鳳果花葉病毒抗性番茄植物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及番茄植物(番茄(Solanum?lycopersicum?L.))，其包含賦予對鳳果花葉病毒(PepMV)的抗性的遺傳決定因子，其中抗性特征在于存在至少Q(mào)TL1，其位于在物理位置32,363,349bp和34,505,939bp之間，優(yōu)選位置33,558,627bp和34,505,939bp之間的連鎖群(LG)6，或其PepMV-抗性-賦予部分，和/或QTL2，其位于在物理位置60,667,821bp和62,460,220bp之間，優(yōu)選位置61,387,356bp和62,253,846bp之間的連鎖群(LG)7，或其PepMV-抗性-賦予部分，和/或QTL3，其位于在物理位置60,998,420bp和62,512,587bp之間，優(yōu)選位置61,494,664bp和62,385,023bp之間，更優(yōu)選位置61,723,339bp和62,385,023bp之間的連鎖群(LG)9，或其PepMV-抗性-賦予部分。本發(fā)明也涉及獲得所述遺傳決定因子的源，其代表性的種子以登錄號No.NCIMB41927，NCIMB41928，NCIMB42068和NCIMB42069保藏在NCIMB。本發(fā)明還涉及種子和植物后代及其果實及加工的果實。此外，本發(fā)明涉及與PepMV抗性賦予QTL連鎖的分子標志物和其用途。
【專利說明】鳳果花葉病毒抗性番茄植物
[0001] 本發(fā)明涉及番爺植物（番爺（Solanum lycopersicum L.))，其包含賦予對鳳果花 葉病毒（Pepino Mosaic Virus, PepMV)的抗性的遺傳決定因子。本發(fā)明還涉及標志物和標 志物用于鑒定導致PepMV抗性的遺傳決定因子的存在的用途。本發(fā)明也涉及該植物的種子 和后代及用于獲得該植物的繁殖材料。此外本發(fā)明涉及包含遺傳決定因子的植物，種子和 繁殖材料在育種程序中作為種質(zhì)的用途。
[0002] 商業(yè)植物生產(chǎn)，包括番茄生產(chǎn)，被許多條件影響。栽培者對特定變種的選擇是決定 因素，并形成可達到的結(jié)果的遺傳基礎(chǔ)。此外，有許多影響結(jié)果的外部因素。生長條件如氣 候，土壤，及輸入如肥料的使用起到主要作用。除此之外，害蟲和疾病的存在也影響可達到 的總產(chǎn)率。
[0003] 已在很早以前，在番茄栽培的早些年認識到番茄中的許多疾病。育種者已同時鑒 定了來自各種來源的多數(shù)這些疾病的抗性，并在它們的產(chǎn)品中合并了它們。這些的例是 對煙草花葉病毒（TMV)(可感染廣范圍的植物和其他作物）；Fusarium oxysporum f.sp. lycopersicum，及黃枝孢霉（Cladosporium fulvum)或〃番爺葉霉菌〃的抗性?，F(xiàn)今針對那 些疾病的抗性多少是全部商業(yè)番茄變種中的標準。無論何時新株或相關(guān)的疾病出現(xiàn)，對新 源的抗性的搜索從頭開始。疾病及存在的對可能相關(guān)的形式的抗性的知識輔助相對快速測 定新抗性源。但是，對于一些疾病且尤其對于害蟲，其是非常難或直到現(xiàn)在還不可能開發(fā)具 有高水平的抗性的物質(zhì)。尤其在抗性機理非常復(fù)雜并依賴于幾種彼此相互作用的基因時， 開發(fā)良好水平的抗性的挑戰(zhàn)可為真正地高。
[0004] 此外，有時完全新疾病呈現(xiàn)出不與任何已知道的疾病相關(guān)。對于這些，仍無指示什 么最可能是可發(fā)展抗性的種質(zhì)。也不知道抗性機理，這也使新抗性的發(fā)展更復(fù)雜。作為另 外的復(fù)雜因素，需要良好生物-測定以比較抗性植物與敏感的材料。當對新病原體知道很 少時，首先要確定其可感染番茄植物的方式。不與栽培者田地條件關(guān)聯(lián)的生物-測定可導 致矛盾的或不令人滿意的結(jié)果。在測試期間太弱或太強接種不會對為在實踐中開發(fā)抗性番 茄植物的工作產(chǎn)生有用的物質(zhì)。最后，最后測試是是否抗性在栽培者的條件下保持。
[0005] 在1999年，在歐洲，尤其在溫室商業(yè)番茄生產(chǎn)中出現(xiàn)新病毒。此病毒可通過整 個田地極其快速擴散，及相鄰栽培者容易受影響。病毒不久被鑒定為鳳果花葉病毒，屬于 Potex組，其特征在于高度感染性和持續(xù)性。
[0006] 鳳果花葉病毒（PepMV)在1974年首次在人參果或梨瓜（Solanum muricatum), 南-美作物，在來源于秘魯?shù)闹参锷翔b定。其在當時被確定為可感染番茄，及相關(guān)的野生物 種，但不顯示癥狀。
[0007] 尚未確定病毒如何可突然在歐洲番茄生產(chǎn)中出現(xiàn)，并隨后也出現(xiàn)在例如加拿大及 美國。幾種不同PepMV基因型被鑒定及區(qū)分，其中有：LP，來自秘魯?shù)脑N；EU，來自歐洲溫 室；來自智利的CH1和CH2 ;及US1和US2。
[0008] 相比從人參果作物獲取的分離物，存在于商業(yè)番茄作物的PepMV分離物在番茄中 具有更強毒力，提示病毒已遺傳上適應(yīng)了。通過在番茄作物中完成的且正在起作用的通常 活性，PepMV非常容易機械地擴散。因此，通常可隨后見到成行的感染的植物。工具，衣服， 等停留也能傳播病毒幾周，及P印MV可停留在干植物材料上久至3個月。一旦其感染了番 爺生產(chǎn)，就非常難以擺脫病毒。
[0009] P印MV癥狀是各種各樣的，且大大地依賴于感染期間的植物階段，植物變種，植物 活力和生長條件。有時癥狀難以可見，但主要癥狀表現(xiàn)包括具有'蕁麻頭淺灰色的，尖 的植物頂部_，矮小的頭，黃萎病葉或葉斑，及不均勻成熟，形成大理石樣斑紋及形成果實斑 點的植物。癥狀在秋季和冬季期間，在低光條件和更低溫度下最明顯。
[0010] 由于PepMV的番茄生產(chǎn)損失也可依賴于環(huán)境顯著地改變。在重度感染的作物中， 損失很可能達到至多20%。其他病原體，例如輪枝孢屬物種（Verticilium spp.)的存在也 可強烈影響產(chǎn)率減小。
[0011] 由于P印MV非常容易擴散，已在許多國家及由許多栽培者實施嚴格的衛(wèi)生學流 程。自從推定PepMV也可通過感染的種子傳播，用于種子生產(chǎn)和種子清潔的衛(wèi)生學流程也 是非常嚴格的。
[0012] 在歐洲，當其被進口或交易時番茄種子需無PepMV。EU成員被要求進行測量，以確 定番爺種子上不存在病毒。
[0013] 自從發(fā)現(xiàn)在病毒感染了商業(yè)生長之后非常難根除，現(xiàn)今許多栽培者依賴于'雜 交-保護'：用弱PepMV分離物接種作物，以預(yù)防由攻擊性的分離物導致的嚴重的癥狀。但 是，此系統(tǒng)帶來幾個風險。特定弱與特定攻擊性的分離物的組合，尤其當它們來源手不同基 因型時，可增強而非減少癥狀（]^11188611等人，？1311〖？31:11〇1〇8759，13?21(2010))。由于 無法預(yù)知在特定區(qū)或特定季節(jié)將出現(xiàn)哪種攻擊性的分離物，可能有害組合不可預(yù)防。此外， 甚至不是總是清楚哪種弱分離物被使用，因為鑒定較難。
[0014] 組合病毒基因型的另一風險是株之間遺傳重組的可能性，其可導致新的和 潛在地甚至更毀壞性的病毒分離物（Hanssen等人，European Journal of Plant Pathologyl21, 131-146 (2008) ；Hasiow-Jaroszewska et al. , Acta Biochimica Polonica57, 385-388 (2010))〇
