巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的為提供一種對育種新品種非常有用的有效生產(chǎn)巴西橡膠樹的多倍體的方法。該方法的特征在于對發(fā)根的巴西橡膠樹(三葉橡膠樹)的種子進(jìn)行秋水仙素處理。在本發(fā)明中，種子優(yōu)選在發(fā)根后發(fā)芽前采集。秋水仙素處理優(yōu)選通過使種子與秋水仙素濃度為400至800ppm的秋水仙素溶液相接觸來進(jìn)行。
【專利說明】巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及巴西橡膠樹(para rubber trees)的多倍體的有效生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]天然橡膠為彈性聚合物，其作為橡膠制品的主原料大量廣泛地用于各種應(yīng)用。天然橡膠通過收集由產(chǎn)膠乳植物如橡膠樹分泌的膠乳，并使膠乳進(jìn)行期望的處理來生產(chǎn)。因此，橡膠樹，特別是巴西橡膠樹(三葉橡膠樹(Hevea brasiliensis)),主要在如泰國、馬來西亞和印度尼西亞等熱帶國家商業(yè)化種植。
[0003]近年來隨著遺傳工程領(lǐng)域的發(fā)展，已變得可通過插入優(yōu)選的外源基因來改變天然存在植物的特性。同樣在天然橡膠生產(chǎn)領(lǐng)域，已對生產(chǎn)具有期望特性的植物的方法進(jìn)行了研究，所述植物例如通過遺傳改變產(chǎn)膠乳植物的能夠產(chǎn)生較高質(zhì)量膠乳的植物或能夠產(chǎn)生大量膠乳的植物。盡管特別優(yōu)選的方法的實(shí)例包括通過遺傳重組的分子育種，但必須經(jīng)過包括再分化和基因插入以獲得遺傳重組植物的過程。
[0004]主要用于將基因插入植物的方法的實(shí)例包括包含通過用農(nóng)桿菌屬物種(一種植物病原體)感染植物細(xì)胞來插入基因的方法(農(nóng)桿菌法)，和包含用基因槍(particle gun)將基因負(fù)載的金顆粒射入植物細(xì)胞的方法(基因槍法)(參見，例如專利文獻(xiàn)I)。
[0005]根據(jù)農(nóng)桿菌法，已存在幾種生產(chǎn)巴西橡膠樹轉(zhuǎn)化株的成功實(shí)例。例如，已公開了通過使用農(nóng)桿菌屬細(xì)菌的載體將期望的基因插入源自另一株巴西橡膠樹的愈傷組織并由該植物組織再生植物來生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的巴西橡膠樹的方法(參見，例如專利文獻(xiàn)2)。另外，已報道由源自巴西橡膠樹的株被(integument)的愈傷組織使用農(nóng)桿菌法獲得轉(zhuǎn)化株(參見,例如非專利文獻(xiàn)I)。
`[0006]然而，產(chǎn)膠乳植物如巴西橡膠樹具有例如與其它類型植物相比，插入基因的困難較大和基因插入效率極弱的問題。同樣在前述實(shí)例中，盡管已對通過調(diào)整在轉(zhuǎn)染愈傷組織時所用的農(nóng)桿菌的細(xì)菌濃度而對增加基因插入效率進(jìn)行了研究，但還未獲得足夠的基因插入效率水平。
[0007]另外，還存在其中可通過增加個體的染色體數(shù)改變特性的情況。通常，體細(xì)胞為具有生存所需的兩組染色體的二倍體，而生殖細(xì)胞為具有一組染色體的單倍體。一般來說，具有三組以上的染色體的個體(即，三倍體以上的個體)稱作多倍體。在植物中，多倍體傾向于具有比二倍體大的果實(shí)等組織，并且還傾向于不形成種子。
[0008]在該方式中，為了獲得具有新特性且不引入外源基因的植物新品種，已在植物選擇育種的領(lǐng)域中常規(guī)進(jìn)行多倍體育種。例如，其中染色體數(shù)加倍的多倍體可通過在秋水仙素溶液中浸潰種子或其它植物組織來生產(chǎn)。由于秋水仙素抑制了細(xì)胞分裂期間紡錘體的形成，細(xì)胞分裂在用秋水仙素處理的植物中受到抑制。另一方面，由于染色體分離受到抑制而形成了其中染色體數(shù)加倍的細(xì)胞。
[0009]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0010]專利文獻(xiàn)[0011]專利文獻(xiàn)1:日本未審專利申請，第一次公布2005-130815號
[0012]專利文獻(xiàn)2:日本專利公布3289021號
[0013]非專利文獻(xiàn)
[0014]非專利文獻(xiàn)I = Blanc 等，Plant Cell Report, 2006, Vol.24, pp.724-733
