一種利用二倍體細(xì)胞與花粉細(xì)胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用二倍體細(xì)胞與花粉細(xì)胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法。該方法包括：(1)優(yōu)選出抗逆性好、生長(zhǎng)快、莖稈粗、莖高長(zhǎng)、分蘗多、纖維含量低、藥效成分含量高的不同產(chǎn)地的霍山石斛品種作為三倍體培育源植株親本；(2)對(duì)源植株種子在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌播種，獲得原球莖；(3)對(duì)源植株花粉在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌培養(yǎng)，獲得花粉細(xì)胞群；(4)制備花粉細(xì)胞和原球莖細(xì)胞的原生質(zhì)體，進(jìn)行細(xì)胞融合；(5)在固體培養(yǎng)基上對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)分化成幼株，檢測(cè)出三倍體植株；(6)對(duì)三倍體植株進(jìn)行組培，獲得大量三倍體幼苗。
【專利說明】一種利用二倍體細(xì)胞與花粉細(xì)胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蘭科石斛屬藥用植物生物育種方法，特別涉及一種利用二倍體細(xì)胞與花粉細(xì)胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]霍山石斛(學(xué)名:Dendrobiumhuoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng) 在國(guó)際上有“藥界大熊貓”之稱的野生霍山石斛，史稱霍石斛，俗稱米斛，距今已有200
多年的歷史。原產(chǎn)于我國(guó)安徽大別山等地，是國(guó)家現(xiàn)代中藥重大專項(xiàng)200多個(gè)瀕危稀缺品種中首位保護(hù)品種。是藥用石斛中的極品，也是霍山縣獨(dú)有的、擁有原產(chǎn)地地理標(biāo)志的名貴中藥材，歷史上被譽(yù)為“中華九大仙草之首”、“健康軟黃金”?！渡褶r(nóng)本草》、《本草綱目》均有記載?；羯绞械亩嗵?、生物堿類物質(zhì)有清咽利嗓，保肝明目、降糖降脂、延年益壽之功效。本品能大幅度提高人體內(nèi)SOD(延緩衰老的主要物質(zhì))，在增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、延緩衰老和促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡等方面有明顯作用，從而達(dá)到保健保健的功效。
[0003]多倍體育種是植物新品種培育的重要手段，多倍體育種起源于20世紀(jì)初，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于植物新品種的培育中。多倍體由于基因組倍性的增加，往往表現(xiàn)出形態(tài)上的巨大性和抗性增強(qiáng)等特點(diǎn)。其中三倍體還具有不育特點(diǎn)，即可作為永久雜種，也有利于商業(yè)保護(hù)。
[0004]通過基因組三倍化，可以獲得具有多倍體和雜交種雙重優(yōu)勢(shì)的三倍體，其優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)出具有巨大性和不可替代性，可以提高霍山石斛藥材產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性。三倍體霍山石斛則具有產(chǎn)量和質(zhì)量上的雙重優(yōu)勢(shì)。
[0005]國(guó)家“十一五”和“十二五”計(jì)劃均提出“種質(zhì)資源的挖掘、保存、創(chuàng)新和新品種的定向培育”的任務(wù)。為貫徹、落實(shí)這項(xiàng)任務(wù)，我們倡導(dǎo)應(yīng)用“基因組多倍化與融合雜交相結(jié)合”的方法，實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源的創(chuàng)新和新品種的定向培育的目的。目前僅有三倍體鐵皮石斛和春石斛蘭的培育方法已公開并授權(quán)，迄今為止，三倍體霍山石斛(染色體核型指數(shù)為2n=3x=57)及培育方法還未見有公開報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用二倍體細(xì)胞與花粉細(xì)胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法，該方法培育出的三倍體霍山石斛與二倍體霍山石斛相比，其主要形態(tài)性狀基本相同，但其莖、葉、花表現(xiàn)出明顯的增大，產(chǎn)量與多糖含量顯著提高，抗逆性增強(qiáng)。本發(fā)明產(chǎn)生的三倍體霍山石斛具有多倍體和雜交種的雙重優(yōu)勢(shì)。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種利用二倍體細(xì)胞與花粉細(xì)胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法，包括以下步驟:
