一個控制水稻育性基因OsRPA2c的克隆及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及分離、克隆和通過功能驗證得到一個控制水稻育性的OsRPA2c基因及應用。本發(fā)明克隆的OsRPA2c基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其蛋白質(zhì)的序列如SEQ?ID?NO：2所示。研究表明抑制該基因的表達會導致水稻雄性不育。本發(fā)明克隆的基因及其編碼蛋白可應用于培育轉(zhuǎn)基因作物雄性不育系，和應用于植物雜交種子的生產(chǎn)。
【專利說明】—個控制水稻育性基因0sRPA2c的克隆及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體的說，具體涉及一個參與控制水稻減數(shù)分裂過程中同源染色體重組的基因0sRPA2c的克隆、功能驗證及利用。本發(fā)明利用水稻T-DNA插入突變體庫，分離克隆一個通過參與控制水稻減數(shù)分裂過程中同源染色體重組，進而控制水稻育性的基因0sRPA2c。本發(fā)明還涉及利用該基因在培育作物雄性不育系和反向育種過程中獲得育種親本并最終生產(chǎn)雜交種子的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]植物有性生殖不僅是其生活史中的重要組成部分，而且通過植物的生殖過程產(chǎn)生的種子或果實往往是重要的食物，對人類具有重要的意義。但是，當我們進行植物生產(chǎn)的目的不是種子或果實時，生殖過程中產(chǎn)生的種子或果實往往會降低目標器官的產(chǎn)量或影響其品質(zhì)，有時植物產(chǎn)生的種子或果實還會對環(huán)境造成污染，如懸鈴木的種子。因此，闡明植物調(diào)控生殖的途徑和機理，進而人為控制植物的育性對植物的生產(chǎn)具有重要的應用價值。
[0003]在植物的生活史中，要經(jīng)歷二倍體的孢子體時代和單倍體的配子體時代。在孢子體時代，真核生物進行減數(shù)分裂形成單倍體的孢子；接下來，來自父母本的配子的融合使后代恢復到其雙親二倍體的水平。因此，減數(shù)分裂在植物世代交替中扮演重要的角色，并在植物的育性控制中起著非常重要的作用。調(diào)控減數(shù)分裂已成為培育無籽果實的植物新品種的重要潛在途徑。
[0004]減數(shù)分裂是二倍體的生殖 母細胞在一次DNA復制后經(jīng)過連續(xù)兩次的細胞分裂(減數(shù)分裂I和減數(shù)分裂II)，形成單倍體的雌雄配子的過程，隨后，來自父母本的單倍體配子的融合使后代恢復到其雙親二倍體的水平。減數(shù)分裂過程中發(fā)生的同源染色體之間的重組和交換在保證遺傳物質(zhì)穩(wěn)定遺傳的同時，也使后代不同個體之間出現(xiàn)一定的遺傳多樣性，這對生物適應不同的生存環(huán)境和進化有重要的意義。
[0005]為了便于研究，減數(shù)分裂的兩次分裂過程分別被人為的劃分為前期(piOphase)、中期(metaphase)、后期(anaphase)和末期(telophase)。其中在減數(shù)分裂I的前期(前期I)，其染色體行為是減數(shù)分裂過程特有的，而且也是減數(shù)分裂過程中最復雜的一個時期。為了保證同源染色體能夠正確的分配到子代細胞中，前期I的染色體要發(fā)生一系列的行為，包括同源染色體的凝集、靠近、聯(lián)會、配對以及分離。人們根據(jù)這些細胞學特征，將前期I劃分為5個時期:細線期(Ieptotene)、偶線期(zygotene)、粗線期(pachytene)、雙線期(diplotene)、終變期(diakinesis)。
[0006]在減數(shù)分裂的前期I時，同源染色體的配對、聯(lián)會、重組并形成交叉結(jié)，這一過程在真核生物中是一個保守的過程。傳統(tǒng)的觀點認為減數(shù)分裂過程中同源重組發(fā)生在同源染色體配對之后；但是，根據(jù)現(xiàn)代分子生物學的研究發(fā)現(xiàn)配對是重組的結(jié)果而非重組的前提。在酵母、小鼠和擬南芥等模式生物的中，越來越多的證據(jù)表明重組是依賴于DSB (雙鏈斷裂)的形成和修復過程。
