專利名稱：高效液相色譜測(cè)定橡膠樹中四種激素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效液相色譜測(cè)定橡膠樹中四種激素的方法，特別涉及一種利用高效液相色譜同時(shí)測(cè)定巴西橡膠樹葉片、枝條或樹皮中生長(zhǎng)素、玉米素、赤霉素和脫落酸四種激素的方法。
背景技術(shù)：
天然橡膠產(chǎn)業(yè)長(zhǎng)期以收集膠乳作為工業(yè)原料為主，以木材、種子等其它生物量開發(fā)利用為輔。橡膠樹葉片和樹皮中的內(nèi)源激素生長(zhǎng)素(IAA)，赤霉素(GA3),脫落酸(ABA)和玉米素(ZT)的含量、活性以及信號(hào)路徑調(diào)控膠乳產(chǎn)量和木材生長(zhǎng)發(fā)育。然而，橡膠樹上述四種內(nèi)源激素含量極低，性質(zhì)不穩(wěn)定，橡膠樹葉片和樹皮存在多種成分干擾，造成橡膠樹激素測(cè)定存在困難。傳統(tǒng)的測(cè)定橡膠樹內(nèi)源激素的方法如下:用80%甲醇采取新鮮的膠乳，低溫高速離心后用酶聯(lián)免疫技術(shù)測(cè)定生長(zhǎng)素(IAA),脫落酸(ABA)和細(xì)胞分裂素(iPAs)的含量(曹建華，林衛(wèi)夫.巴西橡膠樹膠乳中4種植物生長(zhǎng)物質(zhì)的測(cè)定.熱帶作物學(xué)報(bào).2004.25:1-4)。其中提取和分離純化的過(guò)程對(duì)激素保護(hù)不利，稍有操作不當(dāng)極易造成樣品中待測(cè)激素的浪費(fèi)，并且不能同時(shí)進(jìn)行多種植物內(nèi)源激素的測(cè)定。采用透吸法收集樣品，將取得的透析液在高效液相色譜儀上進(jìn)樣，分離并測(cè)定出其中的激素含量(姜波，李日紅，金華，姜國(guó)斌，國(guó)家發(fā)明專利CN101738441A)。其活體取樣雖具有基本不干擾生物體內(nèi)正常生命活動(dòng)，實(shí)現(xiàn)活體取樣的優(yōu)點(diǎn)，但是無(wú)法穿透老的枝條和樹皮組織中，不適用巴西橡膠樹這種高大喬木。ProElut PXC小柱含有混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換反向吸附劑，由PLS吸附劑鍵合磺酸基團(tuán)得到，兼具陽(yáng)離子交換和反相兩種保留模式，適用于其共軛酸的PKa值處于2-10之間的堿性化合物，主要為胺基化合物。主要用途是:食品安全檢測(cè)三聚氰胺分析；動(dòng)物樣品中堿性藥物殘留的分析，比如磺胺類藥物、鹽酸克倫特羅等藥物；蔬菜、水果以及果汁中堿性農(nóng)藥的分析，比如多菌靈、噻菌靈等殺菌劑；生物樣品:血液、尿液中堿性藥物的分析等等。高效液相色譜(HPLC)是測(cè)定植物激素的有效測(cè)定方法之一，并在熱帶水果作物荔枝、椰子中等樣品中成功的測(cè)定了多種植物激素。然而，在色譜分析過(guò)程中，僅用甲醇、乙腈兩種有機(jī)溶劑容易出現(xiàn)拖峰現(xiàn)象，洗脫效果不好，造成測(cè)定結(jié)果的誤差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效液相色譜測(cè)定橡膠樹中生長(zhǎng)素、玉米素、赤霉素和脫落酸四種激素的方法。一種高效液相色譜測(cè)定橡膠樹中生長(zhǎng)素、玉米素、赤霉素和脫落酸四種激素的方法，包括如下步驟:( I)樣品前處理:將待檢測(cè)的橡膠樹組織用液氮研磨后，置于抽提液中抽提，離心，從離心后的上清液中分離得到水相，將所述水相過(guò)層析柱，用甲醇洗脫，獲得待測(cè)樣品；所述抽提液的溶質(zhì)為2，6- 二叔丁基對(duì)甲苯酚，溶劑為體積百分含量為80%的甲醇水溶液；所述2，6-二叔丁基對(duì)甲苯酚在所述抽提液中的含量為每IOOmL所述抽提液中含有0.1g所述2，6-叔丁基對(duì)甲苯酚；(2)高效液相色譜檢測(cè):采用C18反相色譜柱，以甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖液的混合液為流動(dòng)相，以254nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，檢測(cè)步驟(I)獲得的待測(cè)樣品中的生長(zhǎng)素、玉米素、赤霉素和脫落酸。在上述方法中，所述流動(dòng)相中，所述甲醇、所述乙腈和所述磷酸鹽緩沖液的體積比為15:15:70 ;所述流動(dòng)相的pH為3.5。所述磷酸鹽緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:磷酸二氫鈉40g/L，pH3.5。具體配制方法如下:將40g磷酸二氫鈉溶于IOOOmL超純水中，用HCl調(diào)節(jié)pH值到3.5。