步驟(I)中所述霍山石斛為分布在大別山山系的不同產(chǎn)地具有優(yōu)良性狀的品種，其中高緯度、高海拔地區(qū)的品種具有抗逆性強(qiáng)、莖桿粗、藥效成分含量高的特點(diǎn)，低緯度、低海拔地區(qū)的品種具有生長(zhǎng)速度快、莖高長(zhǎng)、分蘗多、纖維含量低的特點(diǎn)。
[0008]步驟(2)和步驟(3)中所述培養(yǎng)為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，適合脫分化形成愈傷組織的培養(yǎng)基均可。優(yōu)選大量元素減半的1/2MS培養(yǎng)基，調(diào)整蔗糖濃度為5%-8%，優(yōu)選添加10-15%的椰乳，2，4-D 0.2-2.0 mg/L, NAA 0.2-2.0 mg/L ;培養(yǎng)溫度在25_18°C的晝夜溫差范圍內(nèi)，光照時(shí)間10-12小時(shí)，光照強(qiáng)度2000-3000Lux，色溫在4500_5500k。
[0009]步驟(4)中所述原生質(zhì)體的制備方法為常規(guī)的酶解法制備，細(xì)胞融合辦法優(yōu)選電擊融合法。對(duì)花粉細(xì)胞和原球莖細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞融合，是為短時(shí)期內(nèi)獲得雜交種而設(shè)計(jì)的辦法。如果利用四倍體植株與二倍體植株開花授粉，再組培成幼苗完成三倍體大量制備，最快需要2年，因?yàn)樗谋扼w植株從組培苗到正常開花至少需要I年，從授粉到結(jié)實(shí)，需要5個(gè)月，種子培養(yǎng)成幼苗需要6-8個(gè)月。而三倍體融合細(xì)胞在驗(yàn)證成功后，再培養(yǎng)成幼苗只需要6-8個(gè)月，大大縮短了育苗周期。
[0010]步驟(5)中所述檢測(cè)染色體倍數(shù)采用常規(guī)染色鏡檢辦法，選取染色體數(shù)目2n=3x=57的幼苗，是培育成功的三倍體，在檢測(cè)過程中會(huì)發(fā)現(xiàn)二倍體或四倍體，這些分別是花粉細(xì)胞或體細(xì)胞融合形成的。
[0011]本發(fā)明包括上述任何一項(xiàng)培育方法得到的三倍體霍山石斛。
[0012]本發(fā)明有益效果:
本方法先分別培養(yǎng)霍山石斛種子和霍山石斛花粉形成愈傷組織，再分別制備愈傷組織的原生質(zhì)體，經(jīng)原生質(zhì)體融合形成三倍體。該三倍體霍山石斛培育方法步驟簡(jiǎn)單，能顯著縮短育種時(shí)間。由這種方法培育出的三倍體霍山石斛與二倍體霍山石斛石斛相比，其主要形態(tài)性狀基本相同，但其莖、葉、花表現(xiàn)出明顯的增大，產(chǎn)量與多糖含量顯著提高，抗逆性增強(qiáng)，具有多倍體和雜交種的雙重優(yōu)勢(shì)。

【具體實(shí)施方式】
[0013]下面以實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
的技術(shù)特征所作的等同替換，或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0014]為方便描述，以下實(shí)施例中用“品種A”表示高緯度、高海拔地區(qū)的染色體核型指數(shù)為2n=2x=38的霍山石斛品種，該品種具有抗逆性強(qiáng)、莖桿粗、藥效成分含量高的特點(diǎn)；用“品種B”表示低緯度、低海拔地區(qū)的染色體核型指數(shù)為2n=2x=38的霍山石斛品種，該品種具有生長(zhǎng)速度快、莖高長(zhǎng)、分蘗多、纖維含量低的特點(diǎn)。
[0015]實(shí)施例1
(1)將品種A和品種B的植株按常規(guī)方法種植栽培；
(2)對(duì)上述品種A的種子在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌播種，獲得原球莖的愈傷組織，固體培養(yǎng)基為大量元素減半的1/2MS培養(yǎng)基，添加0.2g/L 2，4-D和0.2g/L NAA,調(diào)整蔗糖濃度為5%-8%，添加10-15%的椰乳，培養(yǎng)溫度在25-18 V的晝夜溫差范圍內(nèi)，光照時(shí)間10-12 h，光照強(qiáng)度 2000-3000 Lux，色溫在 4500-5500 K ；
(3)對(duì)上述品種B的花粉在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌培養(yǎng)，獲得花粉細(xì)胞群，固體培養(yǎng)基為H培養(yǎng)基，添加0.5g/L 2，4-0和1.5 g/L NAA,培養(yǎng)溫度在25-18 1:的晝夜溫差范圍內(nèi)，光照時(shí)間10-12 h，光照強(qiáng)度2000-3000 Lux，色溫在4500-5500 K ；
(4)制備花粉細(xì)胞和原球莖細(xì)胞的原生質(zhì)體，進(jìn)行細(xì)胞融合，原生質(zhì)體的制備方法為酶解法制備，細(xì)胞融合辦法采用電擊法；
(5)在固體培養(yǎng)基上對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)分化成幼株，檢測(cè)出三倍體植株，取細(xì)胞組織染色壓片，鏡檢驗(yàn)證染色體倍數(shù)，選取染色體數(shù)目2n=3x=57的幼苗，是培育成功的三倍體；
(6)對(duì)三倍體植株進(jìn)行無性組培，獲得大量三倍體幼苗，幼苗培育成成株，成株具有抗逆性強(qiáng)、莖桿粗、莖高長(zhǎng)、分蘗多、生長(zhǎng)速度快、纖維含量低、藥效成分含量高的特點(diǎn)，其中總多糖含量達(dá)21%。
[0016] 實(shí)施例2
(1)將品種A和品種B的植株按常規(guī)方法種植栽培；
