專利名稱：一種金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及水產生物育種技術領域，具體地涉及一種金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種的制備方法。
背景技術：
鮭鱒魚是世界目前主要養(yǎng)殖的魚類之一，由于其自身的品質和對生活環(huán)境的特殊要求，決定了它綠色、環(huán)保營養(yǎng)食品的性質，因此頗受消費者的青睞。鮭鱒魚是我國目前主要的冷水性養(yǎng)殖魚類，隨著我國鮭鱒魚養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，基礎理論研究相對滯后，鮭鱒魚親魚種質退化導致苗種質量退化生產效益下降等問題逐漸突出，從而制約了鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。利用現代生物技術，培育生長迅速、個體大、肉質好、抗病能力強的種苗，將成為我國鮭鱒魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)、穩(wěn)定、健康發(fā)展的必由之路。雜交能夠急劇的動搖遺傳的保守性，使雜種的遺傳性富于游動性，具有更大的可塑性，從而能迅速和顯著地提高雜種的生活力，從而獲得雜種優(yōu)勢；雜種能豐富遺傳結構，通過雜交將兩個以上遺傳基礎不同的品種或種以上個體的基因自由組合，出現新的遺傳類型，繼而人們可以選擇優(yōu)良的個體，培育成新品種。與普通的二倍體魚類相比，三倍體魚類具有生長速度快、成活率高、抗病力強、肉質好、安全健康等優(yōu)點:①三倍體魚類生長速度比二倍體快30-40%，有利于生產大型個體，可有效的提高群體產量；②鮭科三倍體魚類不育，避免了性腺發(fā)育階段和產卵季節(jié)因能量轉移和婚姻色出現而導致的魚肉品質下降及表觀特征變化，避免了其繁殖期生物學死亡，延長養(yǎng)殖周期；③三倍體魚類對環(huán)境沒有潛在的威脅，三倍體可減少魚類的基因混雜，有效控制自然水域中魚類的過度繁殖，避免養(yǎng)殖品種的退化，保護物種的多樣性；④沒有外來基因，屬于人類可以安全食用的健康食品，比起轉基因技術更為人們所接受三倍體魚肉質鮮嫩、可食部分高、體形穩(wěn)定美觀、商品價值高。由于三倍體魚類具有上述優(yōu)勢，因此通過三倍體制備技術獲得生長快速、適應性和抗病力強的優(yōu)質苗種具有巨大的潛力。自上世紀80年代以來，三倍體魚類的人工誘導工作取得了長足進展。目前對三倍體苗種制備的研究主要集中在純種虹鱒魚的三倍體制備，其方法為熱休克法或靜水壓方法?，F有熱休克方法制備純種三倍體虹鱒魚的技術依賴于精確的溫度，溫度稍未變換，會導致苗種畸形率高，使培育效果不穩(wěn)定，始終無法形成規(guī)?；a，其原因為現有的純種生產三倍體苗種制備技術或無法達到生產要求的三倍體率或無法達到可用于生產的苗種成活率，一直無法實現規(guī)?；a。因此，迫切需要一種技術成熟、效果穩(wěn)定且能規(guī)模化生產的三倍體魚苗制備技術，提高受精卵的發(fā)眼率和苗種三倍體率。6- 二甲基氨基嘌呤(N6-Dimethyladenine, 6-DMAP)在多種貝類多倍體誘導中取得了良好效果，但由 于鮭鱒魚對生長環(huán)境水質要求較高，特別對化學物質敏感，至今未有6-二甲基氨基嘌呤應用于鮭鱒魚三倍體或雜交三倍體誘導的成功報道
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種的制備方法，以克服現有技術的不足。本發(fā)明提供的金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種的制備方法，包括以下步驟:I)使金鱒親魚卵子與溪紅點鮭親魚精子雜交受精；2) 6-二甲基氨基嘌呤處理受精卵；3)受精卵在養(yǎng)殖用水中孵化。其中，步驟I)受:精溫度是6-11 °C。步驟I)金鱒親魚培養(yǎng)水溫為10_13°C，流水池水交換量為2h/次，溪紅點鮭親魚培育水溫為8-10°C，流水池水交換量為4h/次。所述步驟I)分別將溪紅點鮭親魚魚卵和精液取出，精液用孵化用水清洗，方法為精液與孵化用水的體積比為1-1.5:2500-3000，攪拌1-1.5min后倒掉水，同樣方法反復沖洗3-5次；按照雄性親魚與雌性親魚1:2-4的尾數比例進行精子與卵子的受精。本發(fā)明制備方法的步驟2)中，受精卵在受精12_14min后，將受精卵移入170-190mg/L的6- 二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)溶液中浸泡處理。優(yōu)選地，受精卵在受精12min后，移入6-二甲基氨基嘌呤溶液中浸泡處理。6_ 二甲基氨基嘌呤溶液的溫度為12-14°C。浸泡時間為14-16min。將步驟2)浸泡處理的受精卵迅速移入6-11 °C孵化水體中孵化48-55天，得到金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體仔魚。

