水稻RPS3a基因及其編碼蛋白的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了水稻RPS3a基因及其編碼蛋白的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。水稻RPS3a基因序列如SEQ ID No.2所示，其編碼蛋白序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明通過(guò)對(duì)水稻突變體sd110圖位克隆得到RPS3a基因。RPS3a基因在水稻植株中廣泛表達(dá)，其中幼嫩組織中表達(dá)量較高。RPS3a基因具有控制水稻葉型、株高等功能，有望對(duì)水稻株型進(jìn)行定向設(shè)計(jì)，改善葉片光合速率，以提高水稻產(chǎn)量。
【專利說(shuō)明】
水稻RPS3a基因及其編碼蛋白的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及水稻RPS3a基因、其編碼蛋白及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上重要的糧食作物之一，隨著耕地面積的減少和人口的增多，培育高 產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的水稻品種成為一個(gè)重要的育種目標(biāo)。水稻葉片的形態(tài)是水稻植株器官發(fā)生和形態(tài) 形成的一個(gè)重要組成部分，直接影響水稻株型和農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的形成。葉片是植物進(jìn)行光合作 用和呼吸作用的主要器官，綠色植物物質(zhì)積累中有90%_95%來(lái)自作物葉片的光合作用，植 物通過(guò)葉片進(jìn)行光合作用，高效吸收光能，最終將光能轉(zhuǎn)化為可供植物生長(zhǎng)所用的生物能， 葉片形態(tài)對(duì)整個(gè)植株的生命活動(dòng)有著重要的影響。因此，葉片性狀成為水稻高產(chǎn)育種及株 型改良過(guò)程中關(guān)注的焦點(diǎn)。
[0003] 目前的高產(chǎn)及超高產(chǎn)水稻品種，包括雜交稻，在葉片形態(tài)上往往表現(xiàn)出葉片較長(zhǎng) 較寬，葉面積較大，但是葉源大的葉片往往因葉脈支持力不足導(dǎo)致葉片披垂，上部葉片的披 垂會(huì)影響整個(gè)植株以至群體的透光情況，最終會(huì)導(dǎo)致光合效率降低，從而影響最終產(chǎn)量。窄 葉在一定程度上有利于保持葉片直立，從而有助于減少葉片披垂。葉片發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的 生物學(xué)過(guò)程，可人為將其劃分為兩個(gè)階段，即葉原基的起始和葉軸性的建立。莖頂端分生組 織（shoot apical meristem，SAM)是植物地上器官，如葉、花和枝節(jié)的發(fā)育源泉，其主要通 過(guò)一系列的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控及激素信號(hào)的改變，使位于頂端的干細(xì)胞群由多潛能性朝著定向分化 的方向發(fā)育，從而在其周邊區(qū)分化出葉原基。再沿著近-遠(yuǎn)軸、基-頂軸和中-側(cè)軸三個(gè)極性 的軸性發(fā)育，最終形成完整的葉片。在這些過(guò)程中發(fā)育發(fā)生異常，將直接或間接地影響葉片 的形態(tài)建成，從而導(dǎo)致各種畸形葉的產(chǎn)生。
[0004] 水稻窄葉突變性狀主要是受質(zhì)量性狀基因控制。目前，根據(jù)Gramene網(wǎng)站和 Oryzabase數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的窄葉突變體大約有11個(gè)，nail，nrll，nal2，nal3，nal4，nal5，nal6， nal7，nal8，nal9，nall0,以單基因控制為主，主要分布在第1、3、4、11、12號(hào)染色體上，且以 第3、4號(hào)染色體居多，其中嫩1^1、嫩1^/3、嫩1^7和順1^1已完成了基因克隆和部分功能分析。
