一種篩選高含量功能成分石斛培養(yǎng)物的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供篩選高含量功能成分石斛培養(yǎng)物的方法和提高石斛組培苗中的多糖和/或石斛堿的方法以及用于實(shí)施所述方法的套盒。本發(fā)明的方法包括種子預(yù)處理步驟，包括用NaCl和/或甘露醇處理無(wú)菌石斛種子；種子誘導(dǎo)萌發(fā)步驟，包括在含有NaCl和/或甘露醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)種子，使種子萌發(fā)后形成原胚體；和種胚愈傷組織的誘導(dǎo)增殖步驟，包括用愈傷組織增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)所述原胚體，形成細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織，從而獲得石斛組培物。本發(fā)明的套盒含有用于實(shí)施本發(fā)明方法的各種培養(yǎng)基。采用本發(fā)明方法和套盒，可獲得生長(zhǎng)健壯、代謝旺盛的組培苗，其主要功能成分多糖和石斛堿含量高于普通組培苗，且可穩(wěn)定遺傳，可作為優(yōu)良的種苗繁殖來(lái)源。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種篩選局含量功能成分石斛培養(yǎng)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種石斛高含量培養(yǎng)物的篩選方法及用途?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]石斛是我國(guó)名貴中藥材，位居“中華九大仙草”之首，具有良好的抗衰老、抗腫瘤、降低血糖和提高免疫等功能，為歷代養(yǎng)生保健人士所追崇，具有巨大的市場(chǎng)需求，但石斛自身生長(zhǎng)緩慢，生境要求苛刻，加上過(guò)量開(kāi)采挖掘，野生資源已瀕臨滅絕，1987年被國(guó)家列為重點(diǎn)保護(hù)的珍稀瀕危藥用植物。開(kāi)展與擴(kuò)大人工種植，既能起到保護(hù)資源，又能實(shí)現(xiàn)合理利用，是一舉多得的可持續(xù)化發(fā)展之路。目前石斛的組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)比較成熟，規(guī)?；斯しN植技術(shù)已在我國(guó)的一些地方取得突破，但在培養(yǎng)種植中石斛藥材品質(zhì)參差不齊，多糖和石斛堿等功能成分含量高的上品石斛種質(zhì)材料的篩選及培育仍然是目前亟待解決的問(wèn)題。
[0003]藥材的品質(zhì)一方面取決于原藥材本身的遺傳特性，另一方面也受到生長(zhǎng)環(huán)境因子的影響。植物在生長(zhǎng)中，容易受到各種環(huán)境因子脅迫，包括生物脅迫與非生物脅迫。在應(yīng)對(duì)外界環(huán)境脅迫時(shí)，植物本身并不是被動(dòng)接受，它會(huì)產(chǎn)生各種復(fù)雜機(jī)制的應(yīng)激響應(yīng)，這種響應(yīng)既包括信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控，也包括代謝合成的調(diào)控。藥材中功能成分主要都是植物生命活動(dòng)中的一些次生代謝產(chǎn)物，如多糖，類(lèi)黃酮，生物堿等。已有大量研究表明，在藥材的培養(yǎng)中通過(guò)添加外源的誘導(dǎo)子，如內(nèi)生菌、信號(hào)分子或前體分子可刺激功能成分的合成，同時(shí)一些外源刺激如光、溫、聲波等，也可促進(jìn)某些功能成分的合成。但是，這些功能成分的合成都是來(lái)源于誘導(dǎo)刺激的產(chǎn)物，不能穩(wěn)定的遺傳。因此，需要研發(fā)一種篩選培育高含量功能成分石斛材料，且穩(wěn)定遺傳的方法。
[0004]石斛蒴果中含有數(shù)萬(wàn)至數(shù)十萬(wàn)粒種子，種子細(xì)小呈粉末狀，不含胚乳組織，自然條件下需要與真菌共生才能萌發(fā)，自然條件萌發(fā)率小于5%。石斛主要以異花授粉為主，自花授粉的成功率低，所形成的大量種胚(子)發(fā)育并不完全，同一植株的不同種子間存在遺傳信息(背景)個(gè)體差異，通過(guò)連續(xù)的逆境脅迫培養(yǎng)，生命力旺盛的個(gè)體得以生存，存活組培苗生長(zhǎng)強(qiáng)壯，代謝旺盛，代謝產(chǎn)物多糖`和石斛堿的含量亦會(huì)增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種高含量功能成分石斛組培物的篩選方法，通過(guò)從種子萌發(fā)到芽簇形成長(zhǎng)期再生過(guò)程中給予生長(zhǎng)逆境脅迫，進(jìn)行連續(xù)篩選，最終可以獲得一批生長(zhǎng)健壯、代謝旺盛的組培苗，其主要功能成分多糖和石斛堿含量高于普通組培苗，且可穩(wěn)定遺傳，作為優(yōu)良的種苗繁殖來(lái)源。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)安全有效的方式穩(wěn)定提高石斛組培苗中的功能成分含量，大大提高石斛組培苗的藥用或食用價(jià)值，在完全人工可控的環(huán)境下生產(chǎn)無(wú)菌苗，直接用于生產(chǎn)鮮加工產(chǎn)品。