[0015] 盡管在番茄中對P印MV的抗性源的找尋自始一直很密集，直到現(xiàn)在無可利用的抗 性番爺（Solanum lycopersicum)植物?？剐缘倪z傳改造，及用于篩選的生物-測定，如此 復(fù)雜，尚不知道對具有PepMV抗性的栽培的番爺材料的報道或提示。耐久抗性僅見于赭黃 爺（Solanum ochranthum)，其無法與栽培的番爺雜交。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0016] 本發(fā)明旨在提供番爺植物（番爺（Solanum lycopersicum L.))，其攜帶導致對鳳 果花葉病毒的抗性的遺傳決定因子。
[0017] 本發(fā)明旨在提供貢獻于番爺植物（番爺（Solanum lycopersicum))中鳳果花葉病 毒抗性的QTL。
[0018] 本發(fā)明的另一目的是提供可鑒定導致PepMV抗性的遺傳決定因子的標志物。
[0019] 本發(fā)明由此提供番爺植物（番爺（Solanum lycopersicum))，其包含賦予對鳳果 花葉病毒（PepMV)的抗性的遺傳決定因子，其中抗性特征在于至少存在：
[0020] · QTL1或其P印MV-抗性-賦予部分，其位于在物理位置32, 363, 349bp和 34, 505, 939bp之間，優(yōu)選位置33, 558, 627bp和34, 505, 939bp之間的連鎖群（LG) 6上，和/ 或
[0021] · QTL2或其P印MV-抗性-賦予部分，其位于在物理位置60, 667, 821bp和 62, 460, 220bp 之間，優(yōu)選位置 61，387, 356bp 和 62, 253, 846bp 之間的 LG7 上，和 / 或
[0022] · QTL3或其P印MV-抗性-賦予部分，其位于在物理位置60, 998, 420bp 和62, 512, 587bp之間，優(yōu)選位置61，494, 664bp和62, 385, 023bp之間，更優(yōu)選位置 61，723, 339bp 和 62, 385, 023bp 之間的 LG9 上。
[0023] 由多于一種QTL組成的復(fù)雜抗性機理的鑒定是艱難及復(fù)雜的過程。尚不知 道關(guān)于對此抗性的遺傳背景的指示。此外，也無從公共渠道可利用的可靠的用于番茄 (S. lycopersicum)的PepMV篩選方法。本發(fā)明的開發(fā)中另外的復(fù)雜因素因此是設(shè)計良好和 可靠的用于番茄（S. lycopersicum)的生物-測定（其會產(chǎn)生與栽培者的條件良好相關(guān)的 結(jié)果）的挑戰(zhàn)。
[0024] 導致本發(fā)明的研究此外還顯示，本發(fā)明的導致PepMV抗性的遺傳決定因子包含多 于一種QTL及那些QTL位于番爺（Solanum lycopersicum)基因組的分離的染色體上。此 是對于創(chuàng)建抗性植物而言另外的復(fù)雜因素。
[0025] 在一實施方式中PepMV抗性特征在于至少存在：
[0026] · QTL1或其P印MV-抗性-賦予部分及QTL2或其P印MV-抗性-賦予部分，或者
[0027] · QTL1或其P印MV-抗性-賦予部分及QTL3或其P印MV-抗性-賦予部分，或者
[0028] · QTL2或其P印MV-抗性-賦予-部分及QTL3或其P印MV-抗性-賦予部分。
[0029] 在一實施方式中，抗性特征在于存在QTL1或其P印MV-抗性-賦予部分，及QTL2 或其PepMV-抗性-賦予部分，及QTL3或其PepMV-抗性-賦予部分。
[0030] 2種或更多抗性-賦予QTL的組合導致對鳳果花葉病毒的更高水平的抗性。
[0031] 在一實施方式中，本發(fā)明涉及番爺（Solanum lycopersicum)植物，其攜帶包含 QTL1，QTL2和QTL3中的一種或更多的遺傳決定因子，該遺傳決定因子賦予對鳳果花葉病 毒的抗性，且該QTL如包含在番茄植物中，其代表性的種子以下列保藏號保藏在NCMB : NCMB41927, NCMB41928, NCMB42068 和 NCMB42069。
[0032] 在一實施方式中，所述決定因子由從在NCMB以登錄號No. NCMB41927保藏的種 子生長的植物，和/或由從在NCMB以登錄號No. NCMB41928保藏的種子生長的植物，和/ 或由從在NCMB以登錄號No. NCMB42068保藏的種子生長的植物，和/或由從在NCMB以 登錄號No. NCMB42069保藏的種子生長的植物漸滲雜交。
[0033] 在本發(fā)明的特定方面，漸滲雜交進番爺（Solanum lycopersicum)植物的QTL1，2 和3中的一種或更多組成了其抗性賦予部分。
[0034] 本文所用的"漸滲雜交"旨在表示利用雜交及在性狀變得可見的第1代選擇來將 遺傳決定因子導入不攜帶遺傳決定因子的植物。對于顯性性狀，選擇可起始于具有性狀的 植物和無性狀的植物之間的雜交的F1。對于隱性性狀，此適宜于F2。替代性地及對于多基 因性狀，優(yōu)選地，在與QTL連鎖的分子標志物的輔助下進行選擇。標志物輔助的選擇可在包 含攜帶任意數(shù)的期望的QTL的植物的任何代或群中進行。
[0035] 保藏號NCMB41927或其后代種子，或保藏號NCMB42068或其后代種子，可適宜 地用作將QTL1 (其位于LG6上），和/或QTL2 (其位于LG7上）漸滲雜交至番茄（Solanum lycopersicum)植物的源。在 NCMB41927 和 NCMB42068 中，QTL1 連鎖于 SEQ ID N0:1，及 SEQ ID N0:4,及SEQ ID N0:5;QTL2連鎖于SEQ ID N0:2,及SEQ ID N0:6,及SEQ ID N0:7。 保藏號NCMB41928或其后代種子可用作漸滲雜交QTL2 (其位于LG7上），和/或QTL3 (其 位于 LG9 上）的源。在 NCMB41928 中，QTL2 連鎖于 SEQ ID N0:2,及 SEQ ID N0:6,及 SEQ ID NO:7 ;QTL3 連鎖于 SEQ ID NO:3,及 SEQ ID NO:8,及 SEQ ID NO:9。
[0036] 保藏號NCMB42069或其后代種子可用作漸滲雜交QTL1 (其位于LG6上）和/或 QTL2 (其位于LG7上）和/或QTL3 (其位于LG9上）的源。在NCMB42069中，QTL1連鎖于 SEQ ID N0:1，及SEQ ID N0:4,及SEQ ID N0:5;QTL2連鎖于SEQ ID N0:2,及SEQ ID N0:6， 及 SEQ ID NO:7 ;QTL3 連鎖于 SEQ ID NO:3,及 SEQ ID NO:8,及 SEQ ID NO:9。
[0037] SEQ ID編號定義于表2。
[0038] 在一實施方式中，在番茄中賦予對鳳果花葉病毒的抗性的一種或更多本發(fā)明的 QTL以純合形式存在。關(guān)于本發(fā)明的性狀，攜帶抗性性狀的植物可如下在從不攜帶性狀的植 物和攜帶所述的性狀的植物之間的雜交后代之中適宜地鑒定：從作為初始雜交的結(jié)果的種 子和自交步驟生長F2植物，及選擇顯示期望的性狀的植物。選擇植物可通過生物-測定在 表型上進行，或可通過鑒定一種或更多貢獻于性狀的本發(fā)明的QTL或其抗性-賦予部分，由 標志物輔助的選擇進行。
[0039] 1種或2種或全部3種本發(fā)明的QTL以隱性方式賦予抗性。對應(yīng)表型性狀（對 PepMV的抗性），因而也以隱性方式遺傳。當全部3種QTL以隱性方式賦予抗性時，需生長 大群的F2植物，以選擇具有表型性狀，和/或攜帶全部3種本發(fā)明的QTL的植物。或者，可 起始選擇更低水平的抗性和/或1種或2種本發(fā)明的QTL。賦予抗性的分離的遺傳決定因 子也可以中間方式，或以顯性方式遺傳。當涉及中間或顯性遺傳時，對表型性狀的選擇更容 易?？沙霈F(xiàn)用以獲得最高水平的抗性的隱性和/或中間和/或顯性QTL的組合。
[0040] 選擇可就表型，或就所述本發(fā)明的抗性-賦予QTL的存在進行。選擇也可通過使 用一種或更多分子標志物進行。分子標志物的使用需要更小篩選用群，及可在非常早期階 段進行。
[0041] 在一實施方式中，本發(fā)明的番茄植物包含：