[0005] NAL1編碼一個(gè)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸相關(guān)的植物特異蛋白，能夠影響莖桿維管系統(tǒng)和葉 脈數(shù)目的發(fā)育，該基因突變后可造成植株矮化和窄葉等表型。NAL2/3基因是WUSCHEL-^1&七6(111〇1116〇13(?(1(?)的兩個(gè)同源基因，~41^和~41^分別定位在第11，12號(hào)染色體上。單 獨(dú)nal2和nal3突變體在葉片形態(tài)上沒(méi)有任何缺陷，只有在nal2/3雙突變體中葉片才會(huì)表現(xiàn) 出窄葉，分蘗數(shù)增加，側(cè)根數(shù)變少等性狀，從幼苗期到成熟期，突變體的葉片寬度都明顯變 窄。NAL2/3主要在維管束組織中起作用，研究已表明，NAL2/3是玉米NS1/2基因和擬南芥PRS 基因的直系同源基因，這三個(gè)基因在SAM側(cè)域器官生成細(xì)胞的聚集過(guò)程中起作用。SAM大小 的改變直接影響了葉片生成細(xì)胞的聚集，葉片生成細(xì)胞存在缺陷也極大地影響了葉片最終 形態(tài)。NAL7與OsCOWl(constitutively wilted 1)是等位基因，編碼一個(gè)YUCCA家族蛋白的 含黃素單氧化酶，該酶與YUCCA具有序列同源性，是C0W1的等位基因，能夠通過(guò)調(diào)控植株生 長(zhǎng)素的生物合成，從而影響葉片的寬度。位于第12號(hào)染色體的NRLl(narrow and rolled leaf 1)則編碼一個(gè)纖維素合酶類似蛋白0sCSLD4(cellulose synthase-like protein D4)，能夠影響植物細(xì)胞壁的生物合成，該基因突變后可導(dǎo)致植株出現(xiàn)窄葉微卷表型。
[0006] 此外，還有一些與核糖體發(fā)育相關(guān)的基因突變后也會(huì)使植株表現(xiàn)出生長(zhǎng)延緩，如 葉片變窄等突變性狀。目前水稻中還沒(méi)有關(guān)于編碼核糖體蛋白基因突變影響葉片發(fā)育的報(bào) 道，而在擬南芥中對(duì)此研究的比較深入，已發(fā)現(xiàn)了 48個(gè)核糖體蛋白家族(S2，S3，S6，L4，L5， L6，L7a，L8等），主要研究特殊核糖體蛋白的功能。在某些情況，核糖體蛋白（ribosomal proteins，RPs)基因的突變體影響DNA復(fù)制，RNA加工和DNA修飾。從目前的研究成果看，核糖 體蛋白突變會(huì)引起生長(zhǎng)停滯或延緩，最終導(dǎo)致物種生長(zhǎng)發(fā)育有缺陷。這些都證明了 RPs在蛋 白質(zhì)翻譯過(guò)程中的作用。擬南芥pfll(P〇inted first leaf 1)突變體表現(xiàn)為劍葉變窄，生 長(zhǎng)延緩，根系生長(zhǎng)明顯被抑制，且突變體的生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)了 10天左右。突變體rpl27ac-ld是 半顯性突變體，表現(xiàn)為葉片變尖，胚胎發(fā)育延緩，其胚胎的頂端結(jié)構(gòu)發(fā)育顯著延緩和分生組 織中組織特異性基因的錯(cuò)誤表達(dá)。RPL27aC基因的突變?cè)斐蛇h(yuǎn)軸基因 FILAMENTOUS FLOWER (FIL)的延遲表達(dá)和對(duì)生長(zhǎng)素向外轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN-F0RMED1 (ΡΙΝΙ)的錯(cuò)誤調(diào)控，從而導(dǎo)致子葉 原基在最初和最終生長(zhǎng)表現(xiàn)出延緩發(fā)育。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供水稻RPS3a基因及其編碼蛋白的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明首先提供水稻RPS3a蛋白，其為：
[0009] 1)如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列；或
[0010] 2)SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具 有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
[0011 ]本發(fā)明提供了編碼水稻RPS3a蛋白的基因。
[0012] 進(jìn)一步地，上述基因其具有：
[0013] 1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
[0014] 2)SEQ ID No.2所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸;或
[0015] 3)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
[0016]本發(fā)明提供了含有上述基因的載體。
[0017] 本發(fā)明提供了含有上述載體的宿主細(xì)胞。
[0018] 含有上述述基因或其特異片段的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0019] 本發(fā)明提供了水稻RPS3a蛋白或其編碼基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0020] 優(yōu)選地，所述植物為水稻。