步驟(I)中，所述層析柱為PXC反相保留陽(yáng)離子交換柱。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述PXC反相保留陽(yáng)離子交換柱具體為北京迪馬公司的產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為Cat.N0.:68203A。在上述方法中，步驟(I)所述的樣品前處理于黑暗條件下進(jìn)行，同時(shí)保持低溫(4°C)。所述黑暗為光照強(qiáng)度小于20 y mo I HT2s'在上述方法中，步驟(I)中，所述抽提液的用量具體可為每0.5g所述待測(cè)橡膠樹組織樣品(鮮重)加入15mL抽提液。在上述方法中，步驟(I)中，所述置于抽提液中抽提，抽提2次。在上述方法中，步驟(I)中，所述離心具體可為18000g離心lOmin。所述離心溫度可為4°C。在上述方法中，步驟(I)中，所述從離心后的上清液中分離得到水相是通過(guò)包括如下步驟的方法實(shí)現(xiàn)的:向所述上清液中加入相當(dāng)于所述上清液體積1/300的氨水后，過(guò)濾(0.22 y m針式過(guò)濾器過(guò)濾)后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空蒸發(fā)，去除有機(jī)相，得到所述水相。用0.lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)所述水相pH為3.0，用0.22 ii m針式過(guò)濾器過(guò)濾。在上述方法中，步驟(I)中，所述“將所述水相過(guò)層析柱，用甲醇洗脫”，具體包括如下步驟:(I)活化柱子:用甲醇(如IOmL)活化所述層析柱(PXC反相保留陽(yáng)離子交換柱)；(2)平衡柱子:用水(超純水，經(jīng)0.22 y m針式過(guò)濾器過(guò)濾，IOmL)平衡所述層析柱(PXC反相保留陽(yáng)離子交換柱)；(3)上樣:將所述水相(pH3.0，經(jīng)0.22 ii m針式過(guò)濾器過(guò)濾)加到步驟(2)中平衡后的所述層析柱(PXC反相保留陽(yáng)離子交換柱)；(4)淋洗:用0.lmol/L HCL (IOmL)淋洗所述層析柱(PXC反相保留陽(yáng)離子交換柱)；(5)洗脫:用甲醇(IOmL)洗脫。在上述方法中，步驟(2)所述的高效液相色譜檢測(cè)，柱溫為30°C。在上述方法中，步驟(2)所述的高效液相色譜檢測(cè)，洗脫方式為等度洗脫，流速為lmL/min,進(jìn)樣量為 10 u L。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)所述反相C18色譜柱具體為美國(guó)Waters公司生產(chǎn)的CNWSIL C18液相色譜柱4.6X 150mm5 u m。在上述方法中，所述橡膠樹組織具體可為橡膠樹的葉片、枝條或樹皮。在本發(fā)明中，所述橡膠樹具體為巴西橡膠樹。
所述方法既可用于定性檢測(cè)橡膠樹組織中的生長(zhǎng)素、玉米素、赤霉素和脫落酸四種激素，也可用于定量檢測(cè)橡膠樹組織中的生長(zhǎng)素、玉米素、赤霉素和脫落酸四種激素的含量。在本發(fā)明中，進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，HPLC檢測(cè)已知系列濃度的激素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以峰面積(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x，mg/L)進(jìn)行回歸計(jì)算，得該激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，再根據(jù)待測(cè)樣品中該激素的實(shí)測(cè)峰面積，計(jì)算該激素在待測(cè)樣品中的含量。本發(fā)明所提供的高效液相色譜測(cè)定橡膠樹中生長(zhǎng)素、玉米素、赤霉素和脫落酸四種激素的方法，可一次檢測(cè)出四種激素，提取流程時(shí)間短，測(cè)定準(zhǔn)確率和精確性高，提高測(cè)定和分析效率。本發(fā)明是研究巴西橡膠樹高產(chǎn)速生機(jī)制及植物激素在形成層分化過(guò)程中的良好方法。


