一種降低俄羅斯橡膠草組織培養(yǎng)褐化率的組培繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程技術(shù)植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及的是一種降低俄羅斯橡膠草組織培養(yǎng)褐化率的組培繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]橡膠草(Taraxacum kok-saghyz Rodin)是菊科蒲公英屬多年生宿根草本植物，其根中天然橡膠含量平均為22.4%，并且其質(zhì)量與巴西橡膠樹(shù)產(chǎn)的橡膠相似，同時(shí)還含有25 - 40%的菊糖，被公認(rèn)為是有發(fā)展?jié)摿Φ膬?yōu)良天然橡膠植物之一，同時(shí)也是研宄調(diào)控橡膠合成與貯藏分子過(guò)程的理想模式植物。
[0003]橡膠草繁殖過(guò)程中，自交不育，所以其種子是個(gè)體間及不同品系之間雜交的結(jié)果，這樣難以用種子保存優(yōu)良個(gè)體及遺傳品系以便進(jìn)一步育種；同時(shí)由于橡膠草野生生境受到嚴(yán)重破壞，目前其資源量非常稀少，限制了其試驗(yàn)研宄，所以需要開(kāi)發(fā)組織培養(yǎng)的方法，同時(shí)也為橡膠草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其育種提供技術(shù)支持。目前我國(guó)的研宄有:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研宄所林伯煌《熱帶農(nóng)業(yè)工程》中發(fā)表的“橡膠草的組織培養(yǎng)研宄”和石河子大學(xué)羅成華《北方園藝》發(fā)表的“橡膠草高頻再生體系的建立”等，根據(jù)目前的研宄成果分析，現(xiàn)有的技術(shù)大多是以新疆野生的橡膠草為材料，然而與橡膠含量更高的俄羅斯橡膠草相比，上述研宄直接以俄羅斯橡膠草為客體，發(fā)現(xiàn)俄羅斯橡膠草葉片外植體經(jīng)直接消毒后接種至培養(yǎng)基上極易導(dǎo)致褐化，尤其在我國(guó)大陸的亞熱帶和溫帶氣候及土壤環(huán)境下，褐化率竟高達(dá)80 %，同時(shí)在我國(guó)的生長(zhǎng)率和成活率也較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種降低俄羅斯橡膠草組織培養(yǎng)褐化率的組培繁殖方法。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0006](I)接種:選俄羅斯橡膠草品系的成熟種子，消毒處理后在無(wú)菌條件下接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在接種初期在人工氣候箱中暗培養(yǎng)5天，再移至培養(yǎng)間中自然光下培養(yǎng)，所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+6-BAl.5?2.0mg/L+NAA0.1?0.2mg/L ；
[0007](2)誘導(dǎo)分化愈傷組織:將經(jīng)步驟(I)處理得到的種子萌發(fā)后誘導(dǎo)愈傷組織形成，接種于分化培養(yǎng)基上，進(jìn)行不定芽的分化培養(yǎng)，所述的分化培養(yǎng)基為:MS+6-BA 0.5?