[0021] 本發(fā)明提供了水稻RPS3a蛋白或其編碼基因在水稻遺傳育種中的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明提供了水稻RPS3a蛋白或其編碼基因在水稻種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明提供了水稻RPS3a蛋白或其編碼基因在提高水稻產(chǎn)量中的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明還提供了一種水稻RPS3a基因突變體，水稻RPS3a基因編碼區(qū)的第二內(nèi)含子 5'端拼接點(diǎn)處，由GT突變?yōu)锳T，所述水稻RPS3a基因含有如SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。 [0025]本發(fā)明提供了含有上述基因突變體的生物材料，所述生物材料為載體、宿主細(xì)胞 或表達(dá)盒。
[0026]本發(fā)明提供了檢測(cè)水稻RPS3a基因的特異性引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO .36-37所示。
[0027]本發(fā)明提供了上述特異性引物對(duì)在檢測(cè)水稻RPS3a基因中的應(yīng)用，具體為使用上 述特異性引物對(duì)對(duì)待測(cè)水稻DNA進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增條帶大小為1965bp，則待測(cè)水稻RPS3a基 因?yàn)橐吧?若擴(kuò)增條帶有兩條，且大小分別為789bp和1596bp，則待測(cè)水稻RPS3a基因第二 內(nèi)含子5 '端拼接點(diǎn)處發(fā)生GT突變?yōu)锳T。
[0028]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：（1)本發(fā)明提供了水稻RPS3a基因（核苷酸序列如SEQ ID No.2 所示)及其編碼的蛋白（氨基酸序列如SEQ ID No.1所示）。該基因編碼一個(gè)核糖體蛋白小亞 基，目前在水稻中研究甚少，是一個(gè)新的研究方向。
[0029] (2)通過(guò)轉(zhuǎn)化水稻突變體sdllO,發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出野生型的表型，同時(shí) 通過(guò)轉(zhuǎn)化水稻野生型SD808,發(fā)現(xiàn)RNAi轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出突變體的表型，因而RPS3a基因具 有控制水稻葉型的功能，有望對(duì)水稻葉片的形成進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而對(duì)株型定向設(shè)計(jì)，改善葉片 光合速率，以提高水稻產(chǎn)量。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1為野生型圣稻808與突變體sdlio的表型。A圖為株高;B圖為劍葉葉長(zhǎng);C圖為穗 莖節(jié);D圖為劍葉葉寬;E圖為主莖穗型。
[0031] 圖2為野生型圣稻808與突變體sdlio的葉型。A、B、C圖分別為倒一葉、倒二葉和倒 三葉整體葉型;D、E、F圖分別為倒一葉、倒二葉和倒三葉葉寬。
[0032] 圖3為野生型圣稻808與突變體sdllO的葉脈分析。A，C，E圖分別為野生型倒一、倒 二和倒三葉葉脈;B，D，F(xiàn)圖分別為突變體倒一、倒二和倒三葉葉脈;G圖為大葉脈數(shù)目比較;Η 圖為小葉脈數(shù)目比較。
[0033] 圖4為野生型圣稻808與突變體sdllO的細(xì)胞大小和數(shù)目。A，B，C圖分別為野生型倒 一、倒二和倒三葉下表皮細(xì)胞;D，E，F(xiàn)圖分別為突變體倒一、倒二和倒三葉下表皮細(xì)胞;G圖 為沿葉片寬度方向上葉片下表皮細(xì)胞寬度;Η圖為沿葉片寬度方向上葉片下表皮細(xì)胞數(shù)目。
[0034]圖5為RPS3a圖位克隆結(jié)果與半定量分析。Α圖為目標(biāo)基因的圖位克隆;Β圖為候選 基因 L0C_0s03gl0340的基因結(jié)構(gòu)及突變位點(diǎn);C圖為除Marker外，由左及右分別為野生型基 因組DNA和cDNA、突變體cDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0035]圖6為水稻互補(bǔ)和干擾轉(zhuǎn)基因植株的表型及數(shù)據(jù)分析。A圖互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因整體株型； B-D圖為互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因整體葉片;E-G圖為互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因局部葉片;Η圖為干擾轉(zhuǎn)基因植株；I-K圖 為干擾轉(zhuǎn)基因整體葉片;L-N圖為干擾轉(zhuǎn)基因局部葉片;0圖為植株高度比較;Ρ圖為葉片長(zhǎng) 度比較;Q圖為葉片寬度比較。