[0042] · QTL1或其抗性賦予部分，其在保藏NCMB41927和/或NCMB42068和/或 NCMB42069中連鎖到由下列表征的分子標志物：SEQ ID N0:1，SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5(表2)，和/或
[0043] · QTL2或其抗性賦予部分，其在保藏NCMB41927和/或NCMB41928和/或 NCMB42068和/或NCMB42069中連鎖到由下列表征的分子標志物：SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:6 和 SEQ ID N0:7(表 2)，和 / 或
[0044] · QTL3或其抗性賦予部分，其在保藏NCMB41928和/或NCMB42069中連鎖到由 下列表征的分子標志物：SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:8和SEQ ID N0:9(表2)。
[0045] 在一實施方式中，本發(fā)明的番爺植物包含QTL1，其優(yōu)選關(guān)聯(lián)于由下列表征的分子 標志物：SEQ ID N0:1，和/或SEQ ID N0:4,和/或SEQ ID N0:5;及QTL2,其優(yōu)選關(guān)聯(lián)于由 下列表征的分子標志物：SEQ ID N0:2,和/或SEQ ID N0:6,和/或SEQ ID N0:7;及QTL3， 其優(yōu)選關(guān)聯(lián)于由下列表征的分子標志物：SEQ ID N0:3,和/或SEQ ID N0:8,和/或SEQ ID N0:9。本發(fā)明的該植物的代表性的種子保藏為NCMB42069。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，QTL1位于番茄基因組的第6染色體的物理位置32, 363, 349bp和 34, 505, 939bp之間，且可由分子SNP標志物的存在鑒定。此SNP標志物位于番茄（Solanum lycopersicum)基因組版本SL2. 40的公共物理圖譜的34, 456, 931bp，及特征在于SEQ ID NO: 1 (表2)。其他分子SNP標志物，其可用于給QTL1區(qū)分界，特征在于在33, 558, 627bp的 SEQIDN0:4和在34,505,939bp的SEQIDN0:5(表2)。在保藏NC頂B41927和NC頂B42068 和NCMB42069的植物中，這些SNP標志物指示及連鎖到QTL1，因此也指示那些保藏的植物 中對PepMV的抗性。
[0047] 貢獻于P印MV抗性的第2QTL(QTL2)，定位于第7染色體物理位置60, 667, 821bp和 62, 460, 220bp之間。QTL2可由位于番爺（Solanum lycopersicum)基因組版本SL2. 40的公 共圖譜上物理位置61，550, 890bp的SNP標志物的存在鑒定，及特征在于SEQ ID N0:2(表 2)。其他分子SNP標志物，其可用于給QTL2區(qū)分界，特征在于在61，387, 356bp的SEQ ID N0:6和在 62,253,846bp的SEQIDN0:7(表2)。在保藏NC頂B41927 和NCIMB41928 和 NCMB42068和NCMB42069的植物中，這些SNP標志物指示及連鎖到QTL2,因此也指示那些 保藏的植物中對PepMV的抗性。
[0048] 導致P印MV抗性的第3QTL (QTL3)，位于第9染色體物理位置60, 998, 420bp和 62, 512, 587bp之間。此QTL的存在可由位于番爺（Solanum lycopersicum)基因組版本 SL2. 40的公共物理圖譜上的61，603, 006bp的SNP標志物檢測，該SNP標志物特征在于SEQ ID N0:3 (表2)。其他分子SNP標志物，其可用于鑒定QTL3區(qū)，特征在于在61，872, 648bp的 SEQIDN0:8和在62，191，735bp的SEQIDN0:9(表2)。在保藏NC頂B41928和NC頂B42069 的植物中，這些SNP標志物指示及連鎖到QTL3,因此也指示那些保藏的植物中對P印MV的抗 性。
[0049] 在一實施方式中，包含賦予對鳳果花葉病毒（PepMV)的抗性的遺傳決定因子的番 茄植物，可通過鑒定QTL1或其P印MV-抗性-賦予部分，和/或QTL2或其P印MV-抗性-賦 予部分，和/或QTL3或其P印MV-抗性-賦予部分的存在獲得，其中QTL1?3定義為 ：
[0050] · QTL1，其位于在物理位置32, 363, 349bp和34, 505, 939bp之間，優(yōu)選位置 33, 558, 627bp 和 34, 505, 939bp 之間的連鎖群（LG)6 上；
[0051] · QTL2,其位于物理位置60, 667, 821bp和62, 460, 220bp之間，優(yōu)選位置 61，387, 356bp 和 62, 253, 846bp 之間的 LG7 上；
[0052] · QTL3,其位于物理位置60, 998, 420bp和62, 512, 587bp之間，優(yōu)選位置 61，494, 664bp 和 62, 385, 023bp 之間，更優(yōu)選位置 61，723, 339bp 和 62, 385, 023bp 之間的 LG9 上。
[0053] 在一實施方式中，本發(fā)明涉及番茄植物，其可由包括下列步驟的方法獲得：
[0054] (a)使包含QTL1和QTL2的植物（其代表性的種子保藏為NCMB41927或 NCMB42068)，或包含QTL2和QTL3的植物（其代表性的種子保藏為NCMB41928)與不包含 這些遺傳決定因子的植物雜交，以獲得F1群；
[0055] (b)任選地實施一輪或更多輪的自交和/或使來自F1的植物雜交，以獲得再一代 群；
[0056] (c)自群選擇包含QTL1和/或QTL2的植物，或包含QTL2和/或QTL3的植物；
[0057] (d)使包含QTL1和/或QTL2的選擇的植物與包含QTL2和QTL3的植物（其代表 性的種子保藏為NCMB41928)雜交，或使包含QTL2和/或QTL3的選擇的植物與包含QTL1 和QTL2的植物（其代表性的種子保藏為NCMB41927或NCMB42068)雜交；
[0058] (e)使步驟（d)中獲得的植物自交，以獲得分離的群；
[0059] (f)選擇包含 QTL1 和 QTL2,或 QTL2 和 QTL3,或 QTL1 和 QTL3,或 QTL1 和 QTL2 和 QTL3的植物。
[0060] QTL1和/或QTL2可首先漸滲雜交，或QTL2和/或QTL3首先漸滲雜交至缺少任一 種QTL的番茄（Solanum lycopersicum)植物，之后導入QTL2和/或QTL3,或QTL1和/或 QTL2。隨后就鳳果花葉病毒抗性中涉及的1種或2種或3種所述的QTL進行選擇。
[0061] 在進一步實施方式中，本發(fā)明涉及攜帶導致針對鳳果花葉病毒的抗性的遺傳決定 因子的番茄植物，其可由包括下列步驟的方法獲得：
[0062] (a)使包含QTL1和QTL2的植物（其代表性的種子保藏為NCMB41927或 NCMB42068)，或包含QTL2和QTL3的植物（其代表性的種子保藏為NCMB41928)，或包含 QTL1和QTL2和QTL3的植物（其代表性的種子保藏為NCMB42069)與不包含這些遺傳決定 因子的植物雜交，以獲得F1群；
[0063] (b)實施一輪或更多輪的自交和/或使來自F1的植物雜交，以獲得再一代群；
[0064] (c)任選地自包含QTL1，2和3中的1種或2種的群選擇植物，之后與包含至少 QTL1，2和3中的另一種QTL的植物雜交，并隨后重復(fù)步驟（b);
[0065] (d)選擇包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