1.0mg/L+NAA 0.05 ?0.lmg/L+GA30.1 ?0.2mg/L ；
[0008](3)不定芽增殖:將步驟(2)的不定芽接種于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，在增殖培養(yǎng)基中添加抗氧化劑，生成叢生芽，所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.lmg/L ；
[0009](4)生根培養(yǎng):將叢生芽分成單株后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，生成生根苗，所述的生根培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA 0.3mg/L ；
[0010](5)煉苗移栽:將生根苗在煉苗室開(kāi)蓋鍛煉3?5天后，移栽至細(xì)沙、蛭石、珍珠巖等比例混合的基質(zhì)中，得到橡膠草再生植株。
[0011]所有培養(yǎng)基均添加蔗糖30g/L，瓊脂粉5g/L，pH值為5.8?6.0。
[0012]在所述的增殖培養(yǎng)基還加入Na2S2O3，含量為15g/L。
[0013]步驟(I)選用的橡膠草品系的成熟種子為外植體材料，首先浸泡4小時(shí)，用洗潔精溶液洗凈后，用流水沖2?4小時(shí)，在超凈工作臺(tái)上，用75%體積百分比酒精消毒10s，用0.1%質(zhì)量百分比HgCL2溶液消毒5min，最后用無(wú)菌水沖洗5?6次，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在接種初期在人工氣候箱中暗培養(yǎng)5天，再移至培養(yǎng)間中自然光下培養(yǎng)。
[0014]步驟(2)中愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4周后愈傷組織分化形成不定芽。
[0015]所述步驟(I)的培養(yǎng)條件是，人工氣候箱中暗培養(yǎng)5d，培養(yǎng)溫度為23±2°C，再移至培養(yǎng)間中自然光下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照強(qiáng)度為1500?20001x，光照時(shí)間為16小時(shí)/天。
[0016]所述步驟(2)、(3)、(4)的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25±2°C、光照強(qiáng)度為1500?20001x、光照時(shí)間為16小時(shí)/天。
[0017]所述步驟(5)的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為24-26°C，煉苗室中4遮光，使光照強(qiáng)度為自然光的60 %，濕度控制在80 %。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明建立了一種有效降低俄羅斯橡膠草組織培養(yǎng)褐化率與快速繁殖的方法，相比傳統(tǒng)的橡膠草組培繁殖方法，通過(guò)調(diào)整各階段培養(yǎng)基的成分并添加了抗氧化劑等技術(shù)手段極大地降低了俄羅斯橡膠草組織培養(yǎng)褐化率，提高了橡膠草的繁殖系數(shù)，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)研宄，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基可以將褐化率降低到35%以下，添加本發(fā)明所述的Na2S2O3能夠?qū)⒑只蔬M(jìn)一步降低到10%以下。因此本發(fā)明能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量遺傳性狀一致的優(yōu)質(zhì)壯苗，一致性強(qiáng)，成苗容易，易于管理。擺脫了季節(jié)與氣候的限制因素，從而縮短了育苗周期，增加了繁殖量。解決了橡膠草個(gè)體間及種間容易雜交而難以保存優(yōu)良個(gè)體及遺傳品系的問(wèn)題，同時(shí)也為橡膠草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與育種提供技術(shù)支持。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為本發(fā)明的流程圖。
[0020]圖2為本發(fā)明為誘導(dǎo)培養(yǎng)基BA含量褐化率變化圖。
[0021]圖3為本發(fā)明為誘導(dǎo)培養(yǎng)基NAA含量褐化率變化圖。
[0022]圖4為本發(fā)明Na2S2O3^量褐化率變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述:
[0024]如圖1所示，本發(fā)明的目的是提供一種有效降低俄羅斯橡膠草組織培養(yǎng)褐化率與快速組培繁殖的方法，該方法操作簡(jiǎn)單、可有效降低褐化率，進(jìn)行快速組培繁殖，可快速生產(chǎn)大量性狀一致的優(yōu)質(zhì)種苗，解決種子難以保存優(yōu)良個(gè)體及遺傳品系的問(wèn)題，同時(shí)也為橡膠草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立奠定技術(shù)基礎(chǔ)。
[0025]本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)完成的。這種有效降低俄羅斯橡膠草組織培養(yǎng)褐化率與快速組培繁殖的方法，包括如下步驟:
[0026](I)培養(yǎng)基的配制:
[0027]A.誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+6-BAl.5 ?2.0mg/L+NAA0.1 ?0.2mg/L ；