[0036]圖7為水稻⑶S_RPS3a基因轉(zhuǎn)化水稻植物的植株染色及定量PCR結(jié)果。Α圖幼葉、Β圖 成熟葉、C-D圖成熟根、E圖幼嫩及成熟分蘗芽、F圖成熟莖干、G-Ι圖幼嫩穗、J圖成熟穗、K圖 不同組織中RPS3A的表達(dá)量比較。
[0037]圖8為RPS3a的亞細(xì)胞定位結(jié)果。A圖為轉(zhuǎn)基因植株整體株型；B圖為轉(zhuǎn)基因植株葉 片表型;C圖為植株高度比較;D圖為葉片長(zhǎng)度比較;E圖為葉片寬度比較;F圖為亞細(xì)胞定位 結(jié)果，A-E圖中，由左及右分別為WT空白對(duì)照，突變體sdl 10及轉(zhuǎn)基因植株1 ine-1、1 ine-2。
【具體實(shí)施方式】
[0038]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0039] 以下實(shí)施例中使用的水稻(Oryza sativa)品種圣稻808(SD808)，秈稻品種Dualr， Shiokari為標(biāo)準(zhǔn)品種，水稻窄葉突變體sdllO來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。
[0040]實(shí)施例1突變體的獲得與表型分析
[0041 ] 突變體sdllO是經(jīng)EMS誘變粳稻品種圣稻808(SD808)得到的。本實(shí)施例中選用甲基 磺酸乙酯(EMS)作為誘變劑，挑選籽粒飽滿的野生型SD808種子置于網(wǎng)袋中，清水浸種8-10h 后，清洗數(shù)次后瀝干，將瀝干的種子浸沒(méi)于新鮮配制的2.0%的EMS溶液中，然后置于28°C恒 溫培養(yǎng)箱中，l〇h后將網(wǎng)袋取出，然后用清水沖洗種子數(shù)次，盡可能洗去殘留在種子表面的 處理液。將種子放入37°C恒溫培養(yǎng)箱中催芽，2-3天出芽后即可移栽至大田育秧。因?yàn)镋MS誘 變劑具有強(qiáng)致癌性，所以進(jìn)行處理時(shí)用特別注意，避免徒手接觸。此外，該誘變劑見(jiàn)光分解， 容易發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，誘變時(shí)應(yīng)注意避光進(jìn)行。突變體sdllO表型上與野生型相比有著多方 面的改變。在成熟期時(shí)，突變體sdl 10主要突變性狀表現(xiàn)在葉片大小上，包括葉長(zhǎng)變短，葉寬 變窄，其中葉片寬度在倒一葉、倒二葉、倒三葉上有不同程度的減少，相對(duì)于野生型分別減 少了30.0 %、50.2 %和64.6 %，倒三葉的突變表型更為嚴(yán)重，三者葉片長(zhǎng)度變化一致，通過(guò) 表型觀察發(fā)現(xiàn)，突變沒(méi)有導(dǎo)致葉片整體形態(tài)發(fā)生變化(見(jiàn)圖2);此外，與野生型相比，突變體 株高也明顯降低50%，主要是穗長(zhǎng)、穗莖節(jié)、第I、Π 、m、iv、v莖節(jié)長(zhǎng)度有不同程度縮短、莖 節(jié)數(shù)目減少造成的，其主莖穗長(zhǎng)及莖節(jié)長(zhǎng)度分別縮短了 22.7 %、33.9%、44.1 %、59.1 %、 68.6 %、80.3 %，在數(shù)目上，突變體缺失了第V莖節(jié)；同時(shí)突變體還表現(xiàn)出主莖穗粒數(shù)減少， 結(jié)實(shí)率降低，但籽粒大小和形狀并無(wú)明顯差異，分蘗數(shù)目也無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖1)。
[0042]實(shí)施例2突變體葉片細(xì)胞學(xué)觀察
[0043]為了明確突變體sdllO葉型在細(xì)胞學(xué)上的變化，本發(fā)明通過(guò)徒手切片和刮除葉片 上表皮細(xì)胞，尋求突變體葉脈與細(xì)胞大小的變化規(guī)律。通過(guò)比較野生型與突變體倒一葉，倒 二葉和倒三葉的大、小葉脈數(shù)目，發(fā)現(xiàn)突變體大葉脈數(shù)目分別減少了5%、14%和14.6%，小 葉脈數(shù)目分別減少了 20.3%、24%和33.9%，數(shù)據(jù)顯示突變體小葉脈數(shù)目的變化幅度比大 葉脈顯著，且在倒三葉上差異率達(dá)到最大，證明突變體sdllO葉片寬度的變化主要是由于小 葉脈數(shù)目減少造成的，同時(shí)在顯微鏡下觀察到突變體倒二、倒三葉片邊緣粗大，推測(cè)突變體 葉片在發(fā)育過(guò)程中存在一定缺陷(見(jiàn)圖3)。