[0066] 在進一步實施方式中，本發(fā)明的番茄植物可通過使包含QTL1和/或QTL2和/或 QTL3的第1親本植物與包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的第2親本植物雜交及在隨后 代中選擇任選地在進一步自交和/或雜交步驟之后包含QTL1和QTL2,或QTL1和QTL3,或 QTL2和QTL3,或QTL1和QTL2和QTL3的植物而獲得。
[0067] 在進一步實施方式中，使從保藏為NCMB41927的種子生長的植物或從保藏為 NCMB42068的種子生長的植物與從保藏為NCMB41928的種子生長的植物雜交，使得到的 F1自交，并隨后實施就包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的植物的選擇。在優(yōu)選的方面， 就優(yōu)選純合地包含全部3種QTL的植物進行選擇，該植物對鳳果花葉病毒是高度抗性或免 疫的。
[0068] 在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及番茄植物，其可由包括下列步驟的方法獲得：
[0069] (a)使包含QTL1和QTL2和QTL3的植物（其代表性的種子保藏為NCMB42069)與 不包含所述的QTL的植物雜交，以獲得F1群；
[0070] (b)實施一輪或更多輪的自交和/或使來自F1的植物雜交，以獲得再一代群；
[0071] (c)任選地自包含QTL1，2和3中的1種或2種的群選擇植物，之后與包含QTL1，2 和3中的至少另一種QTL的植物雜交，并隨后重復(fù)步驟（b);
[0072] (d)選擇包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
[0073] 獲得包括任意數(shù)的QTL1，2和/或3,優(yōu)選QTL1和QTL2和QTL3,更優(yōu)選純合地全部 QTL1和QTL2和QTL3的本發(fā)明的番爺（Solanum lycopersicum)植物的方法，可以本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的各種方式實施。用于獲得所述植物的源適宜地是包含QTL1或QTL2或QTL3的 植物，包含QTL1和QTL2或QTL2和QTL3或QTL1和QTL3的植物，或包含QTL1和QTL2和QTL3 的植物。包含QTL1和QTL2的適合的源的代表性的種子以保藏號NCMB41927或NCMB42068 保藏在NCMB，及包含QTL2和QTL3的適合的源的代表性的種子保藏為NCMB41928。
[0074] 包含QTL1和QTL2和QTL3的適合的源的代表性的種子以保藏號NCMB42069保藏 在 NCMB。
[0075] 需知，提供本發(fā)明的一種或更多遺傳決定因子的親本未必是從保藏的種子直接生 長的植物。親本也可為自該種子的后代植物，或由其他手段自鑒定為具有包含1種或2種 或3種本發(fā)明的QTL的遺傳決定因子的種子的后代植物。
[0076] 對鳳果花葉病毒的抗性是通過天然的感染或人工感染（諸如接種）的由鳳果花葉 病毒感染的導致的癥狀的減小或缺失。癥狀的減小或缺失是相比不攜帶本發(fā)明的遺傳決定 因子或一種或更多QTL的番爺（Solanum lycopersicum)植物減小或缺失，如根據(jù)例如實施 例2測試的。
[0077] 在本發(fā)明的優(yōu)選的方面，QTL1的純合存在和QTL2的純合存在和QTL3的純合存在 導致最高水平的抗性或免疫。最高水平的抗性或免疫以隱性方式遺傳。
[0078] 本發(fā)明的抗性優(yōu)選是免疫。免疫被定義為在接種或感染之后病毒粒子不，或不顯 著地，在植物中蓄積的抗性系統(tǒng)。免疫可通過對病毒粒子的ELISA測定測量，該測定為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知。免疫在ELISA測定中給出低或負分值。低或負分值指示與非-病毒-感 染的植物相當?shù)牟《镜味?。免疫由至少Q(mào)TL1和QTL2和QTL3以純合形式存在適宜地賦予。
[0079] 此外本發(fā)明涉及要求保護的番茄植物的細胞。該細胞可為分離的形式或可為完全 番茄植物或其部分的部分，仍構(gòu)成本發(fā)明的細胞，因為該細胞在其遺傳構(gòu)成中攜帶導致定 義本發(fā)明的番茄植物的抗性特征的遺傳信息。本發(fā)明的番茄植物的各細胞攜帶導致所述性 狀的表型表達的遺傳信息。本發(fā)明的該細胞也可為可用于再生本發(fā)明的新番茄植物的可再 生的細胞。
[0080] 本發(fā)明也涉及要求保護的植物的組織。組織包含在它們的遺傳構(gòu)成中攜帶導致定 義本發(fā)明的番茄植物的抗性特征的遺傳信息的細胞。組織可為未分化的組織或已分化的組 織。未分化的組織是例如莖端，花藥，花瓣，花粉和可用于微繁殖以獲得生長為本發(fā)明的新 植物的新小植株。組織也可生長自本發(fā)明的細胞。
[0081] 本發(fā)明根據(jù)其再一方面涉及要求保護的植物的種子。盡管種子不顯示本發(fā)明的番 茄植物的遺傳性狀，它們包含導致當植物自種子生長時，使此植物為本發(fā)明的植物的抗性 特征的遺傳信息。
[0082] 本發(fā)明也涉及本發(fā)明的植物后代，細胞，組織和種子。該后代可本身是植物，細胞， 組織或種子。
[0083] 如本文所用詞匯〃后代〃旨在表示來自與包含導致PepMV抗性的遺傳決定因子的 本發(fā)明的植物雜交的第1個和全部進一步后代。本發(fā)明的后代是任何與攜帶導致PepMV抗 性的性狀的本發(fā)明的植物雜交的后代。在一實施方式中，本發(fā)明的后代植物攜帶構(gòu)成導致 對鳳果花葉病毒（P印MV)的抗性的本發(fā)明的遺傳決定因子的QTL1，QTL2和QTL3中的一種 或更多。優(yōu)選地，后代包含QTL1，QTL2和QTL3的2種或更多，更優(yōu)選本文定義的QTL1，QTL2 和QTL3的全部3種。
[0084] 后代植物優(yōu)選顯示至少一些水平的對鳳果花葉病毒的抗性，尤其是高水平的抗性 和更尤其是針對鳳果花葉病毒的免疫。
[0085] 〃后代〃也包括攜帶導致本發(fā)明的PepMV抗性性狀的遺傳決定因子且從其他植物 或本發(fā)明的植物的后代由植物性繁殖或增殖得到的植物。
[0086] 本發(fā)明由此還涉及要求保護的植物的種子及適宜于有性繁殖的植物部分。該部分 例如選擇自：小孢子，花粉，子房，胚珠，胚囊和卵細胞。此外，本發(fā)明涉及適宜于營養(yǎng)繁殖的 植物部分，尤其是插枝，根，莖，細胞和原生質(zhì)體。
[0087] 根據(jù)其再一方面，本發(fā)明提供要求保護的植物的組織培養(yǎng)物。組織培養(yǎng)物包含可 再生的細胞。該組織培養(yǎng)物可源于葉，花粉，胚胎，子葉，下胚軸，分生組織細胞，根，根端，花 藥，花，種子和莖。組織培養(yǎng)物可再生為攜帶本發(fā)明的遺傳決定因子的植物。適宜地，再生 的植物表達鳳果花葉病毒抗性的表型。
[0088] 本發(fā)明此外涉及雜交體種子及涉及產(chǎn)生雜交體種子的方法，所述方法包括使第1 親本植物與第2親本植物雜交，及收獲得到的雜交體種子，其中所述第1親本植物和/或所 述第2親本植物是要求保護的植物。
[0089] 本發(fā)明也涉及攜帶本發(fā)明的PepMV抗性性狀的近交及加倍的單倍體。
[0090] 在一實施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的番茄植物，其由常規(guī)繁殖，或遺傳修飾，尤 其是由順式發(fā)生或反式發(fā)生攜帶導致PepMV抗性的本發(fā)明的遺傳決定因子，及通過自適合 的源導入負責性狀的遺傳信息而獲取了所述決定因子。順式發(fā)生是植物用來自作物植物本 身或來自性相容的供體植物的編碼（農(nóng)業(yè)）性狀的天然的基因來進行遺傳修飾。反式發(fā)生 是植物用來自非-可雜交的物種的基因或合成基因的遺傳修飾。