圖1為四種激素混合標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖。其中，峰I為玉米素(ZT)，峰2為赤霉素(GA3),峰3為生長(zhǎng)素(IAA),峰4為脫落酸(ABA)。圖2為橡膠樹葉片中的四種激素檢測(cè)的高效液相色譜圖。其中，峰I為玉米素(ZT),峰2為赤霉素(GA3)，峰3為生長(zhǎng)素(IAA),峰4為脫落酸(ABA)。圖3為橡膠樹枝條中的四種激素檢測(cè)的高效液相色譜圖。其中，峰I為玉米素(ZT),峰2為赤霉素(GA3)，峰3為生長(zhǎng)素(IAA),峰4為脫落酸(ABA)。圖4為橡膠樹樹皮中的四種激素檢測(cè)的高效液相色譜圖。其中，峰I為玉米素(ZT)，峰2為生長(zhǎng)素(IAA)，峰3為脫落酸(ABA)。圖5為橡膠樹葉片中的四種激素檢測(cè)的高效液相色譜圖(樣品前處理方法I)。圖6為橡膠樹葉片中的四種激素檢測(cè)的高效液相色譜圖(樣品前處理方法2)。圖7為橡膠樹葉片中的四種激素檢測(cè)的高效液相色譜圖(樣品前處理方法3)。圖8為橡膠樹葉片中的四種激素檢測(cè)的高效液相色譜圖(樣品前處理方法4)。圖9為混合標(biāo)準(zhǔn)品中的四種激素檢測(cè)的高效液相色譜圖(流動(dòng)相I)。圖10為混合標(biāo)準(zhǔn)品中的四種激素檢測(cè)的高效液相色譜圖(流動(dòng)相2)。圖11為混合標(biāo)準(zhǔn)品中的四種激素檢測(cè)的高效液相色譜圖(流動(dòng)相3)。圖12為混合標(biāo)準(zhǔn)品中的四種激素檢測(cè)的高效液相色譜圖(流動(dòng)相4)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)無(wú)性系熱研7-33-97:是中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所品種，記載在“袁坤，周雪梅，李建輝等.死皮防治劑對(duì)死皮橡膠樹膠乳生理的影響.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011年17期”一文中，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所國(guó)家橡膠樹種植資源圃提供。生長(zhǎng)素(IAA)、玉米素(ZT)、赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)標(biāo)準(zhǔn)品:均購(gòu)自SigmaChemical Co (St Louis, MO, USA)，ZT (產(chǎn)品目錄號(hào):Z0876)、IAA (產(chǎn)品目錄號(hào):H8876)、GA3(產(chǎn)品目錄號(hào):48880), ABA (產(chǎn)品目錄號(hào):A1049)。
下述實(shí)施例中所涉及的各種溶液的配方如下:(I)磷酸鹽緩沖液:磷酸鹽緩沖液是將40g磷酸二氫鈉溶于IOOOmL超純水中，用HCl調(diào)節(jié)pH值到3.5。用于配制HPLC檢測(cè)流動(dòng)相。(2)抽提液:溶質(zhì)為2，6-二叔丁基對(duì)甲苯酚(購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)B1378)，溶劑為體積百分含量為80%的甲醇水溶液；所述2，6-二叔丁基對(duì)甲苯酚在所述抽提液中的含量為每IOOmL所述抽提液中含有0.1g所述2，6- 二叔丁基對(duì)甲苯酚。 下述實(shí)施例中涉及的HPLC檢測(cè)生長(zhǎng)素(IAA)、玉米素(ZT )、赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)四種激素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，均具體如下:色譜柱為美國(guó)Waters公司生產(chǎn)的CNWSIL C18液相色譜柱(4.6 X 150mm5 y m)，柱溫30°C;流動(dòng)相為甲醇、乙腈、磷酸鹽緩沖液(體積比為15: 15: 70，pH3.5)等度洗脫；流速為lmL/min ;進(jìn)樣量為10 y L ;檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。其中，生長(zhǎng)素、玉米素和脫落酸濃度范圍均為0.001,0.01,0.1,0.5、l、2、10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度，赤霉素濃度范圍為1.07,2.14、
5.35、10.7,21.4、107、214、856mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度。在上述條件下經(jīng)液相色譜儀檢測(cè)后，以生長(zhǎng)素(或玉米素、或赤霉素、或脫落酸)的峰面積(Y)對(duì)生長(zhǎng)素(或玉米素、或赤霉素、或脫落酸)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x，mg/L)進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程。四種激素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及其相關(guān)系數(shù)具體如表I所示。表I四種激素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及其相關(guān)系數(shù)
