黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用，黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，家蠶幼蟲添食黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白后導(dǎo)致家蠶存活率降低，表明該基因是一個可導(dǎo)致鱗翅目昆蟲家蠶致死的毒性蛋白，能夠用于制備生物農(nóng)藥殺蟲劑，特別是抗鱗翅目害蟲的生物農(nóng)藥殺蟲劑，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白，還涉及含黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的重組表達(dá)載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌是植物、動物和人類的主要病原微生物之一，而毒素蛋白是其重要的毒力因子，主要類型為穿孔毒素蛋白(Pore-forming toxins,簡稱:PFT)。大多數(shù)細(xì)菌的PFT作用于宿主的細(xì)胞膜，形成孔洞使細(xì)胞內(nèi)外離子平衡，導(dǎo)致細(xì)胞裂解破碎而死亡。目前已鑒定的細(xì)菌穿孔毒素蛋白超過300多種，根據(jù)其插入細(xì)胞膜磷脂雙分子層的結(jié)構(gòu)特征，可以分為a-PFT和β-PFT。其中β-PFT又可以分為smalP-PFT和CDCs兩種類型，它們的結(jié)合細(xì)胞方式、孔道形成機(jī)制和引起靶細(xì)胞反應(yīng)不同。盡管有如此之多的細(xì)菌PFT，但由于絕大多數(shù)的PFT經(jīng)口添食不會導(dǎo)致昆蟲死亡，所以真正在作物抗蟲方面有利用價值的并不常見。目前只有a-PFT的Bt Cry伴孢晶體毒素蛋白和β-PFT的Bt Cyt δ內(nèi)毒素在生物農(nóng)藥殺蟲劑或抵抗害蟲的轉(zhuǎn)基因植物分子育種等方面有產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用。盡管轉(zhuǎn)Bt植物品種的大面積推廣應(yīng)用極大地減輕了蟲害，也減少了農(nóng)藥用量，并在保護(hù)環(huán)境的同時也挽回了大量的經(jīng)濟(jì)損失；但長期使用同一抗性品種也導(dǎo)致了對Bt Cry伴孢晶體毒素蛋白具有抗性的昆蟲相繼出現(xiàn)。因此尋找新的靶標(biāo)基因培育新的抗性品種迫在眉睫，但如何從數(shù)以萬計的病原微生物中鑒定出可以經(jīng)口添食感染導(dǎo)致昆蟲死亡的穿孔毒素蛋白明顯非常困難。
[0003]黑胸敗血芽孢桿菌(Bacillus bombyseptieus,簡稱Bb)是鱗翅目模式昆蟲家蠶的主要細(xì)菌性病原之一，Bb感染家蠶后，在家蠶中腸組織中形成孔洞，進(jìn)而通過這些孔洞侵入血淋巴引起家蠶細(xì)菌性敗血病。有學(xué)者通過電鏡掃描觀察到家蠶中腸上皮在Bb感染后有孔洞形成，暗示Bb產(chǎn)生了穿孔毒素蛋白·且家蠶在感染Bb后會很快死亡，表明Bb的穿孔毒素蛋白具有重要的生物學(xué)功能。因此，對該基因進(jìn)行克隆進(jìn)而對其生物學(xué)功能進(jìn)行研究，將為新的生物殺蟲劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白，本發(fā)明的目的之二在于提供黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的編碼基因；本發(fā)明的目的之三在于提供含有上述編碼基因的重組表達(dá)載體，本發(fā)明的目的之四在于提供含有重組表達(dá)載體的工程菌；本發(fā)明的目的之五在于提供利用所述工程菌制備黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的方法，本發(fā)明的目的之六在于提供黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白在制備生物農(nóng)藥殺蟲劑中的應(yīng)用。
[0005]1.黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0006]2.權(quán)利要求1所述黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的編碼基因。
[0007]優(yōu)選的，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0008]3.含有所述編碼基因的重組表達(dá)載體。[0009]優(yōu)選的，所述重組表達(dá)載體是將SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列連入pET28a載體的BamH I和Xho I酶切位點而得。
[0010]4.含有權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體的工程菌。
[0011]優(yōu)選的，所述工程菌為大腸桿菌BL21。
[0012]5.利用所述工程菌制備黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的方法，將工程菌擴(kuò)大培養(yǎng)后加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，PBS清洗后用液氮反復(fù)凍融，然后超聲波破碎收集沉淀；沉淀分別用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Triton TM X_100、0.1~0.3Mm EDTA的PBS和含2M尿素、IOOmM NaCl的PBS清洗；再用含8M尿素、IOOmM NaCl的PBS重懸沉淀，使包涵體充分溶解；離心收集上清，抽濾，濾液含有尿素的PBS進(jìn)行透析；最后用PBS溶液透析，然后用Ni親和柱純化，用PBS溶液和含有20mM咪唑的PBS洗去未結(jié)合的蛋白后，再分別用含200mM、500mM和IM咪唑的PBS洗脫，最后用PBS溶液透析，得黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白。
