專利名稱：蝴蝶蘭防褐變專用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種防止蝴蝶蘭組織培養(yǎng)過程中褐變的培養(yǎng)基。技術(shù)背景
蝴蝶蘭[phalaenopsis ]為蘭科蝴蝶蘭屬植物，它是一種熱帶氣生蘭，俗稱“洋蘭”。蝴蝶蘭花型似蝴蝶，形態(tài)美妙、色彩豐富、花期長(zhǎng)，在熱帶蘭中素有“蘭花皇后”美稱。 蝴蝶蘭種類豐富，分布廣，東起菲律賓、新幾內(nèi)亞，南達(dá)澳大利亞北部，西蘇門答臘，北到我國(guó)臺(tái)灣、云南、四川西部均有原種(野生蝴蝶蘭)存在，約有50多種，其中我國(guó)有7種，全部為附生蘭。蝴蝶蘭商品化大規(guī)模栽培十分成功，是近年來國(guó)際花卉市場(chǎng)上最受歡迎的洋蘭。
由于蝴蝶蘭是單莖性氣生蘭，植株很少發(fā)育側(cè)枝，很難采用常規(guī)分株方式進(jìn)行無性繁殖。其種子也不含胚乳或其他組織，在自然條件下萌發(fā)率極低，因此無法利用播種方式進(jìn)行有性繁殖。而采用組織培養(yǎng)方法進(jìn)行種苗繁殖是目前蝴蝶蘭大規(guī)模生產(chǎn)的唯一途徑。蝴蝶蘭快速繁殖的途徑主要是利用無菌播種和利用各種類型的外植體誘導(dǎo)類原球莖， 進(jìn)而誘導(dǎo)分生苗實(shí)現(xiàn)快繁，不用通過誘導(dǎo)愈傷組織而直接分化叢生芽。其中，類原球莖是一類呈珠粒狀的幼嫩器官(種子萌發(fā)時(shí)先是胚的膨大，種皮破裂，一定時(shí)間后發(fā)育成肉眼可見淺黃色的原胚呈球狀，稱為原球莖，由其它外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的稱類原球莖)。
蝴蝶蘭和其他蘭科植物一樣，在組培快繁生產(chǎn)中存在著易褐化死亡的問題，因此如何克服褐變成了組培快繁生產(chǎn)成功與否的關(guān)鍵。在目前的研究和生產(chǎn)中，對(duì)于如何預(yù)防蝴蝶蘭組培過程中的褐變已經(jīng)有了較多的研究和應(yīng)用。
趙瀅等在《蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中褐變發(fā)生及控制的研究進(jìn)展》(北方園藝，2009 (11) 110 114)中對(duì)蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中褐變的機(jī)理進(jìn)行了解析外植體組織被切割和接種時(shí)， 酚、酶的區(qū)域化分布被打破，在有氧條件下，釋放或合成的酚氧 化酶將組織切口表面的酚類物質(zhì)氧化成醌，這些褐色或黑色物質(zhì)逐漸擴(kuò)散到整個(gè)培養(yǎng)基中抑制了其它酶的活性，毒害整個(gè)外植體組織。通過對(duì)蝴蝶蘭褐變外植體的顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)褐變?nèi)~片外植體的上表皮已變形，維管束完全破壞，被有毒的鞣質(zhì)填充，有些薄壁細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有不明物質(zhì)沉積。因此，褐變發(fā)生的關(guān)鍵原因在于細(xì)胞膜完整性被破壞。
同時(shí)，本人還對(duì)蝴蝶蘭組織培養(yǎng)中褐變的控制提出了幾種措施，包括選擇合適的外植體、控制光照溫度等培養(yǎng)條件、連續(xù)轉(zhuǎn)移外植體等控制條件，另外還包括優(yōu)化培養(yǎng)基 (MS紙橋培養(yǎng)基)及加入抗褐劑(吸附劑和抗氧化劑)。并有研究表明，在培養(yǎng)基中加入吸附劑活性炭2 g/L，或PVP I g/L，蝴蝶蘭褐變控制效果顯著；抗氧化劑谷胱甘肽控制褐變效果雖不及活性炭，但綜合效果最佳。