[0091] 在一實施方式中，獲取本發(fā)明的遺傳決定因子的來源由自下列生長的植物形成： 種子，其中代表性的樣品以登錄號No. NCMB41927保藏，或以登錄號No. NCMB41928保藏， 或以登錄號No. 42068保藏，或以登錄號No. NCMB42069保藏，或保藏的種子，或其有性后代 或營養(yǎng)性后代，或包含遺傳決定因子的另一源，或這些源的組合。
[0092] 在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及非-轉(zhuǎn)基因番爺（Solanum lycopersicum)植 物。為獲得抵抗鳳果花葉病毒的本發(fā)明的植物，用于獲取本發(fā)明的一種或更多QTL1，QTL2 或QTL3的源適宜地是攜帶QTL1和/或2和/或3 (如包含在NCMB41927和/或NCMB41928 和 / 或 NCMB42068 和 / 或 NCMB42069 中的）的番茄（Solanum lycopersicum)植物，或 替代性地攜帶一種或更多所述的QTL且可與番爺（Solanum lycopersicum)雜交的爺屬 (Solanum)物種的植物。任選地，在與相關(guān)的物種雜交之后，可實施技術(shù)諸如胚胎拯救，回交 或本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其他技術(shù)，以獲得種間雜交的種子，該種子可用作用于顯示對鳳 果花葉病毒的抗性的非-轉(zhuǎn)基因番爺（Solanum lycopersicum)植物的進一步發(fā)育的源。
[0093] 本發(fā)明也涉及本發(fā)明的植物的種質(zhì)。種質(zhì)由生物的全部遺傳的特征構(gòu)成，及根據(jù) 本發(fā)明包括至少本發(fā)明的性狀。種質(zhì)可用于開發(fā)PepMV抗性番茄植物的育種程序。
[0094] 本發(fā)明也涉及由本發(fā)明的植物產(chǎn)生的番茄果實。本發(fā)明還涉及食品，包含要求保 護的番茄植物的果實，或其部分。本發(fā)明也涉及經(jīng)處理形式的食品。
[0095] 在一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含對鳳果花葉病毒的抗性的番茄植物的方法，包 括：
[0096] (a)使包含QTL1和QTL2的植物（其代表性的種子保藏為NCMB41927和 NCMB42068)，或包含QTL2和QTL3的植物（其代表性的種子保藏為NCMB41928)與不包含 遺傳決定因子的植物雜交，以獲得F1群；
[0097] (b)任選地實施一輪或更多輪的自交及或使來自F1的植物雜交，以獲得再一代 群；
[0098] (c)自該群選擇包含QTL1和/或QTL2的植物，或包含QTL2和/或QTL3的植物；
[0099] (d)使包含QTL1和/或QTL2的選擇的植物與包含QTL2和QTL3的植物（其代表 性的種子保藏為NCMB41928)雜交，或使包含QTL2和/或QTL3的選擇的植物（其代表性 的種子保藏為NCMB41927和NCMB42068)與包含QTL1和QTL2的植物雜交；
[0100] (e)自交步驟（d)中獲得的植物，以獲得分離的群；
[0101] (f)選擇包含 QTL1 和 QTL2,或 QTL2 和 QTL3,或 QTL1 和 QTL3,或 QTL1 和 QTL2 和 QTL3的植物。
[0102] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生包含對鳳果花葉病毒的抗性的番茄植物的方法，包括：
[0103] (a)使包含QTL1和QTL2的植物（其代表性的種子保藏為NCMB41927或 NCMB42068)，或包含QTL2和QTL3的植物（其代表性的種子保藏為NCMB41928)，或包含 QTL1和QTL2和QTL3的植物（其代表性的種子保藏為NCMB42069)，與不包含遺傳決定因 子的植物雜交，以獲得F1群；
[0104] (b)實施一輪或更多輪的自交和/或使來自F1的植物雜交，以獲得再一代群；
[0105] (c)任選地自包含QTL1，2和3中的1種或2種的群選擇植物，之后與包含QTL1，2 和3中的至少另一種QTL的植物雜交，并隨后重復(fù)步驟（b);
[0106] (d)選擇包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
[0107] 在一方面本發(fā)明中涉及通過如下步驟產(chǎn)生包含對鳳果花葉病毒的抗性的番茄植 物的方法：使包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的第1親本植物與包含QTL1和/或QTL2 和/或QTL3的第2親本植物雜交及在隨后代中選擇（任選地在進一步自交和/或雜交步 驟之后）包含QTL1和QTL2,或QTL1和QTL3,或QTL2和QTL3,或QTL1和QTL2和QTL3的植 物。
[0108] 在優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生番茄植物的方法，包括：
[0109] (a)使包含QTL1和QTL2和QTL3的植物（其代表性的種子保藏為NCMB42069)與 不包含所述的QTL的植物雜交，以獲得F1群；
[0110] (b)實施一輪或更多輪的自交和/或使來自F1的植物雜交，以獲得再一代群；
[0111] (c)任選地自包含QTL1，2和3中的1種或2種的群選擇植物，之后與包含QTL1，2 和3中的至少另一種QTL的植物雜交，并隨后重復(fù)步驟（b);
[0112] (d)選擇包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
[0113] 本發(fā)明另外地提供向包含對鳳果花葉病毒的抗性的番茄植物導入期望的性狀的 方法，包括：
[0114] (a)使包含對鳳果花葉病毒的抗性的番茄植物（其代表性的種子以保藏號 NCMB41927和NCMB41928和NCMB42068和NCMB42069保藏在NCMB)與包含期望的性狀 的第2番茄植物雜交，以產(chǎn)生F1后代；
[0115] (b)選擇包含對鳳果花葉病毒的抗性和期望的性狀的F1后代；
[0116] (c)使選擇的F1后代與親本之一雜交，以產(chǎn)生回交后代；
[0117] (d)選擇包含期望的性狀和對鳳果花葉病毒的抗性的回交后代；以及
[0118] (e)任選地連續(xù)重復(fù)步驟（c)和（d) -次或更多次，以產(chǎn)生包含期望的性狀和對鳳 果花葉病毒的抗性的選擇的第4或更后回交后代。本發(fā)明包括由此方法產(chǎn)生的番茄植物和 由其獲得的番茄果實。
[0119] 包含本發(fā)明的遺傳決定因子的植物的選擇可替代性地在所述方法的任何雜交或 自交步驟后進行。
[0120] 在一實施方式中，包含遺傳決定因子的植物是近交系，雜交體，加倍的單倍體，或 分離的群的植物。
[0121] 本發(fā)明還提供產(chǎn)生包含對鳳果花葉病毒的抗性的番茄植物的方法，其通過使用加 倍的單倍體產(chǎn)生技術(shù)產(chǎn)生包含所述的導致對鳳果花葉病毒的抗性的遺傳決定因子的加倍 的單倍體系。
[0122] 本發(fā)明此外涉及雜交體種子及產(chǎn)生雜交體種子的方法，所述方法包括使第1親本 植物與第2親本植物雜交，及收獲得到的雜交體種子，其中所述第1親本植物和/或所述第 2親本植物是要求保護的植物。
[0123] 在一實施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生雜交體番茄植物的方法，包括使第1親本番茄 植物與第2親本番茄植物雜交，及收獲得到的雜交體番茄種子，其中第1親本番茄植物和/ 或第2親本番茄植物包含本發(fā)明的導致對鳳果花葉病毒的抗性的遺傳決定因子，尤其是本 文所述的遺傳決定因子。