此外，又進(jìn)一步研究葉片變窄與葉片下表皮細(xì)胞 大小之間的關(guān)系，在顯微鏡下觀察和測(cè)量細(xì)胞寬度(沿葉片寬度方向），結(jié)合實(shí)際葉片寬度， 計(jì)算出葉片下表皮細(xì)胞數(shù)目。通過(guò)比較不同位置野生型和突變體葉片的細(xì)胞大小和數(shù)目， 發(fā)現(xiàn)突變體的細(xì)胞寬度和細(xì)胞數(shù)目均小于野生型細(xì)胞，突變體的細(xì)胞寬度分別減少了 34.62 %、29.86 %和46.32 %，且在倒三葉變異程度達(dá)到最大，細(xì)胞總數(shù)目分別減少了 52.76%、50.28%和66.94%，且在倒三葉變異程度達(dá)到最大。這些數(shù)據(jù)表明突變體sdl 10倒 三葉表型最為明顯，而且葉片寬度變窄與細(xì)胞寬度縮短、細(xì)胞數(shù)目減少有關(guān)，其中細(xì)胞數(shù)目 減少起關(guān)鍵作用(見(jiàn)圖4)。
[0044]實(shí)施例3水稻RPS3a基因的獲得
[0045]本發(fā)明的RPS3a基因是采用圖位克隆法通過(guò)突變體sdllO克隆得到的。經(jīng)EMS誘變 得到的突變體sd 110經(jīng)過(guò)多代自交種植確認(rèn)該突變具有穩(wěn)定遺傳的特性。純合突變體sd 110 與正常表型的秈稻Dular進(jìn)行雜交，所有雜交Fi中個(gè)體均無(wú)窄葉表型。在內(nèi)種植群體中出現(xiàn) 了明顯分離，通過(guò)調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)在3個(gè)不同群體中野生型與突變體的分離比列符合3:1遺 傳分離比例。（x2〈x2(L()5 = 3.84)。由此可以推測(cè)，該水稻窄葉突變體的突變性狀是由1對(duì)隱性 基因控制的。
[0046] 為了定位控制該窄葉突變體基因的位置，利用突變體sd 110構(gòu)建的F2分離群體作 為定位群體，以BSA(集團(tuán)分離分析)法選取10株?2突變單株構(gòu)建DNA混池，利用能較均勻覆 蓋水稻12條染色體的170對(duì)Inde 1標(biāo)記對(duì)兩個(gè)親本與基因混池進(jìn)行多態(tài)性篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 第3染色體上的標(biāo)記R3-2，R3-3表現(xiàn)出連鎖性，對(duì)10株^突變株進(jìn)行連鎖分析，證明兩個(gè)標(biāo) 記均與目標(biāo)性狀連鎖。用這兩標(biāo)記及兩側(cè)標(biāo)記R3-1與R3-4擴(kuò)增23株內(nèi)群體突變體單株，1?3-1、R3-2、R3-3、R3-4分別篩選出10、1、0、3個(gè)交換單株，說(shuō)明目標(biāo)基因位于標(biāo)記R3-2和R3-3之 間。由于交換個(gè)體較少，且范圍太大，為了能將基因定位在更小的范圍內(nèi)，在R3-2和R3-3之 間設(shè)計(jì)更多新的Indel標(biāo)記，并對(duì)F 2群體232個(gè)突變表型明顯的單株進(jìn)行分析，最終在標(biāo)記 C3-5與C3-6只有2和3株交換個(gè)體，結(jié)果表明該基因位于C3-5和C3-6之間，物理距離為59kb。
[0047] 根據(jù) MSU Rice Genome Annotation Release 7(http:// rice.plantbiology.msu.edu)上提供的基因注釋信息，在定位區(qū)間內(nèi)共有15個(gè)ORFs。其中6 個(gè)表達(dá)蛋白，2個(gè)預(yù)測(cè)蛋白，7個(gè)預(yù)測(cè)功能基因。重點(diǎn)對(duì)7個(gè)預(yù)測(cè)功能基因進(jìn)行測(cè)序分析，并結(jié) 合突變體sdllO的突變性狀，發(fā)現(xiàn)是基因 RPS3a(L0C_0s03gl0340)發(fā)生突變。根據(jù)預(yù)測(cè)的基 因結(jié)構(gòu)，RPS3a基因共有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，基因組全長(zhǎng)3090bp(SEQ ID N0.52)，CDS區(qū) 789 bp，總共編碼262個(gè)氨基酸，該基因編碼一個(gè)核糖體40S小亞基蛋白S3a。在擬南芥中，已 克隆研究了一系列核糖體蛋白（ribosomal protein，RP)基因，它們對(duì)葉片性狀的改變有至 關(guān)重要的作用。