本發(fā)明還提供了 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)在制備金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種中的應用。進一步地，采用濃度為170_190mg/L、溫度為12_14°C的6_ 二甲基氨基嘌呤溶液處
理金鱒與溪紅點鮭受精卵。本發(fā)明提供一種金鱒與溪紅點鮭三倍體苗種的制備方法，具體操作為:選取金鱒雌性親魚魚卵和溪紅點鮭雄魚親魚精子進行體外受精，7°C條件下魚卵受精12min后,將受精卵迅速移入濃度為180mg/L、溫度為121:的6-0麻？溶液中浸泡溪紅點鮭受精卵15min ；之后迅速移入7°C水體中正常孵化50天，得到金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體魚苗。本發(fā)明制備方法所用的水體均為符合國家漁業(yè)水質標準規(guī)定的孵化用水。本發(fā)明提供了上述制備方法在溪紅點鮭三倍體苗種育種工作中的應用。本發(fā)明意外地發(fā)現通過一定濃度、溫度的6- 二甲基氨基嘌呤溶液處理金鱒與溪紅點鮭受精卵，能夠抑制受精卵第二極體的排出，在此基礎上，本發(fā)明經過大量實驗反復摸索實驗條件，實現了規(guī)?；苽浣瘅V與溪紅點鮭雜交三倍體苗種，應用該方法的受精卵發(fā)眼率達到78%，苗種孵化率達到90%以上，苗種三倍體率達到95%，該發(fā)明方法受精卵發(fā)眼率與正常鮭鱒魚生產相近，三倍體率達到了生產需求，實現了雜交三倍體苗種的規(guī)模化生產，得到的金鱒與溪紅點鮭雜交苗種具有雜交和三倍體優(yōu)勢，在生長速度和抗病能力方面明顯優(yōu)于現有的二倍體虹鱒魚，具有較好的經濟效益和市場價值。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明的金鱒親魚和溪紅點鮭親魚為北京市水產科學研究所由北歐瑪生物科技有限公司購買的發(fā)眼卵培育而成。6-DMAP購自美國SIGMA公司。實施例1金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種制備方法(I)采用水流刺激，控制光照，投喂親魚強化配合飼料等手段，使金鱒親魚與溪紅點鮭親魚同步發(fā)育成熟。金鱒親魚培育水溫為10°c，流水池水交換量為2h/次，溪紅點鮭親魚培育水溫為10°C，流水池水交換量為4h/次。魚卵采用干法受精。先將發(fā)育成熟的金鱒雌魚采用擠壓法將魚卵擠入干凈的瓷盆內，每4尾雌魚為I組，再將2尾雄性溪紅點鮭的精液擠入水盆內，水溫10°C，立即攪拌均勻，加入精液與孵化用水的體積比為1:2500的孵化用水，輕輕攪拌，Imin后將水倒出，反復3次，將精液清洗干凈，放置等待處理。魚卵受精12min后，將受精卵迅速移入濃度為180mg/L、溫度為12°C的6-DMAP溶液中浸泡處理，浸泡15min后,迅速移入7°C孵化水體中正常孵化。經過50天孵化出魚苗，期間雜交三倍體受精卵發(fā)眼率為82%，苗種孵化率為93%，其苗種經流式細胞儀檢測為三倍體率為95%的金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種。發(fā)眼卵至4月齡階段三倍體成活率為發(fā)眼階段的76%。通過對金鱒、溪紅點鮭以及本實施例制得的金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體的微衛(wèi)星分析，結果說明本實施例制得的雜交三倍體為金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體。實施例2金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種制備方法(2)采用水流刺激，控制光照，投喂親魚強化配合飼料等手段，使金鱒與溪紅點鮭親魚同步發(fā)育成熟。