[0007]近十多年來，人們以酵母做為研究減數(shù)分裂的模式生物，鑒定了許多控制減數(shù)分裂的基因。此外，人們通過正向或反向遺傳學的手段也在植物功能基因研究的模式生物擬南芥中克隆了幾十個控制減數(shù)分裂的基因(Mercier, R.and Grelon, Μ.2008, Meiosisin plants: ten years of gene discovery.Cytogenet Genome Res, 120,281 -290;Ma, Η.2006A Molecular Portrait of Arabidopsis Meiosis.1n The ArabidopsisBook.Somerville, C.and Meyerowitz, E.eds, pp.1 - 39)。研究表明，減數(shù)分裂是一種在真核生物中很保守的機制。
[0008]水稻由于其較小的基因組序列、已經(jīng)成為植物研究的重要模式之一，而且，減數(shù)分裂是真核生物中很保守的機制，因此，水稻減數(shù)分裂研究的結(jié)果可以對其它植物的研究起重要的指導作用。本研究所涉及的0sRPA2c就是水稻中控制減數(shù)分裂的基因，水稻0srpa2c突變體具有正常形態(tài)，但是卻完全不育，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，造成其不育的根本原因是減數(shù)分裂過程中同源染色體不能形成二價體。[0009]RPA最初是從Hela細胞粗提物中鑒定出來的參與SV40病毒體外復制的必需蛋白之一，人類的 RPA 是由 70kDa (RPA70/RPA1 )、32kDa (RPA32/RPA2)、14kDa (RPA13/RPA3)三個亞基組成的異源三聚體。目前，在所有完成測序的真核生物中都鑒定出了 RPA(Iftode，等.(1999)Replication protein A(RPA):theeukaryotic SSB.Crit Rev Biochem MolBiol, 34, 141 - 180.Wold, M.S.(1997)Replication protein A:aheterotrimeric,single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism.Annu RevBiochem，66，61-92.)。雖然有實驗室對水稻和擬南芥中的RPA基因做過一些研究(見下述)，但是，這些零星的研究只局限于對其表達的分析，在本發(fā)明提出之前，沒有有關(guān)植物中RPA2的生物學功能的報道。1997年，van der Knaap等(van der Knaap,等.(1997)Expression of an ortholog of replication protein Al (RPAl) is inducedby gibberellin in deepwater rice.Proc Natl Acad Sci U S A, 94，9979 - 9983.)利用差異顯示的方法從水稻的居間分生組織中鑒定出受水淹迫后上升表達的基因，序列分析表明該基因為水稻的復制蛋白A (OsRPAlb)，但是，該研究未涉及其功能。此外，日本的實驗室對水稻和擬南芥的RPA基因做過一些研究(Marwedel,等.(2003)Plant-specificregulation of replication protein A2 (0sRPA2)from rice during the cell cycleand in response to ultraviolet light exposure.Planta, 217, 457 - 465.1shibashi,等.(2001)Two types of replication protein A70kDa subunit in rice,Oryzasativa:molecular cloning, characterization, and cellular& tissue distribution.Gene, 272, 335 - 343.1shibashi,等.(2006)A Higher Plant Has Three Different Typesof RPA Heterotrimeric Complex.J Biochem(Tokyo)，139，99 - 104.),但這些研究都未涉及其功能，更沒有關(guān)于水稻和擬南芥的RPA2基因參與育性控制的報道。