[0048] 通過(guò)對(duì)野生型SD808和突變體sdllO基因組DNA進(jìn)行測(cè)序分析，該突變位點(diǎn)位于第 二內(nèi)含子5'端拼接點(diǎn)處，由GT突變?yōu)锳T，可能導(dǎo)致外顯子不能夠正常拼接。因此本發(fā)明設(shè)計(jì) 一對(duì)cDNA特異性擴(kuò)增引物0sl0340g-CDSF/R，對(duì)野生型SD808基因組DNA、野生型SD808 cDNA、突變體sdllO cDNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)測(cè)條帶大小分別為1965bp(SEQ ID N0.2)， 789bp，1596bp，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)突變體sdllO cDNA有兩條不同大小的條帶，條帶1 是預(yù)測(cè)到的條帶，是由于突變導(dǎo)致內(nèi)含子無(wú)法正常拼接掉，外顯子變長(zhǎng);預(yù)測(cè)外的條帶2則 與野生型SD808 cDNA條帶大小基本一致，疑似突變產(chǎn)生新的拼接錯(cuò)誤。經(jīng)測(cè)序顯示，該基因 在原有的第二內(nèi)含子拼接處前8個(gè)堿基又識(shí)別了一個(gè)新的拼接點(diǎn)。以上結(jié)果表明，突變確實(shí) 導(dǎo)致內(nèi)含子拼接錯(cuò)誤，共分為兩種:一種是由于突變導(dǎo)致第二內(nèi)含子拼接點(diǎn)缺失，造成外顯 子增多；另一種是基因通過(guò)自身修復(fù)識(shí)別到新的拼接點(diǎn)，造成讀碼框錯(cuò)亂，從而氨基酸序列 發(fā)生改變，最終導(dǎo)致蛋白翻譯發(fā)生嚴(yán)重錯(cuò)誤，這兩者都導(dǎo)致基因不能夠正常轉(zhuǎn)錄和翻譯(見(jiàn) 圖5)。引物序列如表1所示，精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)的基因如表2所示。
[0049]表1實(shí)施例3中涉及的引物序列
[0051]表2實(shí)施例3中精細(xì)定位區(qū)間內(nèi)的全部基因及相關(guān)基因信息
[0053]實(shí)施例4 RPS3a蛋白的生物信息學(xué)分析
[0054]本發(fā)明明確基因發(fā)生兩種突變類型后，在進(jìn)行生物信息學(xué)分析時(shí)以第二種基因突 變?yōu)橹?。根?jù)野生型和突變體蛋白質(zhì)序列，利用生物信息學(xué)相關(guān)網(wǎng)站和軟件進(jìn)行了一系列 預(yù)測(cè)分析。首先在 Jpred網(wǎng)站(http: //www. compbio · dundee · ac · uk/ jpred/)上預(yù)測(cè)野生型 核糖體40S小亞基蛋白S3a(RPS3a)二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)RPS3a中只含有最常見(jiàn)的α-螺旋（α-helix)和β折疊 （beta sheet)結(jié)構(gòu)，無(wú)復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)。隨后利用軟件3*188-PdbViewer4.1.0進(jìn)一步預(yù)測(cè)野生型和突變體蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，比較后發(fā)現(xiàn)野生型蛋白質(zhì) 由7個(gè)His α-螺旋和5個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)組成，突變體蛋白質(zhì)僅含有3個(gè)較為短小的α-螺旋和4個(gè)β 折疊結(jié)構(gòu)，由此推測(cè)基因突變后導(dǎo)致蛋白質(zhì)缺失了 3個(gè)長(zhǎng)α_螺旋、一個(gè)小α_螺旋和一個(gè)短小 β折疊結(jié)構(gòu)。由于α_螺旋(α-hel ix)是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式之一，在DNA結(jié)合基序(DNA binding motif)中有非常重要的作用，它的缺失或改變會(huì)嚴(yán)重影響生物體最終形態(tài)，故得 出結(jié)論rps3a基因突變后導(dǎo)致三個(gè)主要a-螺旋結(jié)構(gòu)全部缺失，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重變化，從 而產(chǎn)生突變體嚴(yán)重的葉片和株型表型。
[0055] 將野生型核糖體40S小亞基蛋白S3a(RPS3a)氨基酸序列在NCBI上BLAST，獲得單、 雙子葉植物（Arabidopsis thaliana、Maize、Soybean、Sorghum、Sugar cane、Tobacco、 Medicago)中與其同源性最高的蛋白質(zhì)序列，在MEGA 6中采用Clustal W方法對(duì)序列進(jìn)行比 對(duì)。結(jié)果表明突變?cè)斐晌挥诒Ｊ貐^(qū)域的第55位氨基酸之后的氨基酸序列完全改變，從而導(dǎo) 致了植株形態(tài)發(fā)生明顯變化。進(jìn)化樹(shù)分析得知，該蛋白質(zhì)與其它三個(gè)單子葉植物(Maize、 Sorghum、Sugar cane)同源性最高。
