKEKAM ELFKVVEDYLLANSTVYA*〇
[0017] 優(yōu)選地，使用所述PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得到的產(chǎn)物片段無縫克隆到 pColdll載體NdeI和HindIII克隆位點(diǎn)上，得到所需重組質(zhì)粒。
[0018] 本發(fā)明中，所述pColdll表達(dá)載體是一個(gè)基于低溫冷休克蛋白基因的大腸桿菌高 效表達(dá)載體，當(dāng)培養(yǎng)的大腸桿菌的溫度充分降低，幾乎暫時(shí)停止生長大部分的蛋白或表達(dá) 減少時(shí)，一組被稱為"冷休克蛋白"的蛋白質(zhì)被專門誘導(dǎo)表達(dá)，是一個(gè)分析蛋白質(zhì)功能和結(jié) 構(gòu)的重要工具。
[0019] 本發(fā)明中，所述無縫克隆相比現(xiàn)有技術(shù)的雙酶切后連接和TA連接，即省時(shí)省力， 還可以在質(zhì)粒的任何位點(diǎn)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)目標(biāo)DNA片斷的插入，而不需要任何限制性內(nèi)切 酶和連接酶。無縫克隆技術(shù)突破了傳統(tǒng)的雙酶切再加上連接，只需要一步重組法，即可得到 高效率克隆的重組載體。
[0020] 第二方面，本發(fā)明提供一種利用如第一方面所述的PCR擴(kuò)增引物擴(kuò)增煙草病程相 關(guān)蛋白PR10的方法，包括以下步驟：
[0021] (1)以SEQIDN0. 1-2所示的序列為引物，對(duì)含有煙草PR10基因序列的 pMD⑧丨8-T載體為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到煙草病程相關(guān)蛋白PR10的基因片段；
[0022] (2)將步驟（1)擴(kuò)增得到的基因片段無縫克隆到pColdll載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒；
[0023] (3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組大腸桿菌，然后對(duì)重組大腸桿菌低溫誘導(dǎo) 表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后得到可溶性的融合蛋白。
[0024] 優(yōu)選地，步驟（1)所述的模板為從煙草葉片cDNA中克隆得到的PR10基因序列克 隆到pMD? 18-T載體得到的質(zhì)粒。
[0025] 優(yōu)選地，步驟⑴所述的擴(kuò)增條件為：
[0026] (a)95°C預(yù)變性 3min，1 循環(huán)；
[0027] (b) 95°C變性 30s、57°C退火 30s、72°C延伸 60s，35 個(gè)循環(huán)；
[0028] (c)72°C延伸lOmin，1 循環(huán)；
[0029] (d)4°C保存。
[0030] 優(yōu)選地，步驟（2)所述將步驟（1)擴(kuò)增得到的基因片段無縫克隆到pColdll載體 的NdeI和HindIII克隆位點(diǎn)。
[0031] 優(yōu)選地，步驟（3)所述的低溫誘導(dǎo)表達(dá)包括如下步驟：37°C下培養(yǎng)至0D6。。為 0. 5-0. 6時(shí)，加入四環(huán)素在37°C下培養(yǎng)30-35min，冷卻，加IPTG低溫誘導(dǎo)過夜，離心收菌。
[0032]所述0D6。。為0·5-0. 6,例如可以是0·51、0· 52、0· 53、0· 54、0· 55、0· 56、0· 57、0· 58、 0· 59 或 0· 6。
[0033]所述培養(yǎng)時(shí)間 30_35min，例如可以是 30min、31min、32min、33min、34min或 35min。
[0034] 優(yōu)選地，所述四環(huán)素的濃度為9-10ng/mL，例如可以是9ng/mL、9.lng/mL、9. 2ng/ mL、9. 3ng/mL、9. 4ng/mL、9. 5ng/mL、9. 6ng/mL、9. 7ng/mL、9. 8ng/mL、9. 9ng/mL或 10ng/mL， 優(yōu)選為10ng/mL。
[0035]優(yōu)選地，所述IPTG的濃度為 0. 08-0. 15mM，例如可以是 0. 08mM、. 0. 09mM、0.ImM、 0·llmM、0. 12mM、0. 13mM、0. 14mM或 0· 15mM，優(yōu)選為 0· 1-0. 12mM，進(jìn)一步優(yōu)選為 0·