【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]發(fā)明要解決的問題
[0016]盡管多倍體育種在生產(chǎn)具有更期望特性的有用植物新品種方面是重要的，但秋水仙素處理的條件根據(jù)植物類型變化很大。因此，必須通過針對各種類型的植物進(jìn)行重復(fù)試錯(repeated trial and error)來確定優(yōu)選的處理?xiàng)l件,并且還未建立在巴西橡膠樹中生產(chǎn)有效的多倍體的方法。
[0017]根據(jù)前述觀點(diǎn)，本發(fā)明涉及在巴西橡膠樹中有效生產(chǎn)對新品種育種極其有用的多倍體的方法。
[0018]用于解決問題的方案
[0019]作為進(jìn)行深入研究以解決前述問題的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過對巴西橡膠樹的種子在其已發(fā)根后進(jìn)行秋水仙素處理，可以以比過去高的機(jī)率獲得多倍體，從而導(dǎo)致本發(fā)明的完成。
[0020]即，本發(fā)明以下述方式構(gòu)成。
[0021](1) 一種巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其包括:秋水仙素處理步驟，其中對已經(jīng)發(fā)根的巴西橡膠樹(三葉橡膠樹)的種子進(jìn)行秋水仙素處理。
[0022](2)根據(jù)上述(I)所述的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其包括:發(fā)根步驟，其中在所述秋水仙素處理步驟之前，通過將所述巴西橡膠樹的種子在15°C至25°C下用水含浸來使其發(fā)根。
[0023](3)根據(jù)上述(I)所述的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其中進(jìn)行所述秋水仙素處理步驟的所述種子為已發(fā)根但還未發(fā)芽的種子。
[0024](4)根據(jù)上述(I)所述的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其中所述秋水仙素處理步驟為其中將所述種子與秋水仙素濃度為400ppm至800ppm的秋水仙素溶液接觸的步驟。
[0025](5)根據(jù)上述(4)所述的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其中所述秋水仙素處理步驟為其中將所述種子與所述秋水仙素溶液接觸40小時至90小時的步驟。
[0026](6)根據(jù)上述(5)所述的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其中所述秋水仙素處理步驟為其中所述種子與秋水仙素濃度為600ppm至800ppm的秋水仙素溶液接觸60小時至80小時的步驟。
[0027](7)根據(jù)上述(I)至(6)任一項(xiàng)所述的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其中使所述種子在所述秋水仙素處理步驟后發(fā)芽和生長。
[0028]發(fā)明的效果
[0029]可通過使用本發(fā)明的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法極其有效地生產(chǎn)多倍體。特別地，本發(fā)明使得成熟多倍體通過使得用秋水仙素處理的種子以與二倍體種子相同的方式生長而容易地獲得?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0030]圖1為示出實(shí)施例1中通過流式細(xì)胞術(shù)分析二倍體的結(jié)果的圖。
[0031]圖2為示出實(shí)施例1中通過流式細(xì)胞術(shù)分析四倍體的結(jié)果的圖。
[0032]圖3為示出實(shí)施例1中通過流式細(xì)胞術(shù)分析嵌合體的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]秋水仙素處理典型地通過不僅處理種子，而且還處理組織如苗(shoots)或葉，以及脫分化處理獲得的愈傷組織來進(jìn)行。例如，在對組織如植物的苗(plant shoot)進(jìn)行秋水仙素處理的情況下，多倍體植物可通過從組織分離多倍體細(xì)胞并使其發(fā)根等來再生。另外，在用秋水仙素處理愈傷組織的情況下，多倍體植物可類似地通過常規(guī)方法由愈傷組織再生。然而，由來自愈傷組織或來自植物的一部分的組織的植物的再生涉及復(fù)雜過程，并且由于其需要適合的植物激素等，因而還是昂貴的。相反，在用秋水仙素處理種子的情況下，多倍體植物可通過以與未處理種子相同的方式培養(yǎng)種子來容易地獲得。