金鱒親魚培育水溫為`13°C，流水池水交換量為2h/次，溪紅點鮭親魚培育水溫為8 °C，流水池水交換量為4h/次。魚卵采用干法受精。先將發(fā)育成熟的金鱒雌魚采用擠壓法將魚卵擠入干凈的瓷盆內，每4尾雌魚為I組，再將2尾雄性溪紅點鮭的精液擠入水盆內，水溫8°C，立即攪拌均勻，加入精液與孵化用水的體積比為1:3000的孵化用水,輕輕攪拌，1.5min后將水倒出，反復3次，將精液清洗干凈，放置等待處理。魚卵受精13min后，將受精卵迅速移入濃度為170mg/L、溫度為13°C的6-DMAP溶液中浸泡處理，浸泡16min后,迅速移入10°C孵化水體中正常孵化。經過52天孵化出魚苗，期間雜交三倍體受精卵發(fā)眼率為78%，苗種孵化率為89%，其苗種經流式細胞儀檢測三倍體率為93%的金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種。發(fā)眼卵至4月齡階段三倍體成活率為發(fā)眼階段的81%。采用現有技術中已報道的微衛(wèi)星分析方法，結果顯示本實施例制得的雜交三倍體為金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體。實施例3金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種制備方法(3)采用水流刺激，控制光照，投喂親魚強化配合飼料等手段，使金鱒與溪紅點鮭親魚同步發(fā)育成熟。金鱒親魚培育水溫為ll°c，流水池水交換量為2h/次，溪紅點鮭親魚培育水溫為9 °C，流水池水交換量為4h/次。魚卵采用干法受精。先將發(fā)育成熟的金鱒雌魚采用擠壓法將魚卵擠入干凈的瓷盆內，每4尾雌魚為I組，再將2尾雄性溪紅點鮭的精液擠入水盆內，水溫11°C，立即攪拌均勻，加入精液與孵化用水的體積比為1.5:3000的孵化用水,輕輕攪拌，Imin后將水倒出，反
復3次，將精液清洗干凈，放置等待處理。魚卵受精14min后，將受精卵迅速移入濃度為190mg/L、溫度為12°C的6-DMAP溶液中浸泡處理，浸泡15min后,迅速移入8 °C孵化水體中正常孵化。經過48天孵化出魚苗，期間雜交三倍體受精卵發(fā)眼率為79%，苗種孵化率為90%，其苗種經流式細胞儀檢測三倍體率為94%的金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種。發(fā)眼卵至4月齡階段三倍體成活率為發(fā)眼階段的77%。采用現有技術中已報道的微衛(wèi)星分析方法，結果顯示本實施例制得的雜交三倍體為金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體。實施例4金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種制備方法(4)采用水流刺激，控制光照，投喂親魚強化配合飼料等手段，使金鱒與溪紅點鮭親魚同步發(fā)育成熟。金鱒親魚培育水溫為12°C，流水池水交換量為2h/次，溪紅點鮭親魚培育水溫為8 °C，流水池水交換量為4h/次。魚卵采用干法受精。先將發(fā)育成熟的金鱒雌魚采用擠壓法將魚卵擠入干凈的瓷盆內，每4尾雌魚為I組，再將2尾雄性溪紅點鮭的精液擠入水盆內，水溫7.5°C，立即攪拌均勻，加入精液與孵化用水的體積比為1.5:2500的孵化用水,輕輕攪拌，Imin后將水倒出，反復5次，將精液清洗干凈，放置等待處理。魚卵受精12.5min后，將受精卵迅速移入濃度為180mg/L、溫度為14°C的6-DMAP溶液中浸泡處理，浸泡14min后，迅速移入7.5°C孵化水體中正常孵化。經過55天孵化出魚苗，期間雜交三倍體受精卵發(fā)眼率為96%，苗種孵化率為92%，其苗種經流式細胞儀檢測三倍體率為94%的金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種。發(fā)眼卵至4月齡階段三倍體成活率為·發(fā)眼階段的77%。采用現有技術中已報道的微衛(wèi)星分析方法，結果顯示本實施例制得的雜交三倍體為金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體。實施例5不同濃度6-DMAP溶液對雜交三倍體苗種孵化率和雜交三倍體率的影響配制好濃度為90、120、150、180、210mg/l溫度為12°C的6-DMAP溶液待用。金鱒早X溪紅點 受精后受精卵放置在溫度為9.8°C的水體中14min，14min后立即分別放入上述配好的6-DMAP溶液中浸泡，時間為15min，期間不時的攪動受精卵，以使受精卵得以均勻浸泡，15min后移入7 °C孵化水體中正常孵化52天。表I不同濃度6-DMAP溶液處理受精卵對三倍體苗種的影響