[0007]本發(fā)明方法可通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn):收集石斛成熟蒴果，獲得大量種子進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)，獲得的原球莖細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行振蕩培養(yǎng)增殖，增殖的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)誘導(dǎo)芽簇分化，在上述從種子萌發(fā)到芽簇分化的過(guò)程中，始終加以一定濃度的鹽分(NaCl )、甘露醇、低氮等逆境脅迫篩選，最終獲得的芽簇在去除篩選壓的分化培養(yǎng)基上促其分化成芽簇群，跟蹤檢測(cè)芽簇的石斛多糖和石斛堿含量，獲得有效成分含量高、繼代穩(wěn)定性好的石斛組培苗。
[0008]本發(fā)明篩選石斛組培物的方法包括以下步驟:
[0009](1)種子預(yù)處理步驟，包括用NaCl和/或甘露醇處理無(wú)菌石斛種子；
[0010](2)種子誘導(dǎo)萌發(fā)步驟，包括在含有NaCl和/或甘露醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)種子，使種子萌發(fā)后形成原胚體；和
[0011](3)種胚愈傷組織的誘導(dǎo)增殖步驟，包括用愈傷組織增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)所述原胚體，形成細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織，從而獲得石斛組培物。
[0012]本發(fā)明提高石斛組培苗中的功能成分含量，例如多糖和石斛堿，的方法包括以下步驟:
[0013](1)種子預(yù)處理步驟，包括用NaCl和/或甘露醇處理無(wú)菌石斛種子；
[0014](2)種子誘導(dǎo)萌發(fā)步驟，包括在含有NaCl和/或甘露醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)種子，使種子萌發(fā)后形成原胚體；和
[0015](3)種胚愈傷組織的誘導(dǎo)增殖步驟，包括用愈傷組織增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)所述原胚體，形成細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織，從而獲得石斛組培物。
[0016]上述方法的進(jìn)一步實(shí)施方式中還包括以下一個(gè)或多個(gè)【具體實(shí)施方式】的任意組合。
[0017]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述方法還包括:
[0018](4)無(wú)性繁殖體系的建立步驟，包括在含有NaCl的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織，形成牙簇群；和
[0019](5)篩選獲得石斛組培苗的步驟，包括重復(fù)繼代所述牙簇群3 — 5次并逐步降低激素水平直到芽簇適應(yīng)無(wú)激素生長(zhǎng)，進(jìn)行多糖和石斛堿含量測(cè)定，篩選多糖和石斛堿含量高、繼代穩(wěn)定的材料作為石斛組培苗。
[0020]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，取未開(kāi)裂的野生鐵皮石斛蒴果獲得石斛種子。
[0021]在一個(gè)具體實(shí)施例中，石斛蒴果經(jīng)75%乙醇處理I 一 3分鐘后，進(jìn)行表面滅菌。
[0022]在一個(gè)具體實(shí)施例中，用1%次氯酸鈉或滅菌靈對(duì)石斛蒴果進(jìn)行表面滅菌15-20分鐘。
[0023]在一個(gè)具體實(shí)施例中，滅菌后獲得種胚，用無(wú)菌水適量制成種子懸液，在種子懸液中加入終濃度0.2-0.3%NaCl (質(zhì)量體積百分比濃度)和/或0.1-0.3mol/L甘露醇，進(jìn)行脅迫處理。
[0024]在一個(gè)具體實(shí)施例中，在4-10°C脅迫處理3-5天。
[0025]在一個(gè)具體實(shí)施例中，將經(jīng)脅迫處理的種子轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基用2/3MS培養(yǎng)基配制，含有400-600mg/L水解干酪素(CH)、400-600mg/L萘乙酸(NAA)、400-600mg/L吲哚乙酸(IAA)、2_4%蔗糖和0.4-0.8%瓊脂(質(zhì)量體積百分比濃度，下同)，所述培養(yǎng)基還含有0.2-0.3% NaCl和/或0.1-0.3mol/L甘露醇。
[0026]在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選含有500mg/L的水解干酪素、500mg/L的萘乙酸和500mg/mL的吲哚乙酸。
[0027]在一個(gè)具體實(shí)施例中，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)萌發(fā)30-60天，優(yōu)選40-50天。
[0028]在一個(gè)具體實(shí)施例中，液體愈傷組織增殖培養(yǎng)基以2/3N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，其中N元素含量降至正常量的1/10，且所述培養(yǎng)基含有400-600mg/L水解干酪素、400-600mg/L谷氨酰胺、0.3-0.6mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)、0.05-0.15mg/L NAA、和 2-3% 蔗糖。
[0029]在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述液體愈傷組織增殖培養(yǎng)基含有500mg/L的水解干酪素、500mg/L谷氨酰胺、0.5mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸和0.lmg/L NAA。