[0034]然而，幾乎沒有多倍體僅通過將巴西橡膠樹的種子浸潰在秋水仙素溶液中而獲得。本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為，由于巴西橡膠樹的種子被硬皮覆蓋，秋水仙素不能充分地浸透種子內(nèi)，從而阻止對巴西橡膠樹的種子有效地進(jìn)行秋水仙素處理。因此，當(dāng)種皮的一部分被切開時，盡管秋水仙素能夠充分地浸透種子內(nèi)，但種子不能發(fā)芽且不能獲得多倍體。
[0035]本發(fā)明的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法(還稱作〃多倍體生產(chǎn)方法〃)的特征在于對發(fā)根后的種子進(jìn)行秋水仙素處理。作為對發(fā)根后的種子進(jìn)行秋水仙素處理的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)秋水仙素處理可對種子有效進(jìn)行而不損害種子發(fā)芽或生長，并且多倍體植物可通過以與未處理種子相同的方式培養(yǎng)處理的種子來容易地獲得。盡管通過在發(fā)根后用秋水仙素處理種子而能夠有效獲得多倍體(其中染色體數(shù)為處理前種子的二倍)的理由并不清楚，但推測秋水仙素能夠通過根已從硬皮突出的種子的那些部分有效地浸透入種子內(nèi)。
[0036]對本發(fā)明的多倍體生產(chǎn)方法中進(jìn)行秋水仙素處理的種子沒有特別限定，條件是它們已經(jīng)發(fā)根，或者換言之，能夠目視確認(rèn)在其外部有根。在本發(fā)明中，發(fā)根后的早期的種子如發(fā)芽前的種子是更優(yōu)選的。通過在生長早期對種子進(jìn)行秋水仙素處理，可獲得其中構(gòu)成植物的幾乎所有細(xì)胞為多倍體的植物。
[0037]對用于使種子發(fā)根的方法沒有特別限定，并且可使用在使種子發(fā)根時常用的任何方法。例如，可通過使種子在20°C至30°C下在充分浸有水的支持體(support)如一片紗布或組織上靜置幾天至兩周而使種子發(fā)根。種子還可包裹在浸有水的支持體中。在本發(fā)明中，通過在15°C至25°C下將巴西橡膠樹的種子用水含浸而使其發(fā)根。盡管對用水含浸種子的持續(xù)時間沒有特別限定，條件是其為使種子發(fā)根的充分的持續(xù)時間即可，但是種子優(yōu)選在其發(fā)根后發(fā)芽前進(jìn)行隨后的秋水仙素處理。
[0038]對進(jìn)行本發(fā)明的多倍體生產(chǎn)方法中秋水仙素處理的種子沒有特別限定，條件是它們是巴西橡膠樹的種子即可，并且可為自然存在的二倍體巴西橡膠樹的種子，其中已通過基因重組技術(shù)等刪除基因的一部分的變體，或合并外源基因等的基因重組體。另外，種子可為多倍體如三倍體或四倍體。例如，可獲得其中通過對三倍體巴西橡膠樹種子進(jìn)行本發(fā)明的多倍體生產(chǎn)方法而使染色體數(shù)增加六倍的巴西橡膠樹。[0039]通過使種子在它們已發(fā)根后與秋水仙素溶液接觸來進(jìn)行秋水仙素處理。對用于使種子與秋水仙素溶液接觸的方法沒有特別限定，并且種子可浸潰于秋水仙素溶液中，種子可靜置于浸有秋水仙素溶液的支持體如一片紗布上，或者種子可包裹在該支持體中。此外，在使用浸有秋水仙素溶液的支持體的情況下，種子的根部分優(yōu)選與秋水仙素溶液接觸。
[0040]對秋水仙素處理期間的溫度沒有特別限定，條件是溫度不損害隨后的種子生長即可。另外，秋水仙素處理可在控溫環(huán)境中或在如未提供有任何特定的溫度控制的溫室等的環(huán)境中進(jìn)行。在本發(fā)明中，秋水仙素處理可在例如0°c至35°C和優(yōu)選20°C至30°C的溫度下進(jìn)行。為了方便起見，秋水仙素處理還可優(yōu)選在室溫下進(jìn)行。
[0041]鑒于如用于進(jìn)行秋水仙素處理的方法和溫度以及處理時間等因素，可適當(dāng)?shù)卮_定秋水仙素溶液中秋水仙素的濃度。在秋水仙素濃度過低的情況下，秋水仙素不能充分浸透種子內(nèi)，并且染色體不能加倍。另一方面，在秋水仙素濃度過高的情況下，存在發(fā)生畸形的風(fēng)險。在本發(fā)明中，接觸種子的秋水仙素溶液中的秋水仙素的濃度優(yōu)選400ppm至800ppm，更優(yōu)選 600ppm 至 800ppm。