[0124] 本發(fā)明也涉及產(chǎn)生包含對鳳果花葉病毒的抗性的番茄植物的方法，其通過使用在 其基因組中包含導致對鳳果花葉病毒的抗性的遺傳決定因子的種子用于生長所述的番茄 植物。種子適宜地是這樣的種子，其代表性的樣品以保藏號NCMB41927或NCMB41928或 NCMB42068 或 NCMB42069 保藏在 NCIMB。
[0125] 本發(fā)明也涉及種子生產(chǎn)的方法，包括使包含對鳳果花葉病毒的抗性的番茄植物生 長，允許植物產(chǎn)生種子，及收獲那些種子。種子的產(chǎn)生適宜地通過雜交或自交進行。
[0126] 在一實施方式中，本發(fā)明涉及通過使用組織培養(yǎng)產(chǎn)生包含對鳳果花葉病毒的抗性 的番茄植物的方法。本發(fā)明此外涉及通過使用營養(yǎng)繁殖產(chǎn)生包含對鳳果花葉病毒的抗性的 番茄植物的方法。
[0127] 在一實施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含對鳳果花葉病毒的抗性的番茄植物的方 法，其通過使用遺傳修飾方法向番茄植物導入導致對鳳果花葉病毒的抗性的本發(fā)明的遺傳 決定因子。遺傳修飾包含轉(zhuǎn)基因修飾或反式發(fā)生（其使用來自非-可雜交的物種或合成基 因的基因），及順式修飾或順式發(fā)生（其使用來自作物植物本身或來自性相容的供體植物 的編碼（農(nóng)業(yè)）性狀的天然的基因）。
[0128] 本發(fā)明也涉及開發(fā)包含對鳳果花葉病毒的抗性的番茄植物的繁殖方法，其中使用 包含導致對鳳果花葉病毒的抗性的遺傳決定因子的種質(zhì)。所述包含遺傳決定因子的植物的 代表性的種子以保藏號NCMB41927和NCMB41928和NCMB42068和NCMB42069保藏在 NCMB。
[0129] 在進一步實施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含對鳳果花葉病毒的抗性的番茄植物的 方法，其中將包含賦予所述對鳳果花葉病毒的抗性的本發(fā)明的遺傳決定因子的植物的后代 或繁殖材料用作將對鳳果花葉病毒的抗性漸滲雜交至另一番茄植物的源。所述包含遺傳 決定因子的植物的代表性的種子以保藏號NCMB41927和NCMB41928和NCMB42068和 NCMB42069 保藏在 NCMB。
[0130] 本發(fā)明優(yōu)選提供顯示對鳳果花葉病毒的抗性的番茄植物，該植物可由本文描述的 任何方法獲得。
[0131] 本發(fā)明也涉及產(chǎn)生番茄果實的方法，包括使本文所述的PepMV抗性番茄植物生 長，及允許它們產(chǎn)生番茄果實和任選地收獲果實。
[0132] 本文所用的術(shù)語'遺傳決定因子'包括一種或更多QTL，或本文所述的基因或等位 基因。這些術(shù)語互換使用。
[0133] 在一方面，本發(fā)明涉及存在于番爺（Solanum lycopersicum)基因組中的分子SNP 標志物，該分子SNP標志物在番爺（Solanum lycopersicum)中與賦予對鳳果花葉病毒的抗 性的QTL遺傳連鎖，及該分子SNP標志物特征在于是SEQ ID N0:1?9之任一個。SEQ ID N0:1?9定義于表2。
[0134] 在再一方面，本發(fā)明涉及由定義于表2的SEQ ID N0:1?9之任一個表征的分子 標志物用于在番爺（Solanum lycopersicum)植物中鑒定鳳果花葉病毒抗性賦予QTL的用 途。
[0135] 遺傳決定因子或QTL可通過使用分子標志物鑒定。遺傳決定因子或QTL可替代性 地通過遺傳圖譜上的位置，或通過指示連鎖群或染色體上的位置來鑒定。當遺傳決定因子 或QTL不再連鎖于特定分子標志物，但其遺傳圖譜上定義的染色體位置未改變時，此遺傳 決定因子仍與其連鎖到分子標志物時相同。因此，其賦予的遺傳性狀也仍相同。
[0136] '遺傳性狀'是由遺傳決定因子賦予的性狀或特征。遺傳性狀可在表型上鑒定，例 如通過實施生物-測定。但是，不可實施表型測定的植物階段也攜帶導致遺傳性狀的遺傳 信息。可使用'性狀'或'表型性狀'代替'遺傳性狀'。此外，在隱性性狀的情況中，雜 合植物也攜帶當以純合形式存在時導致PepMV抗性性狀的遺傳信息。該植物是抗性等位基 因的來源，由此也是本發(fā)明的部分。
[0137] 在分子標志物缺失下，或在已發(fā)生遺傳決定因子和標志物之間的重組，從而標志 物不再可預(yù)測的情況下，可通過等位性測試測定遺傳決定因子的等位性。為了實施等位性 測試，使對于知道的本發(fā)明的決定因子純合的測試植物與對其遺傳決定因子也純合的待測 試的材料雜交。當雜交F2中不存在待觀察的性狀的分離時，遺傳決定因子已被證明等位或 相同。
[0138] 當多于一種基因負責特定性狀，且進行等位性測試以測定等位時，做測試的本領(lǐng) 域技術(shù)人員需保證，為適當?shù)毓ぷ?，對于測試，全部關(guān)聯(lián)基因純合地存在。
[0139] 遺傳圖譜可根據(jù)組建它們的方法而改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何比較及組合 遺傳圖譜，其中可消除或最小化遺傳圖譜之間的差異。來自一個遺傳圖譜的信息可因此 轉(zhuǎn)移或翻譯到另一遺傳圖譜。本文所用的位置是基于2011年1月發(fā)布的SL2. 40版的 番爺基因組的公共物理圖譜的物理位置（http://solgenomics. net/genomes/Solanum_ lycopersicum/genome_data. pi)〇
[0140] 基于本發(fā)明的遺傳決定因子的對鳳果花葉病毒的抗性包含對于一種或更多知道 的Ρ印MV基因型的抗性。知道的基因型包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的LP，EU，CH1，CH2, US1 和US2。對鳳果花葉病毒的抗性可還包含對目前尚未鑒定的PepMV基因型的抗性。尚未鑒 定的PepMV基因型可為目前感染植物，但尚未被表征屬于鳳果花葉病毒的基因型。其也可 為自已存在的株發(fā)展而來的新PepMV基因型，或也將會被分類為鳳果花葉病毒的另一基因 型。
[0141] 【保藏】
[0142] 包含本發(fā)明的導致對鳳果花葉病毒的抗性的遺傳決定因子的番茄（Solanum lycopersicum) 11R. 412000 和 11R. 446400 的種子，在 2012 年 1 月 13 日，分別以保藏 號 No. NCMB41927 和 NCMB41928,保藏在 NCMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB219YA, UK。
[0143] 包含 QTL1 和 QTL2 的番爺（Solanum lycopersicum) 12R. 4211014 的種子，及包 含本發(fā)明的遺傳決定因子（包含QTL1和QTL2和QTL3 (該QTL導致對鳳果花葉病毒的抗 性））的番爺（Solanum lycopersicum) T12R. 107的種子，在2012年10月10日，分別以保 藏號 No. NCMB42068 和 NCMB42069,保藏在 NCMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB219YA, UK。
[0144] 保藏的種子不符合獲得植物變種保護所需要的DUS標準，因此不被認為是植物變 種。
[0145] 本發(fā)明還會在以下實施例中例證。 【實施例】
[0146] 【實施例1 :本發(fā)明的番茄植物的產(chǎn)生】
[0147] 在導致本發(fā)明的研究中，在 申請人:的種質(zhì)中，通過對鳳果花葉病毒抗性實施生物 測定（見實施例2)來鑒定就鳳果花葉病毒免疫的秘魯蕃爺（S. peruvianum)植物。由連續(xù) 生物-測定重復(fù)確認抗性的免疫水平。秘魯蕃茄（S.peruvianum)中免疫的鑒定是非常驚 人的，由于盡管已在各種研究中篩選許多登錄，尚未給出關(guān)于秘魯蕃茄（S.peruvianum)中 免疫或高度抗性植物的早先報道。