[0056] 實(shí)施例5水稻RPS3a基因的功能驗(yàn)證
[0057]本發(fā)明為了進(jìn)一步驗(yàn)證RPS3a基因功能，分別構(gòu)建了目的基因的功能互補(bǔ)載體和 RNAi干擾載體，并分別轉(zhuǎn)化突變體sdllO和野生型SD808(其中互補(bǔ)載體的構(gòu)建是將目的基 因基因組DNA分為兩個(gè)片段S1和S2,分別使用引物Hubu-S1EBF/R和Hubu-S2BPF/R進(jìn)行擴(kuò)增， 重組到PCAMBIA1305.1載體中。而干擾載體的構(gòu)建是使用引物RNAi-SacIF/R和RNAi-SnaBIF/R將擴(kuò)增的兩個(gè)片段，分別重組到1390RNAi載體中）。最終獲得了7個(gè)轉(zhuǎn)基因功能互 補(bǔ)To代株系和5個(gè)RNAi To代株系。待植株達(dá)到成熟時(shí)，調(diào)查統(tǒng)計(jì)了不同株系的表型數(shù)據(jù)(株 高、不同位置的葉片長(zhǎng)度和寬度），發(fā)現(xiàn)5個(gè)轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)株系的株高和葉片性狀均能夠恢復(fù) 成野生型表型，證明該基因確為目的基因，并且4個(gè)RNAi干擾株系表現(xiàn)出葉片變窄、植株矮 小，與突變體表型相似，進(jìn)一步證實(shí)RPS3a基因功能的缺失確實(shí)能夠產(chǎn)生突變體性狀(見(jiàn)圖 6)〇
[0058]本實(shí)施例中涉及的引物序列如下所示，互補(bǔ)和干擾載體各分兩步構(gòu)建(方框內(nèi)代 表酶切位點(diǎn)）。
[0067] 實(shí)施例6水稻RPS3a基因表達(dá)模式
[0068] 提取粳稻品種日本晴在不同時(shí)期的不同組織（種子、根、莖、莖節(jié)、穎殼、葉片、葉 枕、葉鞘、穗）的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行Rea 1 -1 ime PCR(RT-PCR)，以水稻Ubiqui tiη基因?yàn)?內(nèi)參，檢測(cè)RPS3a基因在水稻不同組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，RPS3a基因廣泛在水稻各組 織中表達(dá)，其中在葉片、葉鞘、莖、種子和穗中的表達(dá)量相對(duì)較高，在種子、莖節(jié)、穎殼中表達(dá) 量較低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證RPS3a基因的時(shí)空表達(dá)模式，本發(fā)明構(gòu)建了 RPS3apr?: GUS載體(構(gòu) 建過(guò)程中使用引物PromENF/R擴(kuò)增目的基因啟動(dòng)子序列，重組到pCAMBIA1305.1載體EcoRI 和Ncol位點(diǎn)中），并轉(zhuǎn)化了水稻Shiokari品種，對(duì)已獲得的2個(gè)To代轉(zhuǎn)基因水稻株系進(jìn)行組 織化學(xué)⑶S染色，結(jié)果兩個(gè)株系均能檢測(cè)到GUS活性。從染色結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，RPS3a在幼嫩組織 中的表達(dá)量比較高，如幼葉，幼穗，幼嫩分蘗芽，根尖和側(cè)根發(fā)生處，尤其在幼穗中的表達(dá)量 極高。在成熟組織中幾乎不表達(dá)，如老葉，成熟莖等(見(jiàn)圖7)。
[0069]本實(shí)施例中涉及的引物序列如下所示(方框內(nèi)代表酶切位點(diǎn)）。
[0072] 實(shí)施例7水稻RPS3a的亞細(xì)胞定位
[0073] 為了準(zhǔn)確進(jìn)行RPS3a的亞細(xì)胞定位，本發(fā)明構(gòu)建了 RPS3a與綠色熒光蛋白基因 GFP 的融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化突變體sdllO,得到Actinpr?:RPS3a-GFP轉(zhuǎn)基因植株（line-l，line- 2)(構(gòu)建過(guò)程中使用引物10340CDSEKF/R擴(kuò)增目的基因 CDS序列，使用引物Act inPromEEF/R 擴(kuò)增Actin基因的promoter，將這兩個(gè)片段重組到pCAMBIA1305.1載體中）。在田間統(tǒng)計(jì)野生 型SD808,突變體sdllO及轉(zhuǎn)基因植株line-1，line-2的農(nóng)藝性狀，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株不論是在 株高，還是葉片長(zhǎng)度、寬度，都恢復(fù)至野生型大小，從而證明該融合表達(dá)載體 Actinpr?RPS3a-GFP 不影響 RPS3a 功能。