[0030]在一個(gè)具體實(shí)施例中，將誘導(dǎo)萌發(fā)產(chǎn)生的原胚體轉(zhuǎn)移值所述液體愈傷組織增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)。
[0031]在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述暗培養(yǎng)持續(xù)I 一 2個(gè)月，且培養(yǎng)初期每3天繼代一次，培養(yǎng)2周后，改為每周繼代一次。
[0032]在一個(gè)具體實(shí)施例中，暗培養(yǎng)后用分化培養(yǎng)基進(jìn)行脅迫篩選前還包括用60-100mg/L (優(yōu)選80-90mg/L)的平陽(yáng)霉素處理收集得到的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織18-28小時(shí)(優(yōu)選24小時(shí))。
[0033]在一個(gè)具體實(shí)施例中，用于進(jìn)行脅迫篩選的分化培養(yǎng)基以2/3N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加有400-600mg/L CH,0.03-0.08mg/L NAA,0.5-1.5mg/L6_糠氨基嘌呤(ΚΤ)、0.3-0.8mg/L6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)、1-3%蔗糖、0.5-0.8%瓊脂，以及 0.2-0.3% NaCl0
[0034]在一個(gè)具體實(shí)施例中，本發(fā)明的分化培養(yǎng)基中，CH的濃度為500mg/L、NAA為0.05mg/L、KT 為 1.0mg/L、6_BA 為 0.5mg/L、蔗糖為 2%、和瓊脂為 0.6%?
[0035]在一個(gè)具體實(shí)施例中，脅迫篩選在20-25 °C、光照條件下進(jìn)行30-60天，優(yōu)選40_50天，形成芽簇群。
[0036]本發(fā)明提供的篩選方法，是根據(jù)生命體活力差異，在逆境下通過(guò)大量選擇淘汰發(fā)育不良、生活力差的群體，使具有優(yōu)良遺傳性狀的個(gè)體得以保留，這些個(gè)體能適應(yīng)逆境脅迫，具有較強(qiáng)的代謝合成能力，能夠產(chǎn)生較多的次生代謝產(chǎn)物，這種表現(xiàn)使得人們能夠通過(guò)篩選培養(yǎng)后獲得具有高含量功能成分的組培苗。
【具體實(shí)施方式】
[0037]1.培養(yǎng)基
[0038]本發(fā)明使用到的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)。MS培養(yǎng)基的配方如下表1所不(單位:mg/L):
[0039]表1
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種篩選石斛組培物的方法，該方法包括以下步驟: (1)種子預(yù)處理步驟，包括用NaCl和/或甘露醇處理無(wú)菌石斛種子； (2)種子誘導(dǎo)萌發(fā)步驟，包括在含有NaCl和/或甘露醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)種子，使種子萌發(fā)后形成原胚體；和 (3)種胚愈傷組織的誘導(dǎo)增殖步驟，包括用愈傷組織增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)所述原胚體，形成細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織，從而獲得石斛組培物。
2.一種提高石斛組培苗中的多糖和/或石斛堿的方法，該方法包括以下步驟: (1)種子預(yù)處理步驟，包括用NaCl和/或甘露醇處理無(wú)菌石斛種子； (2)種子誘導(dǎo)萌發(fā)步驟，包括在含有NaCl和/或甘露醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)種子，使種子萌發(fā)后形成原胚體；和 (3)種胚愈傷組織的誘導(dǎo)增殖步驟，包括用愈傷組織增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)所述原胚體，形成細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織，從而獲得石斛組培物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法還包括: (4)無(wú)性繁殖體系的建立步驟，包括在含有NaCl的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織，形成牙簇群；和 (5)篩選獲得石斛組培苗的步驟，包括重復(fù)繼代所述牙簇群3- 5次并逐步降低激素水平直到芽簇適應(yīng)無(wú)激素生長(zhǎng)，進(jìn)行多糖和/或石斛堿含量測(cè)定，篩選多糖和/或石斛堿含量高、繼代穩(wěn)定的材料作為石斛組培苗。
4.如權(quán)利要求1一 3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述種子預(yù)處理步驟包括:滅菌石斛蒴果后獲得種胚，用無(wú)菌水適量制成種子懸液，在種子懸液中加入終濃度0.2-0.3%NaCl (質(zhì)量體積百分比濃度)和/或0.1-0.3mol/L甘露醇，進(jìn)行脅迫處理。