[0148] 在生物-測定中尚未鑒定出含有針對PepMV的免疫的其他秘魯蕃茄 (S. peruvianum)植物。單免疫植物自身-不相容，由此無法獲得自交的種子。由于對PepMV 免疫的遺傳被預(yù)期復(fù)雜，與另一秘魯蕃爺（S. peruvianum)植物雜交，之后自交及就抗性選 擇被認為是就維持免疫而言太有風險的方法。因此植物僅增長及通過插枝營養(yǎng)性地維持。
[0149] 使自身-不相容的免疫秘魯蕃爺（S. peruvianum)源植物與番爺（Solanum lycopersicum)系雜交。實施胚胎拯救，以獲得此種間雜交的F1后代。就對鳳果花葉病毒 的抗性篩選F1，但該群被發(fā)現(xiàn)敏感。
[0150] F1還是自身-不相容的，及實施各種F1植物的互交，以獲得可用于進一步開發(fā)的 F2群。
[0151] 就P印MV抗性重復(fù)測試大量的F2植物，通過對各植物進行10次插枝，以獲得同一 基因型。PepMV抗性測試鑒定出僅2個高度抗性F2植物。但是，那些植物中抗性水平仍小 于原秘魯蕃爺（S. peruvianum)源的水平。
[0152] 為了更接近栽培的番爺類型，使高度抗性植物與番爺（Solanum lycopersicum) 系回交，及再次實施胚胎拯救以獲得BC1群。使BC1自交及自這些獲得約15BC1S1群。對 P印MV高度抗性的植物，自各群篩選75個和150個之間的植物，如在實施例2中描述。
[0153] 最終選擇7個BC1S1植物有良好水平的抗性，和對這些植物制造BC2。需實施胚胎 拯救，以獲得此BC2代。BC2再次自交和自此衍生166個BC2S1家族而用于進一步篩選及選 擇。自那些家族中的每一個，就抗性篩選150個植物。各篩選由2步驟組成，如描述于實施 例2。當家族被認為含有良好數(shù)的抗性植物時，需用更強，欠稀釋的，接種物再次重復(fù)篩選。 用此方式可鑒定最高抗性。
[0154] 在各回交及自交步驟之后，實施生物-測定，以鑒定高度抗性植物及確認高水平 的抗性。
[0155] 在第1代期間，P印MV抗性被證明與植物的短小生長強烈連鎖。此副作用呈現(xiàn)為 自抗性源連鎖拖累的結(jié)果。由于短小生長是明顯負面特征，此連鎖拖累使抗性不可應(yīng)用于 在繁殖中直接使用。其還使其難以實施生物-測定，由于植物呈現(xiàn)為弱，使經(jīng)延長的時間保 持它們成為挑戰(zhàn)。自選擇的短小植物獲得種子被證明甚至更復(fù)雜。
[0156] 此外，顯然，抗性的遺傳構(gòu)成非常復(fù)雜。即使已長時間在番茄中搜索對P印MV的抗 性，至今尚未產(chǎn)生對病毒具有高水平的抗性的栽培的番茄（S. lycopersicum)植物。對在 栽培的番茄中合并對此廣布病毒的高抗性水平的可行性問題因此仍待回答。與困難的生 物 -測定組合的抗性遺傳背景的復(fù)雜性使其非常難以為番爺（Solanum lycopersicum)鑒 定含有必要的高水平的抗性或免疫的期望的后代植物。
[0157] 因此實施在實施例3中描述的QTL圖譜，以首先澄清抗性的遺傳構(gòu)造。隨后起始于 BC2代，與表型篩選組合而進行標志物輔助的回交及選擇，以檢測會導致需要的高水平的抗 性的植物。短小生長被確定連鎖于第6染色體上的QTL(QTLl)。
[0158] 通過使用用于3種QTL的標志物，在BC2S1中，可開發(fā)2個家族為具有足夠高水平 的抗性，各純合地含有QTL中的2種，并在第6染色體上不再有會導致短小生長的連鎖拖 累。將自這些系的種子保藏為NCMB41927和NCMB41928。
[0159] 如上述進一步回交，篩選及選擇導致進展的BC4S1群。自那些群之一，選擇純合地 包含2種QTL，即QTL1和QTL2的另一植物及保藏為NCMB42068。
[0160] BC4S1群還包含純合地具有QTL1和QTL2和QTL3的，具有高水平的抗性或免疫 的番茄（S. lycopersicum)植物。將純合地包含全部3種QTL的這些植物的后代保藏為 NCMB42069。
[0161] 【實施例2 :對鳳果花葉病毒抗性的生物-測定】
[0162] 鳳果花葉病毒包括非常攻擊性的基因型，但其行為和癥狀表現(xiàn)可為無法預(yù)測的。 因此，開發(fā)抗性植物，以實施具有足夠的重復(fù)性的非常充分的測定，以在栽培者的條件中確 保良好性能是極其重要的。
[0163] 自待測試的植物，制造幾個插枝，以對相同的基因型的幾個植物進行測定。此方法 防止'逃逸'的選擇，即植物由于一些原因而被鑒定為抗性，但此推定的抗性僅是由于環(huán) 境，而非因為植物含有導致抗性的遺傳決定因子。因此，以最佳方式，由一起形成同一基因 型群的插枝形成測定抗性的重復(fù)，這使得生物-測定的結(jié)果高度可靠。
[0164] 用于實施生物-測定的接種物從感染的番茄葉得到。用具有相對低病毒滴度的接 種物起始生物-測定，其中接種物例如被稀釋300倍。由本領(lǐng)域所知的標準方法進行機械 接種。選擇以此水平對PepMV顯示表型抗性的植物。它們包括包含導致PepMV抗性的一種 或更多QTL的遺傳決定因子。
[0165] 具有表型抗性的植物優(yōu)選是在生物-測定中不顯示任何P印MV癥狀的植物。營養(yǎng) 性植物部分的癥狀可不同及包含'蕁麻頭'（淺灰色的，尖的植物頂部），矮小的頭，扭曲的 葉，黃萎病葉，馬賽克斑，成斑或葉斑。篩選的植物也可相比包括在中生物-測定中的敏感 的對照及被認為具有特定水平的抗性那些植物而顯示減少的易感性。敏感的對照可例如選 自至今本領(lǐng)域所知的任何番茄變種。顯示減少的易感性，但不是抗性或高度抗性或免疫的 植物不純合地包含QTL1和QTL2和QTL3。
[0166] 由優(yōu)選具有高水平的抗性及未顯示癥狀的選擇的植物一次制得更多插枝，以再次 起始年輕植物階段。以此方式，再次有用作獲得最可靠的生物-測定的重復(fù)的同一基因型。 選擇的植物用具有高病毒滴度的接種物再接種，為此接種物例如被稀釋30倍。以此方式， 鑒定含有導致P印MV抗性的最佳遺傳決定因子的最強植物。優(yōu)選由純合地存在QTL1和QTL2 和QTL3達到最高水平的抗性或免疫。
[0167] 作為擴展的生物-測定的必要的部分，實施ELISA測定以測定選擇的植物不僅是 無癥狀的，但病毒也不在植物中增殖。病毒的蓄積會最終導致癥狀或植物衰弱，由此該植物 不是作為耐久抗性源有用的。因此，通過ELISA測定確認選擇的植物是真正無病毒是必要 的。實施測定病毒存在的ELISA測定是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的標準方法。
[0168] 具有分值〈0. 1的植物（其在ELISA測試中具有少于0. 1的吸收），被確認為本發(fā) 明的抗性植物。這些植物具有類似于非-接種的對照的吸收。使用高濃度接種物（其已被 例如30倍稀釋）具有少于0. 1的吸收的植物（這是類似于非-接種的對照的吸收）具有 特征在于高度抗性或免疫的抗性機理。
[0169] 當使用更低濃縮的接種物，例如300倍稀釋的接種物時，選擇在ELISA測試中具有 少于0. 1的吸收的抗性植物及回交，以起始下一循環(huán)。在生長時期期間持續(xù)癥狀觀察和使 用各種接種物濃度的ELISA測試，以確保植物具有耐久抗性。
[0170] 在許多條件下，在生物-測定期間，在年輕植物中不可見病毒癥狀。在這些情況 中，ELISA測定僅是在具有減少的易感性，或具有抗性，或高度抗性，或免疫的此階段的植物 進行選擇的基礎(chǔ)。ELISA測定優(yōu)選在接種插枝之后至少14天或至少18天或至少21天，或 任選地在番茄植物的生長時期期間在更長時間之后實施。