權(quán)利要求
1.一種高效液相色譜測(cè)定橡膠樹中生長(zhǎng)素、玉米素、赤霉素和脫落酸四種激素的方法，包括如下步驟: (1)樣品前處理:將待檢測(cè)的橡膠樹組織研磨后，置于抽提液中抽提，離心，從離心后的上清液中分離得到水相，將所述水相過(guò)層析柱，用甲醇洗脫，獲得待測(cè)樣品； 所述抽提液的溶質(zhì)為2，6- 二叔丁基對(duì)甲苯酚，溶劑為體積百分含量為80%的甲醇水溶液；所述2，6-二叔丁基對(duì)甲苯酚在所述抽提液中的含量為每IOOmL所述抽提液中含有0.1g所述2，6- 二叔丁基對(duì)甲苯酚； (2)高效液相色譜檢測(cè):采用C18反相色譜柱，以甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖液的混合液為流動(dòng)相，以254nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，檢測(cè)步驟(I)獲得的待測(cè)樣品中的生長(zhǎng)素、玉米素、赤霉素和脫落酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述流動(dòng)相中，所述甲醇、所述乙腈和所述磷酸鹽緩沖液的體積比為15:15:70 ;所述流動(dòng)相的pH為3.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述層析柱為PXC反相保留陽(yáng)離子交換柱。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步驟(I)所述的樣品前處理于黑暗條件下進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述抽提液的用量為每0.5克所述待測(cè)橡膠樹組織樣品加入15ml所述抽提液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述從離心后的上清液中分離得到水相是通過(guò)包括如下步驟的方法得到的:向所述上清液中加入體積為所述上清液體積1/300的氨水，收集水相，得到所述水相。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:步驟(2)所述的高效液相色譜檢測(cè)，柱溫為30°C。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:步驟(2)所述的高效液相色譜檢測(cè)，洗脫方式為等度洗脫，流速為lmL/min，進(jìn)樣量為10 yL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于:所述橡膠樹組織為橡膠樹的葉片、枝條或樹皮。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于:所述橡膠樹為巴西橡膠樹。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效液相色譜測(cè)定橡膠樹中四種激素的方法。本發(fā)明所提供的方法包括如下步驟(1)樣品前處理將橡膠樹組織用液氮研磨后，置于抽提液中抽提，離心，從離心后的上清液中分離得到水相，將所述水相過(guò)層析柱，用甲醇洗脫，獲得待測(cè)樣品；(2)高效液相色譜檢測(cè)采用反相C18色譜柱，以甲醇、乙腈和磷酸鹽緩沖液的混合液為流動(dòng)相，以254nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，檢測(cè)步驟(1)獲得的待測(cè)樣品中的生長(zhǎng)素、玉米素、赤霉素和脫落酸四種激素。本發(fā)明所提供的方法可一次檢測(cè)出四種激素，提取流程時(shí)間短，測(cè)定準(zhǔn)確率和精確性高，提高測(cè)定和分析效率。本發(fā)明是研究巴西橡膠樹高產(chǎn)速生機(jī)制及植物激素在形成層分化過(guò)程中的良好方法。
文檔編號(hào)G01N30/88GK103175932SQ20131004419
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者王立豐 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所