[0042]鑒于如用于進(jìn)行秋水仙素處理的方法和溫度以及秋水仙素溶液中秋水仙素的濃度等因素，可適當(dāng)?shù)卮_定使種子接觸秋水仙素溶液的時間量(處理時間)。在處理時間過短的情況下，秋水仙素不能充分浸透種子內(nèi)且染色體不能加倍。另一方面，在處理時間過長的情況下，存在發(fā)生畸形的風(fēng)險。在本發(fā)明中，室溫下使種子接觸秋水仙素溶液的時間量優(yōu)選40小時至90小時，更優(yōu)選60小時至80小時。
[0043]在本發(fā)明的多倍體生產(chǎn)方法中，秋水仙素處理優(yōu)選通過以下來進(jìn)行:在20°C至30°C的控溫環(huán)境下或在非控制環(huán)境下在濃度為400ppm至800ppm、優(yōu)選600ppm至800ppm和更優(yōu)選600ppm的秋水仙素溶液中浸潰發(fā)根的種子40小時至90小時、優(yōu)選60小時至80小時和更優(yōu)選72小時。
[0044]秋水仙素處 理后，用蒸餾水等洗滌種子以除去殘留的秋水仙素，隨后以與未處理種子相同的方式根據(jù)常規(guī)方法培養(yǎng)。例如，在通過使種子在20°C至30°C下在充分浸有水的支持體(substrate)如一片紗布或組織上靜置幾天而發(fā)芽后，通過將種子移植入培養(yǎng)介質(zhì)，隨后在提供充分水的同時培養(yǎng)，從而使多倍體生長。
[0045]例如，四倍體巴西橡膠樹可通過對二倍體巴西橡膠樹種子進(jìn)行本發(fā)明的多倍體生產(chǎn)方法來生產(chǎn)。三倍體巴西橡膠樹可通過培育這些四倍體并將它們與二倍體雜交來生產(chǎn)。
[0046]實(shí)施例
[0047]盡管下面通過闡明其實(shí)施例來提供本發(fā)明的更詳細(xì)的解釋，但本發(fā)明不限于下述實(shí)施例。
[0048][實(shí)施例1]
[0049]室溫(約20°C至30°C )下將天然存在的二倍體巴西橡膠樹的種子放置在浸有水的一片紗布上幾天至一周，并使其發(fā)根。將已目視確認(rèn)發(fā)根但還未發(fā)芽的這些種子浸潰在秋水仙素濃度為200ppm至800ppm的秋水仙素溶液中2天至5天。隨后,在用蒸懼水洗漆后將種子移植至種植機(jī)(planter)中。
[0050]從生長的植物采集三片葉子，并通過流式細(xì)胞術(shù)確認(rèn)染色體數(shù)(倍數(shù)性)，并將植物確認(rèn)為二倍體、四倍體或包含二倍體細(xì)胞和四倍體細(xì)胞的混合物的嵌合體。結(jié)果示于圖1至3和表1中。[0051][表1]
[0052]
【權(quán)利要求】
1.一種巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其包括: 秋水仙素處理步驟，其中對已經(jīng)發(fā)根的巴西橡膠樹(三葉橡膠樹)的種子進(jìn)行秋水仙素處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其進(jìn)一步包括: 發(fā)根步驟，其中在所述秋水仙素處理步驟之前，通過將所述巴西橡膠樹的種子在15°C至25°C下用水含浸來使其發(fā)根。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其中進(jìn)行所述秋水仙素處理步驟的所述種子為已發(fā)根但還未發(fā)芽的種子 。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其中所述秋水仙素處理步驟為其中將所述種子與秋水仙素濃度為400ppm至800ppm的秋水仙素溶液接觸的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其中所述秋水仙素處理步驟為其中將所述種子與所述秋水仙素溶液接觸40小時至90小時的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其中所述秋水仙素處理步驟為其中所述種子與秋水仙素濃度為600ppm至800ppm的秋水仙素溶液接觸60小時至80小時的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巴西橡膠樹的多倍體的生產(chǎn)方法，其中使所述種子在所述秋水仙素處理步驟后發(fā)芽和生長。
【文檔編號】A01H1/08GK103607883SQ201280027970
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月10日
【發(fā)明者】渡邊訓(xùn)江 申請人:株式會社普利司通