[0013]6.所述黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白在制備生物農(nóng)藥殺蟲劑中的應(yīng)用。
[0014]優(yōu)選的，所述黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白在制備抗鱗翅目害蟲的生物農(nóng)藥殺蟲劑中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明克隆得到了黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白Bbtoxin-2,經(jīng)口添食Bb toxin-2毒素蛋白后可導(dǎo)致家蠶死亡,該蛋白是除Bt Cry伴孢晶體
毒素蛋白外唯--個經(jīng)口飼養(yǎng)家蠶可導(dǎo)致家蠶死亡的毒素蛋白，這將為開發(fā)新的生物農(nóng)藥
殺蟲劑提供新的思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
`[0016]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖:
[0017]圖1為黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白在BL21中誘導(dǎo)表達(dá)電泳檢測(1:對照沉淀；2:對照上清；3:16°C誘導(dǎo)20h沉淀；4:16°C誘導(dǎo)20h上清；5:37°C誘導(dǎo)4h沉淀；6:37°C誘導(dǎo)4h上清)。
[0018]圖2為黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白原核表達(dá)純化SDS-PAGE電泳檢測。
[0019]圖3為4齡起家蠶添食Bb toxin-2生存率統(tǒng)計(1:添食等體積PBS的家蠶存活率；2:添食Bb toxin-2毒素蛋白的家蠶存活率)。
[0020]圖4為5齡期家蠶分別添食黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白、PBS和非致病鈣粘蛋白CR12的結(jié)果(A:5齡期家蠶添食黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白生存率統(tǒng)計；B:添食PBS后家蠶存活照片；C:添食非致病鈣粘蛋白CR12后家蠶存活照片；D:添食Bb toxin-2毒素蛋白后家蠶死亡照片)。
【具體實施方式】
[0021]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0022]實施例1、穿孔毒素蛋白Bb toxin-2的鑒定和克隆
[0023]從NCBI上下載目前已報道的α-PFT和β-PFT的蛋白質(zhì)序列，具體如下:嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)氣單胞菌溶素(Aerolysin) (Genbank:AECl2846.1)、腐敗梭菌(Clostridium septicum) α 毒素(Alpha-toxin) (Genbank:AAB32892.1)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) α 毒素(Alpha-toxin) (Genbank:Ρ09616.2)、產(chǎn)胺鏈球菌(Streptococcus pyogenes)溶血性鏈球菌產(chǎn)生的溶血素O (StreptolysinO) (Genbank:Q53957.1)、炭疽桿菌 str.A0174 (Bacillus anthracis str.A0174)anthrolysin O (ALO) (Genbank:EDT69040.1)、單核增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)李斯特菌溶血素(Listeriolysin O) (Genbank:P13128.1)、蜂房芽胞桿菌(Paenibacillus alvei)蜂房桿菌溶素(Alveolysin) (Genbank:Ρ23564.I)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)炭疽毒素(Anthrax toxins) (Genbank:ΝΡ_052806.I)、蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis) Bt CrylAa (Genbank:AAA22353.1)、蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis) Bt Cry2Aa (Genbank: AAA22335.1 )、蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis)Bt Cry3Aa(Genbank:AAA22336.1)、蘇云金芽抱桿菌(Bacillusthuringiensis)Bt Cry4Aa(Genbank:CAA68485.1)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)霍亂弧菌溶細(xì)胞毒素 Vcc (Genbank: BAA09545.1)和白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)白喉毒素(Diphtheria Toxin)(Genbank:NP_938615.1)。然后對 a-PFT 和 β-PFT 的蛋白質(zhì)序列用BLAST軟件比對分析，序列比對分析主要包括:用a-PFT和β-PFT的氨基酸序列運行BLASTP程序檢索Bb基因組數(shù)據(jù)庫，采用檢索標(biāo)準(zhǔn)Ε〈10-1(ι，鑒定Bb穿孔毒素蛋白基因。最終鑒定獲得一個E值為8Ε-34，氨基酸相似性為49%的候選基因(Bb000863)，命名為Bb toxin-2ο