中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?01010190129. 5)公開了一種蝴蝶蘭培養(yǎng)基，主要包括大量化合物類、微量化合物類、有機(jī)元素類、激素類、添加物，所述大量化合物類主要包括無水氯化鈣、硝酸氨等，其中每一種物質(zhì)的濃度均為20 1700mg/L;所述微量化合物類主要包括硫酸錳、硫酸鋅等，其中每一種物質(zhì)的濃度均為O. 01 20mg/L;所述有機(jī)元素類主要包括維生素B1、煙酸等，其中每一種物質(zhì)的濃度均為O. 05 200mg/L;所述激素類為O. 05 lmg/L的萘乙酸；所屬添加物主要包括馬鈴薯、香蕉等，其中每一種物質(zhì)的濃度均為I 60g/L;其余為水。本發(fā)明通過調(diào)節(jié)添加物的種類及加入量，使培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)更全面，可很好的促進(jìn)蝴蝶蘭壯苗生根，減少翹根和褐變，提高種苗的質(zhì)量。但其中沒有專門針對(duì)控制褐變的措施和組分。
王棟等在《植物組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及其防止措施》(黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)2008(1)7 10)中分析了植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)褐變的若干因素，并公開了利用吸附劑(有聚乙烯吡咯烷酮、活性炭等)和抗氧化劑(抗壞血酸、硫代硫酸鈉、檸檬酸、L 一半胱氨酸、谷胱甘肽、蕓香苷、二硫蘇糖醇、酪氨酸、巰基乙醇、卵清蛋白、維生素B、維生素E、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、氨基酸、亞硫氫酸鈉、氰化鉀、多胺)等用來減少植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象。其主要原理在于通過吸附組織培養(yǎng)過程中由于切割造成機(jī)械損傷處分泌的酚類化合物，或者通過上述抗氧化劑防止擴(kuò)散到培養(yǎng)基中的酚類化合物被氧化成褐色的醌類物質(zhì)，從而達(dá)到防止褐變的作用。但是，這種方法的不足之處在于只能被動(dòng)解決擴(kuò)散到培養(yǎng)基質(zhì)中的酚類化合物，在實(shí)際生產(chǎn)過程中還是會(huì)存在較高的褐變現(xiàn)象。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種相對(duì)于現(xiàn)有防褐變技術(shù)能更有效預(yù)防蝴蝶蘭組織培養(yǎng)過程中發(fā)生褐變的專用培養(yǎng)基。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種能有效預(yù)防蝴蝶蘭組織培養(yǎng)過程中發(fā)生褐變的專用培養(yǎng)基，以含有2. 5 mg/L的芐氨基腺嘌呤(BA)和O. 2mg/L萘乙酸(NAA)的1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加濃度為5-15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素內(nèi)酯 (BR)。
上述的蝴蝶蘭防褐變專用培養(yǎng)基，抗壞血酸(VC)的濃度為8-12 mg/L，油菜素內(nèi)酯 (BR)的濃度為 O. 05-0. 3 mg/L。
上述的蝴蝶蘭防褐變專用培養(yǎng)基，其中的抗壞血酸(VC)的濃度為10 mg/L，油菜素內(nèi)酯(BR)的濃度為O.1 mg/L。
上述的蝴蝶蘭防褐變專用培養(yǎng)基中O. 1-0. 2 mg/L的萘乙酸(NAA)可以用O. 2mg/ L的吲哚乙酸(IAA)來代替。
上述的蝴蝶蘭防褐變專用培養(yǎng)基的pH保持在5. 4-5. 6。
本發(fā)明的有益效果在于利用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，即以含有2. 5 mg/L的芐氨基腺嘌呤(BA)和O. 2mg/L萘乙酸(NAA)的1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，再添加濃度為5_15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素內(nèi)酯而組成的培養(yǎng)基，在進(jìn)行誘導(dǎo)培育過程中，其中的抗壞血酸和油菜素內(nèi)酯可以發(fā)揮防褐變方面的協(xié)同作用，一方面通過發(fā)揮抗壞血酸對(duì)滲入到培養(yǎng)基中酚類物質(zhì)的抗氧化作用體現(xiàn)直接還原作用，另一方面油菜素內(nèi)酯在外植體內(nèi)部能增強(qiáng)蝴蝶蘭組織內(nèi)部抗氧化酶的活性，減少褐變根本因素醌類物質(zhì)的產(chǎn)生和擴(kuò)展；兩者的結(jié)合能有效防止蝴蝶蘭誘導(dǎo)培養(yǎng)中褐變現(xiàn)象的產(chǎn)生，將褐變率從常規(guī)的 30%以上降低到20%以下。