[0074]隨后我們提取轉(zhuǎn)基因植株Actinprcim:RPS3a-GFP葉片的原生質(zhì)體，用特異染料染色 后觀察定位結(jié)果。在真核細(xì)胞中，核糖體分為游離在細(xì)胞質(zhì)中的游離核糖體和附著在內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)表面的附著核糖體，并且核糖體的體積較小，大量存在于線粒體、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。由 于核糖體體積小，分布廣，移動(dòng)性強(qiáng)，同時(shí)目前市場(chǎng)上沒(méi)有核糖體特異性染料，故本發(fā)明選 用LifeTechnology公司生產(chǎn)的ER-Tracker Red內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染料進(jìn)行特異性染色，在波長(zhǎng)λ = 587-615nm激發(fā)下，觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈紅色，與GFP綠色熒光信號(hào)融合后呈黃色，最終確定該 蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(見(jiàn)圖8)。
[0075]本實(shí)施例中涉及的引物序列如下所示，分兩步構(gòu)建載體(方框內(nèi)代表酶切位點(diǎn)）。
[0080]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 水稻RPS3a蛋白，其特征在于，其具有： 1) 如SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列；或 2. SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸且具有同 等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因，其具有： 1. SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或 2. SEQ ID No.2所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸;或 3) 在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。3. 含有權(quán)利要求2所述基因的生物材料，所述生物材料為載體、宿主細(xì)胞或表達(dá)盒。4. 權(quán)利要求1所述水稻RPS3a蛋白或其編碼基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1所述水稻RPS3a蛋白或其編碼基因在水稻遺傳育種中的應(yīng)用。6. 水稻RPS3a蛋白或其編碼基因在提高水稻產(chǎn)量中的應(yīng)用。7. -種水稻RPS3a基因突變體，其特征在于，水稻RPS3a基因編碼區(qū)的第二內(nèi)含子5 '端 拼接點(diǎn)處，由GT突變?yōu)锳T，所述水稻RPS3a基因含有如SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。8. 含有權(quán)利要求7所述基因突變體的生物材料，所述生物材料為載體、宿主細(xì)胞或表達(dá) 盒。9. 檢測(cè)水稻RPS3a基因的特異性引物對(duì)，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 36-37所示。10. 權(quán)利要求9所述的特異性引物對(duì)在檢測(cè)水稻RPS3a基因中的應(yīng)用，其特征在于，對(duì)待 測(cè)水稻DNA進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增條帶大小為1965bp，則待測(cè)水稻RPS3a基因?yàn)橐吧?若擴(kuò)增條 帶有兩條，且大小分別為789bp和1596bp，則待測(cè)水稻RPS3a基因第二內(nèi)含子5'端拼接點(diǎn)處 發(fā)生GT突變?yōu)锳T。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK106046132SQ201610575636
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月20日
【發(fā)明人】李學(xué)勇, 龍海馨, 趙金鳳, 袁守江, 房靜靜
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所