[0010]本發(fā)明利用0sRPA2c的T-DNA插入突變體詳細研究了該基因在減數(shù)分裂的同源重組過程中的作用，為我們深入了解減數(shù)分裂的分子機制提供了幫助，并為培育無籽品種、創(chuàng)建雄性不育材料提供了一個潛在的新基因資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是在于提供一種控制水稻育性特別是水稻減數(shù)分裂的基因0sRPA2c，該基因具有如SEQID NO:1所示的DNA片段，也包括與SEQ ID NO:1所示的DNA序列至少有50%同源性的基因序列；也包括由于添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸而產(chǎn)生的突變體等位基因或衍生物，還包括具有相同功能并能達到本發(fā)明目的的基因序列。本發(fā)明也包括與SEQ ID NO:2所示的蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有50%以上(包括50%)同源性的功能類似物。該基因的失活抑制了水稻減數(shù)分裂的同源重組過程，進而導致雌雄配子的發(fā)育異常并造成水稻植株的完全不育，因此該基因的克隆有助于理解植物減數(shù)分裂的過程及其機理。
[0012]本發(fā)明的另一個目的是人為控制0sRPA2c在轉(zhuǎn)基因植物中的表達，并將其應用于反向育種中，可以快速高效的獲得不同遺傳組成的純合親本。具體地說就是利用分子設(shè)計的方法(將該基因與其它器官或組織特異表達的調(diào)控元件組合)抑制該基因在小孢子母細胞中的表達，從而得到相應的轉(zhuǎn)基因雄性不育系，用來生產(chǎn)雜交種子。
[0013]0sRPA2c基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，也包括與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有90%以上同源性的基因序列，也包括因插入、替代或缺失一個或多個堿基而產(chǎn)生的突變等位基因或衍生物。本發(fā)明也包括SEQ ID NO:2所示的0sRPA2c蛋白的氨基酸序列，及與SEQ ID NO:2所示的蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有90%同源性以上的氨基酸序列，也包括因插入、替代或缺失一個或多個氨基酸而產(chǎn)生的功能類似物。
[0014]本發(fā)明克隆的水稻0sRPA2c基因的T-DNA插入失活突變體osrpa2c表現(xiàn)為花粉敗育(見實施例1)，并且該突變表型也與插入0sRPA2c基因內(nèi)的T-DNA共分離(見實施例4)。所述的0sRPA2c基因在小孢子減數(shù)分裂過程中特異表達(見實施例5)另外，正常功能的0sRPA2c基因轉(zhuǎn)化該突變體后植株恢復正常的表型(見實施例6)。
[0015]本發(fā)明還提供了一種利用0sRPA2c基因進行高效植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法。具體地說，本發(fā)明提供了一種含有SEQ ID NO:1所示序列的基因或該基因的部分類似功能片段的載體pC2301-RPA2c (見實施例6所示)。本發(fā)明還有一種涉及含有以上表達載體的宿主細胞。該宿主細胞包括大腸桿菌、農(nóng)桿菌和植物細胞。
[0016]本發(fā)明利用RNAi (RNA干涉)技術(shù)，抑制水稻內(nèi)源0sRPA2c基因的表達，造成轉(zhuǎn)基因水稻的減數(shù)分裂同源重組缺失或受到抑制，導致水稻雄性育型下降，同時產(chǎn)生有限遺傳組成的單倍體配子細胞，這些細胞染色體加倍后即得到純合親本(見實施例7)。具體的說就是將0sRPA2c基因與其它調(diào)控元件，如組成型啟動子(如CaMV35S啟動子)或器官特異性啟動子融合構(gòu)建基因抑制表達載體，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)(如反義RNA或RNAi)創(chuàng)造新的雄性不育系，用于水稻雜交種子的生產(chǎn)。
[0017]實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)步驟如下:
[0018]1.利用已有的水稻T-DNA插入突變體庫(突變體庫的創(chuàng)建方法已經(jīng)公開發(fā)表論文，見 Wu 等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of therice genome.Plant J, 2003:418-427;Zhang 等，Non-random distribution of T-DNAinsertions at various levels of the genome hierarchy as revealed by analyzing13，804T—DNA flanking sequences from an enhancer—trap mutant library.PlantJ, 2007:947-959 )篩選得到一個雌雄不育的突變體材料03Z11CI73，我們將其命名為0Srpa2c，突變體的篩選 鑒定方法見實施例1中詳細描述。
[0019]2.本發(fā)明分析了野生型和突變體0Srpa2C不同減數(shù)分裂時期的小孢子母細胞染色體行為，結(jié)果顯示突變體的雄性不育是由于其減數(shù)分裂異常導致的(見實施例2)。[0020]3.米用 TAIL-PCR 方法(Zhang 等，Non-random distribution of T-DNAinsertions at various levels of the genome hierarchy as revealed byanalyzingl3, 804T-DNA flanking sequences from an enhancer—trap mutant library.Plant J, 2007:947-959)分離osrpa2c突變體的側(cè)翼序列,通過序列分析顯示T-DNA插入0sRPA2c基因的內(nèi)含子中(實施例3)，且T-DNA插入位點與植株的不育表型共分離(實施例4)。0sRPA2c基因在小孢子減數(shù)分裂過程中特異表達(實施例5)。
[0021]4.功能互補實驗(見實施例6)證明本發(fā)明獲得的候選基因0sRPA2c的失活是引起osrpa2c突變表型的原因。
[0022]5.利用RNAi技術(shù)抑制水稻內(nèi)源0sRPA2c基因的表達培育水稻雄性不育系(見實施例7)。
[0023]更詳細的發(fā)明細節(jié)將由《【具體實施方式】》給出。
[0024]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0025]1.本發(fā)明利用T-DNA標簽法分離克隆基因快速、高效。
[0026]2.雖然0sRPA2c基因成員的功能在動物中有過研究，但是在植物中的功能沒有任何報道。本發(fā)明提供了調(diào)控水稻育性基因0sRPA2c及其編碼蛋白。該基因?qū)τ谒居苑肿訖C理等理論研究具有重要的價值。
[0027]3.將含有SEQ ID NO:1所示序列的基因或該基因的部分類似功能的DNA片段進行改造，導入植物體，可以創(chuàng)建減數(shù)分裂同源重組缺失或受到抑制的材料，對水稻的育種有重要的實際應用意義。
[0028]實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下:
[0029]1.大田種植877份Ttl代水稻T-DNA插入突變體，獲得不育的水稻突變體。
[0030]2.利用壓片法觀察了野生型和0Srpa2C突變體中花粉母細胞的減數(shù)分裂過程，結(jié)果表明0Srpa2C突變體不育的最根本原因在于其同源染色體不能形成二價體。
[0031]3.利用TAIL-PCR方法分離不育突變體T-DNA插入位點的側(cè)翼序列，序列分析顯示其中一個家系的T-DNA插入0sRPA2c基因(L0C_0s06g47830)的第四個內(nèi)含子中，該T-DNA的插入完全破壞了 0sRPA2c基因的表達。
[0032]4.通過T-DNA插入與不育突變性狀的共分離驗證和功能互補實驗，證明本發(fā)明獲得的候選基因0sRPA2c基因是控制水稻減數(shù)分裂的基因。
[0033]5.利用RNAi抑制水稻內(nèi)源0sRPA2c基因的表達，創(chuàng)建減數(shù)分裂同源重組受到抑制的轉(zhuǎn)基因雄性不育系。
[0034]更詳細的技術(shù)發(fā)明細節(jié)將由下述實施例給出。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖L.0srpa2c突變體的表型鑒定。圖中A:成熟期野生型(左)與osrpa2c突變體(右)的植株形態(tài)野生型(左)與osrpa2c突變體(右)小花的形態(tài)；C:野生型(左)與osrpa2c突變體(右)花藥的形態(tài)；D:野生型花粉經(jīng)I2-KI染液染色后的形態(tài)；E:0Srpa2c突變體花粉經(jīng)I2-KI染液染色后的形態(tài)，標尺為lOOum。