[0171] 由于鳳果花葉病毒的性質(zhì)和抗性的復(fù)雜性，在生物-測定中使用的最佳接種物濃 度可改變。最佳濃度根據(jù)存在于用作獲得接種物的源的植物的病毒的強度和濃度改變。最 佳濃度也依賴于存在于待測試的植物的QTL數(shù)。例如，為選擇具有僅1種或2種本發(fā)明的 QTL的植物，應(yīng)使用更低濃度的接種物。接種用接種物的稀釋可為3倍，30倍，300倍，3000 倍，30, 000倍或發(fā)現(xiàn)適宜于生物-測定實施的條件的任何其他濃度。當可在ELISA測定中 測定敏感的對照和抗性植物之間的病毒滴度的明顯的差異時，濃度是適合的。
[0172] 有必要總是包括抗性和敏感的對照植物作為參照進行檢查是否使用的接種物濃 度對于在生物-測定中使用是適當?shù)模?。P印MV生物-測定的可靠性的本質(zhì)在于：依次包括 至少2種不同接種物濃度，其中第2接種物具有更高濃度；使用許多同一基因型（優(yōu)選通 過插枝），以確認抗性的存在；及在于通過ELISA測定確認病毒減少或病毒缺失或類似于 非-接種的對照植物的吸收，以選擇具有減少的易感性或抗性或高抗性或免疫的植物。
[0173] 表1 :使用300倍接種物稀釋對各種BC2S1家族的P印MV抗性的分離
[0174]
【權(quán)利要求】
1. 番茄植物（番茄（Solanum lycopersicum L·))，其攜帶包含QTL1，QTL2和QTL3中的 一種或更多的遺傳決定因子，該遺傳決定因子賦予對鳳果花葉病毒的抗性，且該QTL如包 含在番茄植物中，其代表性的種子以下列保藏號保藏在NCMB :NCMB41927, NCIMB41928， NCMB42068 和 NCMB42069。
2. 番爺植物（番爺（Solanum lycopersicum L·))，其包含賦予對鳳果花葉病毒 (PepMV)的抗性的遺傳決定因子，其中遺傳決定因子包含： ? QTL1或其P印MV-抗性-賦予部分，其位于在物理位置32, 363, 349bp和 34, 505, 939bp之間，優(yōu)選位置33, 558, 627bp和34, 505, 939bp之間的連鎖群（LG) 6上，和/ 或 ? QTL2或其P印MV-抗性-賦予部分，其位于在物理位置60, 667, 821bp和 62, 460, 220bp之間，優(yōu)選位置61，387, 356bp和62, 253, 846bp之間的連鎖群（LG) 7上，和/ 或 ? QTL3或其P印MV-抗性-賦予部分，其位于物理位置60, 998, 420bp和62, 512, 587bp 之間，優(yōu)選位置61，494, 664bp和62, 385, 023bp之間，更優(yōu)選位置61，723, 339bp和 62, 385, 023bp之間的連鎖群（LG)9上。
3. 權(quán)利要求1或2的番茄植物，其中遺傳決定因子包含： ? QTL1或其P印MV-抗性-賦予部分及QTL2或其P印MV-抗性-賦予部分，或者 ? QTL1或其P印MV-抗性-賦予部分及QTL3或其P印MV-抗性-賦予部分，或 ? QTL2或其P印MV-抗性-賦予-部分及QTL3或其P印MV-抗性-賦予部分。
4. 權(quán)利要求1?3之任一項的番茄植物，其中遺傳決定因子包含： ? QTL1或其P印MV-抗性-賦予部分，及 ? QTL2或其P印MV-抗性-賦予部分，及 ? QTL3或其P印MV-抗性-賦予部分。
5. 權(quán)利要求1?4之任一項的番茄植物，可由包括下列步驟的方法獲得： (a) 使包含QTL1和QTL2的植物，其代表性的種子保藏為NCMB41927或NCMB42068， 或包含QTL2和QTL3的植物，其代表性的種子保藏為NCMB41928,或包含QTL1和QTL2和 QTL3的植物，其代表性的種子保藏為NCMB42069,與不包含遺傳決定因子的植物雜交，以 獲得F1群； (b) 實施一輪或更多輪的自交和/或使來自F1的植物雜交，以獲得再一代群； (c) 任選地自包含QTL1，2和3中的1種或2種的群選擇植物，之后與包含至少Q(mào)TL1，2 和3中的另一種QTL的植物雜交，并隨后重復(fù)步驟（b); (d) 選擇包含QTL1和QTL2和QTL3的植物。
6. 權(quán)利要求1?4之任一項的番茄植物，其可如下獲得：使包含QTL1和/或QTL2和 /或QTL3的第1親本植物與包含QTL1和/或QTL2和/或QTL3的第2親本植物雜交及在 隨后代中選擇，任選地在就包含QTL1和QTL2,或QTL1和QTL3,或QTL2和QTL3,或QTL1和 QTL2和QTL3的植物進一步自交和/或雜交步驟之后。
7. 權(quán)利要求1?6之任一項的番茄植物的種子，其中可自種子生長的植物包含一種或 更多權(quán)利要求2中定義的QTL1-3。
8. 權(quán)利要求7的種子，其中可自種子生長的植物抵抗鳳果花葉病毒。
9. 權(quán)利要求1?6之任一項的番爺植物的后代或權(quán)利要求7或8的番爺種子的后代， 包含一種或更多權(quán)利要求2中定義的QTL1-3。
10. 權(quán)利要求9的后代，其抵抗鳳果花葉病毒。
11. 適合于產(chǎn)生權(quán)利要求1?6,9和10之任一項的植物或適合于產(chǎn)生權(quán)利要求7或 8的種子的繁殖材料，其中繁殖材料適宜于性繁殖，且尤其選自小孢子，花粉，子房，胚珠，胚 囊和卵細胞，或適宜于植物性繁殖，且尤其選自插枝，根，莖，細胞，原生質(zhì)體，或適宜于可再 生的細胞的組織培養(yǎng)，且尤其選自葉，花粉，胚胎，子葉，下胚軸，分生組織細胞，根，根端，花 藥，花，種子和莖，其中自繁殖材料產(chǎn)生的植物包含一種或更多權(quán)利要求2中定義的QTL1? 3 〇
12. 權(quán)利要求11的繁殖材料，其中自繁殖材料產(chǎn)生的植物抵抗鳳果花葉病毒。
13. 權(quán)利要求1?6,9和10之任一項的番爺植物，權(quán)利要求7或8的種子或權(quán)利要求 11或12的繁殖材料，包含： ? QTL1或其抗性賦予部分，其在保藏NCMB41927和/或NCMB42068和/或 NCMB42069中連鎖到由下列表征的分子標志物：SEQ ID NO:l，SEQ ID N0:4和SEQ ID NO:5 和/或 ? QTL2或其抗性賦予部分，其在保藏NCMB41927和/或NCMB41928和/或 NCMB42068和/或NCMB42069中連鎖到由下列表征的分子標志物：SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7,和 / 或 ? QTL3或其抗性賦予部分，其在保藏NCMB41928和/或NCMB42069中連鎖到由下列 表征的分子標志物：SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。
14. 權(quán)利要求1?6,9,10或13之任一項的植物的番茄果實。
15. 食品，其包含權(quán)利要求14的番茄果實，或其部分，任選地以經(jīng)處理形式。
16. 權(quán)利要求1?6,9，10或13之任一項的植物，或自權(quán)利要求7或8的種子，或自權(quán) 利要求11或12的繁殖材料產(chǎn)生的植物在開發(fā)鳳果花葉病毒抗性番茄植物的育種程序中作 為種質(zhì)的用途。
17. 分子標志物，優(yōu)選分子SNP標志物，存在于番爺（Solanum lycopersicum)基因組， 在番爺（Solanum lycopersicum)中，該分子標志物與賦予對鳳果花葉病毒的抗性的QTL遺 傳連鎖，且該分子標志物特征在于是SEQ ID NO: 1?9之任一個且其中QTL優(yōu)選如權(quán)利要 求2中定義。
18. 權(quán)利要求17的標志物用于在番爺（Solanum lycopersicum)植物中鑒定賦予鳳果 花葉病毒抗性的QTL的用途。
【文檔編號】A01H1/04GK104093303SQ201280058633
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月2日
【發(fā)明者】A·福赫拉斯, E·W·古特林, D·B·德雷格爾, R·韋爾霍夫, Z·O·范赫維杰嫩 申請人:瑞克斯旺種苗集團公司