濃度mg/1 孵化水溫(O) 發(fā)眼率(％) 孵化率(％)三倍體率(％)
909.67791451209.88091801509.7829'8、
1809.8758995
2109 8789294
實施例66-DMAP溶液(180mg/L、12°C )處理受精卵不同時間對雜交三倍體苗種孵化率和雜交三倍體率的影響參照實施例1的方法培養(yǎng)金鱒與溪紅點鮭魚雜交三倍體苗種，濃度為180mg/L、溫度為12°C的6-DMAP溶液處理金鱒與溪紅點鮭魚受精卵的處理時間不同，見表2，其他培育條件同實施例1。孵化50天，觀察并記錄6-DMAP溶液處理受精卵不同時間，對金鱒與溪紅點鮭魚雜交三倍體苗種的影響，結果見表2。結果說明，6-DMAP溶液在處理5-20min時間范圍內，受精卵的發(fā)眼率沒有明顯變化，但苗種三倍體率在5-15min內卻隨著處理時間的增長而顯著增加，當處理時間為20min時，受精卵孵化率有所降低，盡管幅度不大，而且從苗種三倍體率上看并沒有較大增加，因此認為處理時間15min是合適的。表2 6-DMAP溶液不同處理時間對三倍體苗種的影響
權利要求
1.一種金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)使金鱒親魚卵子與溪紅點鮭親魚精子雜交受精； 2)6-二甲基氨基嘌呤處理受精卵； 3)受精卵在養(yǎng)殖用水中孵化。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟I)的體外受精溫度是6-11°C。
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟I)金鱒親魚培養(yǎng)水溫為10-13°C，流水池水交換量為2h/次；溪紅點鮭親魚培育水溫為8-10°C，流水池水交換量為4h/次。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟I)分別將金鱒雌性親魚魚卵和溪紅點鮭雄性親魚的精液取出，精液用孵化用水清洗，方法為精液與孵化用水的體積比為1-1.5:2500-3000，攪拌1-1.5min后倒掉水，同樣方法反復沖洗3_5次；按照雄性親魚與雌性親魚1:2-4的尾數比例進行精子與卵子的受精。
5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中，受精卵在受精12-14min后，將受精卵移入170-190mg/L的6- 二甲基氨基嘌呤溶液中浸泡處理。
6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，6-二甲基氨基嘌呤溶液的溫度為12-14℃。
7.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，浸泡時間為14-16min。
8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，將步驟2)浸泡處理的受精卵迅速移入6-ll°C孵化水體中孵化48-55天。
9.6- 二甲基氨基嘌呤在制備金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于，用濃度為170-190mg/L、溫度為12_14°C的6- 二甲基氨基嘌呤溶液浸泡處理金鱒與溪紅點鮭受精卵。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種的制備方法。利用金鱒與溪紅點鮭雜交得到受精卵，再通過6-DMAP溶液浸泡處理受精卵，再孵化培育，產生雜交三倍體苗種。本發(fā)明方法孵化期間受精卵發(fā)眼率為78%以上，苗種孵化率達到90%以上，得到的仔魚經流式細胞儀檢測，三倍體率達到95%。該方法可規(guī)模化生產金鱒與溪紅點鮭雜交三倍體苗種，從而提高鮭鱒魚的生長速度及抗病能力，為養(yǎng)殖戶提高經濟效益，具有較好的市場價值。
文檔編號A01K61/00GK103238547SQ201310195318
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月23日 優(yōu)先權日2013年5月23日
發(fā)明者徐紹剛, 李文通, 田照輝, 楊曉飛, 楊貴強 申請人:北京市水產科學研究所