[0024]根據(jù)Bb基因組序列設(shè)計擴(kuò)增Bb toxin-2的特異引物，Bb toxin-2的正向引物:5 1 -atgaaacgttctaaaacatactt-3 1 (SEQ ID N0.1),反向引物51 -ttttttctctactaatttcttattc-31 (SEQ ID N0.2)。以 Bb 基因組 DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5分鐘，然后95°C變性40秒、50°C退火40秒、72°C延伸80秒，共28個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收1000bp左右條帶，然后與PMD19-T Simpl e載體連接,連接反應(yīng)體系嚴(yán)格按照Solution I連接酶使用說明進(jìn)行，連接條件是在16°C條件下連接2小時，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性克隆pMD19-T Simple/Bb toxin-2后測序驗證,測序結(jié)果如SEQ ID N0.3所示,經(jīng)分析克隆的 Bb toxin-2 基因的 CDS 為 101 lbp，編碼 336 個氨基酸(SEQ ID N0.4)。
[0025]實施例2、Bb toxin-2原核表達(dá)、蛋白復(fù)性及純化
[0026]由于全長Bb toxin-2基因的N端含有31個氨基酸的信號肽序列,而信號肽會影響蛋白表達(dá)，因此對Bb toxin-2進(jìn)行原核表達(dá)時去除了該信號肽。然后根據(jù)克隆獲得的全長Bb toxin-2設(shè)計不含信號肽的特異引物,正向引物為:5' -cgggaXcccaaacaacatcgcaagttgt-3/ (SEQ ID N0.5),下劃線為 BamH I 酶切位點，反向引物 5' -cctcgagttattttttctctactaatttcttattc-3' (SEQ ID N0.6)，下劃線為 Xho I 酶切位點，然后以 pMD19_T Simple/Bb toxin-2質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，然后95°C變性40秒、52 °C退火40秒、72°C延伸80秒，共28個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，回收產(chǎn)物用BamHI和Xho I雙酶切，回收Bb toxin-2基因片段，同時將pET28a載體用BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切，回收載體骨架，將回收的Bb toxin-2酶切片段和pET28a骨架片段進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，獲得pET28a/Bb toxin-2重組質(zhì)粒，然后送往華大基因公司測序，將測序確認(rèn)正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)感受細(xì)胞大腸桿菌BL21，加入IPTG至終濃度為0.2mM后在16°C條件下培養(yǎng)20h和37°C條件下培養(yǎng)4小時分別進(jìn)行Bb toxin毒素蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖1所示,結(jié)果顯示Bb toxin-2毒素蛋白主要是以包涵體形式表達(dá)。
[0027]將含pET28a/Bb toxin-2重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21和大腸桿菌Rosetta擴(kuò)大培養(yǎng)后在7000rpm條件下離心10分鐘收集菌體，PBS清洗3次后液氮反復(fù)凍融3次，然后超聲波破碎30min，16000rpm離心30分鐘收集沉淀；沉淀用洗滌液I (含有0.5%Triton TMx-100,0.1- 0.3Mm EDTA的PBS)和洗滌液2 (含有2M尿素，IOOmM NaCl的PBS)分別清洗；再用20-30mL的含有8M尿素，IOOmM NaCl的PBS重懸沉淀，4°C緩慢搖動12小時，使包涵體充分溶解；4°C，16000rpm離心30分鐘，收集上清，上清用0.45 μ m濾膜抽濾后進(jìn)行蛋白復(fù)性。
[0028]Bb toxin-2蛋白復(fù)性:將濾液依次用含有6M、4M、2M和IM尿素的PBS進(jìn)行透析，每隔12小時換液一次；最后用PBS溶液透析4次，每隔6小時換液一次，獲得含復(fù)性Bbtoxin-2毒素蛋白的混合蛋白。
[0029]將含復(fù)性Bb toxin-2毒素蛋白的混合蛋白上柱到用PBS平衡過的Ni親和柱中，分別用30mL PBS溶液和含有20mM咪唑的PBS快速沖洗柱子以洗去未結(jié)合的蛋白，再分別用IOmL含200mM、500mM和IM咪唑的PBS緩慢沖洗柱子并收集洗脫液，大約每2ml收集一管，收集到的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測；純化獲得的Bb toxin-2毒素蛋白用PBS溶液透析36小時，每6小時更換透析液一次，最后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，純化獲得了 Bb toxin-2毒素蛋白，其分子量約為35kda。然后用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其Bb toxin-2穿孔毒素蛋白濃度,結(jié)果顯示Bb toxin-2穿孔毒素蛋白的濃度為:1.49μ g/μ L0 [0030]實施例3、Bb toxin-2毒素蛋白添食鱗翅目昆蟲家蠶的存活率檢測