[0036]圖2..野生型(A到H)和0srpa2c突變體(I到T)中花粉母細胞的減數(shù)分裂過程。圖中:A和I為細線期出和J為偶線期；(:和1(為粗線期山和M為粗線期晚期；D、E、N和O為終變期疋和卩為中期I ;0和1?為后期I ;G和S為末期I出和T為末期II。標尺為5um.[0037]圖3..是osrpa2c突變體的分子鑒定結(jié)果。圖中:
[0038](A) 0sRPA2c的基因結(jié)構(gòu)和T-DNA插入位置示意圖。黑色線條、黑色方框和白色方框分別代表基因的內(nèi)含子、開放閱讀框(ORF)和3’及5’非翻譯區(qū)(UTR);倒黑色三角代表T-DNA ;箭頭代表(C)中所用的引物O1, O2及LBT3和⑶與⑶中所用的引物RTL及RTR的位置。
[0039](B) RT-PCR分析0sRPA2c在野生型(W)和突變體(M)中的表達表明0sRPA2c在突變體中的表達被完全破壞。以Actin做為內(nèi)標。
[0040](C) 一個0sRPA2c T-DNA插入雜合植株后代的基因型檢測。
[0041]圖4.是水稻0sRPA2c基因的表達模式圖。圖中:
[0042](A): qRT-PCR檢測0sRPA2c基因在4星期根(R)、葉(L)、葉鞘(Sh)、莖頂端分生組織(△口01)、莖桿(C)及不同發(fā)育階段的幼穗Icm(Pl)、4cm(P2)、6cm(P3)、llcm(P4)、16cm(P5)、22cm(P6)的表達量。Ubiquitin5基因作為內(nèi)對照。
[0043](B)-(F):0sRPA2c基因在莖頂端分生組織(B)、幼穗(C)、減數(shù)分裂早期花藥(D)、減數(shù)分裂期花藥(E)、四分體時期花藥(F)組織原位雜交結(jié)果。(G)正義探針的陰性對照。SAM，莖頂端分生組織；AM，側(cè)生分生組織；MS，小孢子母細胞；T，絨氈層；Tds，四分體。標尺=20 μ m0
[0044]圖5.是osrpa2c突變體的遺傳互補檢測結(jié)果。圖中:
[0045](A)抽穗后的互補陽性植株(左)和對照植株(右)的形態(tài)。
[0046](B)抽穗時互補陽性植株(左)與對照植株(右)的小花(去除3/4穎殼)形態(tài)比較。
[0047](C)抽穗時互補陽性植株(右)與對照植株(右)花藥形態(tài)比較。
[0048](D)和(E)I2-KI染液中互補陽性植株花粉⑶和對照植株花粉(E)的育性檢測。標尺為lOOum。
[0049](F)和(G)互補陽性植株(F)和對照植株(G)花粉母細胞減數(shù)分裂終變期的染色體行為，標尺為5um。
[0050]圖6.是利用RNAi抑制野生型水稻中內(nèi)源0sRPA2c的表達可以使水稻育性降低的結(jié)果。圖中:
[0051](A)33個獨立轉(zhuǎn)化單株轉(zhuǎn)基因當代(Ttl代，下同)的育性。白色的柱子代表PCR陰性單株。每個單株考察3個穗子的育性，圖中數(shù)據(jù)表示3個穗子育性的平均值，bar代表標準誤。
[0052](B) 32個PCR陽性單株Ttl代的育性分布圖。
[0053](C)利用RT-PCR檢測部分單株的內(nèi)源0sRPA2c基因的表達量。CK為野生型單株。
[0054](D) 一個RNAi單株T1代的育性結(jié)果。圖中數(shù)據(jù)表示3個穗子育性的平均值，bar代表標準誤。
[0055](E)圖D中的單株的PCR檢測結(jié)果。所用引物為RNAi載體特異的引物。
[0056]圖7.是涉及的空載體質(zhì)粒pCAMBIA2301和重組載體pC2301_RPA2C圖譜。其中圖7ASHI空載體質(zhì)粒pCAMBIA2301TUPU ;圖7B是本發(fā)明構(gòu)建的重組載體pC2301_RPA2C圖譜。
【具體實施方式】[0057]本發(fā)明是利用華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室構(gòu)建的水稻T-DNA隨機插入的突變體庫，通過正向遺傳學的方法分離并克隆影響水稻減數(shù)分裂的基因0sRPA2c。該突變體庫的構(gòu)建是按照 Wu et al.(Wu et al.Development of enhancer trap linesfor functional analysis of the rice genome.Plant J, 2003，35:418-427)所描述的方法構(gòu)建而成，我們通過篩選得到一個雌雄不育的突變體材料03Z11CI73，我們將其命名為0Srpa2c，為進一步理解本發(fā)明的內(nèi)容與目的，下面的實施例1將詳細介紹本發(fā)明的具體技術(shù)實施步驟。