5.如權(quán)利要求1一 4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述種子誘導(dǎo)萌發(fā)步驟包括:將經(jīng)脅迫處理的種子轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基用2/3MS培養(yǎng)基配制，含有400-600mg/L 水解干酪素(CH)、400-600mg/L 萘乙酸(NAA)、400-600mg/L 吲哚乙酸(IAA)、質(zhì)量體積百分比濃度為2-4%的蔗糖和0.4-0.8%的瓊脂，所述培養(yǎng)基還含有質(zhì)量體積百分比濃度為0.2-0.3%的NaCl和/或0.1-0.3mol/L甘露醇。
6.如權(quán)利要求1一 5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述液體愈傷組織增殖培養(yǎng)基以N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配制，其中，N6培養(yǎng)基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機(jī)元素不變，且N元素含量降至正常量的1/10，且所述培養(yǎng)基含有400-600mg/L水解干酪素、400-600mg/L 谷氨酰胺、0.3-0.6mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)、0.05-0.15mg/L NAA 和2-3%鹿糖。
7.如權(quán)利要求3— 6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，用分化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)前還包括用60-100mg/L (優(yōu)選80-90mg/L)的平陽(yáng)霉素處理從步驟(3)收集得到的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織18-28小時(shí)(優(yōu)選24小時(shí))。
8.如權(quán)利要求3- 7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分化培養(yǎng)基以2/3N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配制，其中，N6培養(yǎng)基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機(jī)元素不變，并添加有 400-600mg/L CH、0.03-0.08mg/L NM,0.5-1.5mg/L6_糠氨基嘌呤(ΚΤ)、0.3-0.8mg/L6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)、1-3 %蔗糖、0.5-0.8 %瓊脂，以及0.2-0.3 % NaCl和/或0.1-0.3mol/L 甘露醇。
9.一種套盒，其特征在于，所述套盒含有: (O誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基用2/3MS培養(yǎng)基配制，含有400-600mg/L水解干酪素(CH)、400-600mg/L萘乙酸(NAA)、400-600mg/L吲哚乙酸(IAA)、質(zhì)量體積百分比濃度為2-4%的蔗糖和0.4-0.8%的瓊脂，所述培養(yǎng)基還含有質(zhì)量體積百分比濃度為0.2-0.3%的NaCl 和 / 或 0.1-0.3mol/L 甘露醇； (2)液體愈傷組織增殖培養(yǎng)基，所述液體愈傷組織增殖培養(yǎng)基以N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配制，其中，N6培養(yǎng)基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機(jī)元素不變，且N元素含量降至正常量的1/10，且所述培養(yǎng)基含有400-600mg/L水解干酪素、400-600mg/L谷氨酰胺、0.3-0.6mg/L2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D)、0.05-0.15mg/L NAA 和 2-3% 蔗糖；和 (3)分化培養(yǎng)基，所述分化培養(yǎng)基以2/3N6培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配制，其中，N6培養(yǎng)基的大量元素減少1/3，而微量元素、鐵鹽和有機(jī)元素不變，并添加有400-600mg/L CH、0.03-0.08mg/L NAA、0.5-1.5mg/L6-糠氨基嘌呤(KT)、0.3-0.8mg/L6_BA (6-芐氨基腺嘌呤)、1-3%蔗糖、0.5-0.8%瓊脂，以及 0.2-0.3% NaCl 和 / 或 0.1-0.3mol/L 甘露醇。
10.如權(quán)利要求9所述的套盒，其特征在于，所述套盒還含有用于實(shí)施權(quán)利要求1一 8中任一項(xiàng)所述方法中的用于種子預(yù)處理的NaCl、 甘露醇或其混合物，以及平陽(yáng)霉素。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103636503SQ201310686855
【公開(kāi)日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月13日
【發(fā)明者】劉成洪, 黃劍華, 王亦菲, 陳志偉, 陸瑞菊, 杜志釗, 何婷, 高潤(rùn)紅, 徐紅衛(wèi), 郭桂梅 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院