[0031]鱗翅目昆蟲家蠶DZ品種蠶卵進(jìn)行浸酸(鹽酸比重為1.073，溫度為46°C，時間為5分鐘)以解除滯育，然后置于15°C、85%濕度的黑暗環(huán)境中催青至孵化，將蟻蠶收于高壓滅菌的培養(yǎng)皿中，放置于溫度和濕度分別控制在25°C、80%的生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。
[0032]對4齡期家蠶幼蟲饑餓6小時，以60 μ g/頭經(jīng)口添食純化獲得的Bb toxin-2毒素蛋白，設(shè)置3個重復(fù)區(qū)，每個重復(fù)區(qū)40頭蠶，同時設(shè)置添食相同體積PBS為對照，連續(xù)統(tǒng)計存活率和死亡率，結(jié)果如圖3所示。統(tǒng)計結(jié)果顯示，添食Bb toxin-2毒素蛋白后家蠶幼蟲的死亡率明顯高于添食PBS的對照組，添食Bb toxin-2毒素蛋白的4齡期家蠶的死亡率大約為70%，而對照組的家蠶并沒有出現(xiàn)死亡。
[0033]對5齡期家蠶幼蟲饑餓6小時，以60 μ g/頭經(jīng)口添食純化獲得的Bb toxin-2毒素蛋白，設(shè)置3個重復(fù)區(qū)，每個重復(fù)區(qū)40頭蠶，同時設(shè)置添食相同體積PBS和添食等量的采用相同分離純化方法獲得的非致病鈣粘蛋白CR12的家蠶作為對照區(qū)，連續(xù)統(tǒng)計存活率和死亡率，結(jié)果如圖4A所示。統(tǒng)計結(jié)果顯示，添食Bb toxin-2毒素蛋白后家蠶幼蟲的死亡率明顯高于添食PBS和非致病鈣粘蛋白CR12的對照組，并且添食Bb toxin-2毒素蛋白5齡期家蠶的死亡率大約為50%，而對照組的家蠶并沒有出現(xiàn)死亡；然后觀察添食PBS和非致病鈣粘蛋白CR12后家蠶幼蟲(圖4B和圖4C)以及添食Bb toxin-2毒素蛋白后死亡家(圖4C)。通過添食Bb toxin-2毒素蛋白來觀察Bb toxin-2穿孔毒素蛋白對鱗翅目昆蟲家蠶是否具有致病性。統(tǒng)計結(jié)果表明，添食Bb toxin-2毒素蛋白后家蠶幼蟲的存活率顯著下降，說明鑒定到的Bb toxin-2基因是編碼一個可導(dǎo)致鱗翅目昆蟲家蠶幼蟲致死的毒性蛋白，可作為靶標(biāo)基因應(yīng)用于抗鱗翅目害蟲的轉(zhuǎn)基因作物的分子育種。
[0034]最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種·各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白，其特征在于:氨基酸序列如SEQID N0.4所示。
2.權(quán)利要求1所述黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述編碼基因的核苷酸序列如SEQID N0.3 所示。
4.含有權(quán)利要求2所述編碼基因的重組表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述重組表達(dá)載體是將SEQIDN0.3所示的核苷酸序列連入pET28a載體的BamH I和Xho I酶切位點而得。
6.含有權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體的工程菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述工程菌，其特征在于:所述工程菌為大腸桿菌BL21。
8.利用權(quán)利要求7所述工程菌制備黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白的方法，其特征在于:將工程菌用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，PBS清洗后用液氮反復(fù)凍融，然后超聲波破碎收集沉淀；沉淀分別用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的Triton TM X_100、0.1~0.3Mm EDTA的PBS和含2M尿素、IOOmM NaCl的PBS清洗；再用含8M尿素、IOOmM NaCl的PBS重懸沉淀，使包涵體充分溶解；離心收集上清，抽濾，濾液用含有尿素的PBS透析；最后用PBS溶液透析，然后用Ni親和柱純化，用PBS溶液和含有20mM咪唑的PBS洗去未結(jié)合的蛋白后，再分別用含200mM、500mM和IM咪唑的PBS洗脫，最后用PBS溶液透析，得黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白。
9.權(quán)利要求1所述黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白在制備生物農(nóng)藥殺蟲劑中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述黑胸敗血芽孢桿菌穿孔毒素蛋白在制備抗鱗翅目害蟲的生物農(nóng)藥殺蟲劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01N47/44GK103626854SQ201310629013
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】程廷才, 林平, 金盛凱, 常懷譜, 夏慶友 申請人:西南大學(xué)