(2)對(duì)上述品種B的種子在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌播種，獲得原球莖的愈傷組織，固體培養(yǎng)基為大量元素減半的1/2MS培養(yǎng)基，添加0.2g/L 2，4-D和0.2g/L NAA,調(diào)整蔗糖濃度為5%-8%，添加10-15%的土豆汁，培養(yǎng)溫度在25-18 °C的晝夜溫差范圍內(nèi)，光照時(shí)間10-12h，光照強(qiáng)度 2000-3000 Lux，色溫在 4500-5500 K ；
(3)對(duì)上述品種A的花粉在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌培養(yǎng)，獲得花粉細(xì)胞群，固體培養(yǎng)基為H培養(yǎng)基，添加0.5g/L 2，4-0和1.5 g/L NAA,培養(yǎng)溫度在25-18 1:的晝夜溫差范圍內(nèi)，光照時(shí)間10-12 h，光照強(qiáng)度2000-3000 Lux，色溫在4500-5500 K ；
(4)制備花粉細(xì)胞和原球莖細(xì)胞的原生質(zhì)體，進(jìn)行細(xì)胞融合，原生質(zhì)體的制備方法為酶解法制備，細(xì)胞融合辦法采用電擊法；
(5)在固體培養(yǎng)基上對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)分化成幼株，檢測(cè)出三倍體植株，取細(xì)胞組織染色壓片，鏡檢驗(yàn)證染色體倍數(shù)，選取染色體數(shù)目2n=3x=57的幼苗，是培育成功的三倍體；
(6)對(duì)三倍體植株進(jìn)行無性組培，獲得大量三倍體幼苗，幼苗培育成成株，成株具有抗逆性強(qiáng)、莖桿粗、莖高長(zhǎng)、分蘗多、生長(zhǎng)速度快、纖維含量低、藥效成分含量高的特點(diǎn)，其中總多糖含量達(dá)20%。
【權(quán)利要求】
1.一種利用二倍體細(xì)胞與花粉細(xì)胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)優(yōu)選出抗逆性好、株型大、生長(zhǎng)快、藥效成分含量高的不同產(chǎn)地的霍山石斛品種作為二倍體培育源植株； (2)對(duì)源植株種子在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌播種，獲得原球莖； (3)對(duì)源植株花粉在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行無菌培養(yǎng)，獲得花粉細(xì)胞群； (4)制備花粉細(xì)胞和原球莖細(xì)胞的原生質(zhì)體，進(jìn)行細(xì)胞融合； (5)在固體培養(yǎng)基上對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)分化成幼株，檢測(cè)出三倍體植株； (6)對(duì)三倍體植株進(jìn)行無性組培，獲得大量三倍體幼苗。
2.按照權(quán)利要求1所述的利用二倍體細(xì)胞與花粉細(xì)胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于:步驟(I)中所述霍山石斛為分布在大別山山系的不同產(chǎn)地具有優(yōu)良性狀的品種，其中高緯度、高海拔地區(qū)的品種具有抗逆性強(qiáng)、莖桿粗、藥效成分含量高的特點(diǎn)，低緯度、低海拔地區(qū)的品種具有生長(zhǎng)速度快、莖高長(zhǎng)、分蘗多、纖維含量低的特點(diǎn)。
3.按照權(quán)利要求1所述的利用二倍體細(xì)胞與花粉細(xì)胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于:步驟(2)和步驟(3)中所述培養(yǎng)為固體培養(yǎng)基，適合誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基均可，優(yōu)選大量元素減半的1/2MS培養(yǎng)基，調(diào)整蔗糖濃度為5%-8%，優(yōu)選添加10-15% 的椰乳，2，4-D 0.2-2.0 mg/L, NAA 0.2-2.0 mg/L ;培養(yǎng)溫度在 25_18°C 的晝夜溫差范圍內(nèi)，光照時(shí)間10-12小時(shí)，光照強(qiáng)度2000-3000Lux，色溫在4500_5500k。
4.按照權(quán)利要求1所述的利用二倍體細(xì)胞與花粉細(xì)胞融合育種法培育三倍體霍山石斛的方法，其特征在于:步驟(4)中所述原生質(zhì)體的制備方法優(yōu)選酶解法制備，原生質(zhì)體融合辦法優(yōu)選電擊融合法。
5.按照權(quán)利要求1所述的一種三倍體霍山石斛的培育方法，其特征在于:步驟(5)中所述檢測(cè)染色體倍數(shù)采用常規(guī)染色鏡檢辦法，選取染色體數(shù)目2n=3x=57的幼苗，是培育成功的三倍體。
6.權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)所述培育方法得到的三倍體霍山石斛。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104429939SQ201410343440
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月18日
【發(fā)明者】鄧輝, 姚厚軍, 張德華, 楊國(guó)棟, 陳乃東 申請(qǐng)人:皖西學(xué)院