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例取已過盛花期帶休眠芽的花梗作為外植體材料，切下其帶芽莖段，長(zhǎng)約2 - 3cm，用自來水清洗干凈，在飽和漂白粉上清液中浸泡15 min，浸泡時(shí)不斷攪動(dòng)，浸泡后的莖段用流水沖洗干凈，置于超凈工作臺(tái)上，先用75 %的酒精消毒30 s，無菌水清洗I次，再用O.1 %的升汞浸泡10 min，經(jīng)無菌水沖洗數(shù)次，將帶芽莖段接種到經(jīng)設(shè)計(jì)的不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，重復(fù)3次。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS +BA 2.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加濃度為5-15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001-0. 5 mg/L的油菜素內(nèi)酯(BR)，其中pH值調(diào)節(jié)到 5. 4-5. 6。
在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度激素和配方組成的蝴蝶蘭防褐變專用培養(yǎng)基，在培養(yǎng)條件每天光照12 h，光強(qiáng)I 600Lx，溫度25 ±2 °C下誘導(dǎo)培養(yǎng)效果如下表所示
權(quán)利要求
1.一種蝴蝶蘭防褐變專用培養(yǎng)基，以含有2. 5 mg/L的芐氨基腺嘌呤(BA)和O. 2mg/L 萘乙酸(NAA)的1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其特征在于還含有濃度為5 15 mg/L的抗壞血酸(VC)和O. 001 O. 5 mg/L的油菜素內(nèi)酯(BR)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝴蝶蘭防褐變專用培養(yǎng)基，其特征在于其pH值保持在5.4 5. 6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝴蝶蘭防褐變專用培養(yǎng)基，其特征在于所述的抗壞血酸 (VC)的濃度為8-12 mg/L,油菜素內(nèi)酯(BR)的濃度為O. 05 O. 3 mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝴蝶蘭防褐變專用培養(yǎng)基，其特征在于所述的抗壞血酸 (VC)的濃度為10 mg/L，油菜素內(nèi)酯(BR)的濃度為O.1 mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝴蝶蘭防褐變專用培養(yǎng)基，其特征在于所述的其中O.2 mg/ L的萘乙酸(NAA)可以用O. 2mg/L的吲哚乙酸(IAA)來代替。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蝴蝶蘭防褐變專用培養(yǎng)基。其中以含有2.5mg/L的芐氨基腺嘌呤(BA)和0.2mg/L萘乙酸(NAA)的1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并加入了濃度為5-15mg/L的抗壞血酸(VC)和0.001-0.5mg/L的油菜素內(nèi)酯(BR)。本發(fā)明可大幅度降低蝴蝶蘭組織培養(yǎng)過程中的褐變率。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102986533SQ20121054066
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者畢德 申請(qǐng)人:蘇州和美生物科技有限公司