[0028]B.分化培養(yǎng)基:MS+6-BA 0.5 ?1.0mg/L+NAA 0.05 ?0.lmg/L+GA30.1 ?0.2mg/L ；
[0029]C.增殖培養(yǎng)基:MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.lmg/L+Na2S203 15g/L ；
[0030]D.生根培養(yǎng)基:1/2MS+NAA 0.3mg/L ；
[0031]其中各階段培養(yǎng)基均添加蔗糖30g/L，瓊脂粉5g/L，pH值為5.8?6.0 ;
[0032](2)材料與接種:材料為引自俄羅斯的橡膠草品系的成熟種子，將消毒處理后的種子在無(wú)菌條件下接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在接種初期先在人工氣候箱中暗培養(yǎng)5d，再移至培養(yǎng)間中自然光下培養(yǎng)，可有效降低外植體誘導(dǎo)的褐化率至35%以下；
[0033](3)愈傷組織的誘導(dǎo)分化:將步驟(2)種子萌發(fā)后誘導(dǎo)愈傷組織形成后接種于分化培養(yǎng)基上，進(jìn)行不定芽的分化培養(yǎng)；
[0034](4)不定芽的增殖:將步驟(3)的不定芽接種于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，在增殖培養(yǎng)基中添加抗氧化劑Na2S2O3，有效防止了褐化，將褐化率降至10%以下，從而達(dá)到快速繁殖的目的；
[0035](5)生根培養(yǎng):將步驟⑷叢生芽分成單株后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。
[0036](6)煉苗移栽:將步驟(5)的生根苗在煉苗室開(kāi)蓋鍛煉3?5d后，移栽至細(xì)沙:蛭石:珍珠巖=I:1:1的基質(zhì)中，得到橡膠草再生植株。
[0037]在所述步驟(I)中，所述的培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的組分具體為:
[0038]A.誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+6-BAl.5 ?2.0mg/L+NAA0.1 ?0.2mg/L ；
[0039]B.分化培養(yǎng)基:MS+6-BA 0.5 ?1.0mg/L+NAA 0.05 ?0.lmg/L+GA30.1 ?0.2mg/L ；
[0040]C.增殖培養(yǎng)基:MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.lmg/L+Na2S203 15g/L ；
[0041]D.生根培養(yǎng)基:1/2MS+NAA 0.3mg/L ；
[0042]其中各階段培養(yǎng)基均添加蔗糖30g/L，瓊脂粉5g/L，pH值為5.8?6.0 ;
[0043]在所述步驟(2)中，選用橡膠草的成熟種子為外植體材料，先浸泡4h，用洗潔精溶液洗凈后，用流水沖2?4h，在超凈工作臺(tái)上，先用75% (體積百分比)酒精消毒10s，再用0.1 % (質(zhì)量百分比)HgCL2溶液消毒5min，最后用無(wú)菌水沖洗5?6次，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在接種初期先在人工氣候箱中暗培養(yǎng)5d，再移至培養(yǎng)間中自然光下培養(yǎng)，可有效降低外植體誘導(dǎo)的褐化率至35%以下。如圖2、3所示
[0044]在所述步驟(3)中，種子培養(yǎng)3?4周后陸續(xù)萌發(fā)，萌發(fā)后的幼苗在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2?3周后有愈傷組織形成，選取生長(zhǎng)狀態(tài)好的愈傷組織置于分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，4周后愈傷組織分化形成不定芽。
[0045]在所述步驟(4)中，不定芽接種于增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，在增殖培養(yǎng)基中添加抗氧化劑Na2S2O3，有效防止了褐化，將褐化率降至10%以下，3周后形成叢生芽。如圖4所示。
[0046]在所述步驟(5)中，叢生芽分成單株后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)2?3周后成為具有根系的壯苗。
[0047]在所述步驟￠)中，將生根苗在煉苗室開(kāi)蓋鍛煉3?5d后，移栽至細(xì)沙:蛭石:珍珠巖=I:1:1的基質(zhì)中，培養(yǎng)4?5周后得到橡膠草再生植株。
[0048]在所述步驟(2)中，所述的培養(yǎng)條件是，先在人工氣候箱中暗培養(yǎng)5d，培養(yǎng)溫度為23 士 2°C，再移至培養(yǎng)間中自然光下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25 士 2 °C，光照強(qiáng)度為1500?20001x，光照時(shí)間為16h/d。
[0049]在所述步驟(3)、(4)、(5)中，所述的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為25 士 2°C、光照強(qiáng)度為1500?20001x、光照時(shí)間為16h/do
[0050]在所述步驟￠)中，所述的培養(yǎng)條件是，培養(yǎng)溫度為24-26°C，前一周適當(dāng)遮光，使光照強(qiáng)度為自然光的60%，濕度控制在80%左右，以后逐漸降低濕度，恢復(fù)光照強(qiáng)度，直至將移栽苗置于自然條件下。
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