[0058]實施例1:突變體的篩選和性狀鑒定
[0059]我們利用已經(jīng)構(gòu)建的突變體材料03Z11CI73 (即osrpa2c)進行試驗，將突變體庫轉(zhuǎn)基因當代(即Ttl代)植株分別分單株收種后，在正常栽培條件下種植下一代即T1代，每份材料(稱為一個家系)種2行，每行10株，共20株，按5X8寸的栽種密度進行種植。水稻整個生育期田間記載每份家系的表現(xiàn)型，對于同一家系內(nèi)突變植株的表型一致、符合典型的3:1分離的家系及時抽提各單株的DNA (按常規(guī)報道的方法)進行PCR陽性檢測，對于一個家系內(nèi)的所有突變體單株P(guān)CR均為陽性的家系作為后續(xù)研究的材料。PCR陽性檢測的引物位于T-DNA區(qū)段上,所用的引物對分別是GV-F:5_ggc ate ggt aaa cat ctg ct_3,GV-R:5-gcc tea aga age tea agt gc_3,得到 PCR 擴增產(chǎn)物大小為 611bp, PCR 反應體系的總體積為20μ 1，DNAl模板Iul (約50ng)、lXTaq酶反應緩沖液、25mM MgCL21.2ul、2mM dNTPl.5ul、10uM 引物 0.2ul、0.3 單位 Taq 酶。反應程序為:94°C變性 5min，94°C 45s、55°C 45s,72°C lmin30cycles，72°C延伸 5min。 [0060]通過本實施例我們得到一個份原始編號為03Z1CI73突變體， 申請人:將該突變體命名為0Srpa2c。該突變體從外觀上看在營養(yǎng)生長期與野生型對照沒有任何區(qū)別。在生殖生長時期，突變體與對照在抽穗期、穗型、小花的形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)等方面也沒有明顯差別，只是表現(xiàn)為完全不育(見圖1中A)。解剖花藥后發(fā)現(xiàn)該突變體的花藥相對野生型的花藥較小(圖1中B和C)。取抽穗期的花粉用1%的I2-KI染色后，顯微觀察如圖1中D及E所示的圖像，其中圖1中的D為野生型對照株的花粉染色結(jié)果，所有花粉都著色，且花粉粒呈正常的圓形，圖1中的E為突變體的花粉染色結(jié)果，所有花粉都不著色，且花粉粒皺褶，形態(tài)不正常，表明該突變體的花粉是不育的。采用有性雜交的方法(按常規(guī)方法)，分別以osrpa2C突變體為父本、母本與野生型水稻品種中花11 (或稱之為ZH11，中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所公開推廣品種)雜交，其結(jié)實率為O (見表1)，說明0srpa2c突變體表現(xiàn)為花粉和胚囊均不育，不能形成可育種子。
[0061]表l0Srpa2c突變體與型品種中花11正反交結(jié)實率統(tǒng)計
[0062]
【權(quán)利要求】
1.一種克隆的OsRPA2c基因在控制水稻育性中的應用，其特征在于，所述OsRPA2c基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.一種克隆的OsRPA2c基因在控制水稻育性中的應用，其特征在于，所述OsRPA2c基因的蛋白質(zhì)的序列如序列表SEQ ID N0:2所不。
3.權(quán)利要求1或2所述的基因的應用，其中包括在調(diào)控水稻減數(shù)分裂中的應用。
4.權(quán)利要求1或2所述的基因的應用，其中包括在培育作物雄性不育系中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK103898124SQ201310290142
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2013年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月10日
【發(fā)明者】吳昌銀, 李興旺, 常玉曉 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學