Dna甲基化抑制劑在提高玉米父本單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】DNA甲基化抑制劑在提高玉米父本單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率中的應(yīng)用，涉及玉米育種領(lǐng)域，解決了在現(xiàn)有方法中通過(guò)單倍體誘導(dǎo)系之間雜交或者誘導(dǎo)系與普通系雜交，后在雜交后代中選育優(yōu)良誘導(dǎo)系、提高單倍體誘導(dǎo)效率時(shí)存在的操作復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、見效慢的問(wèn)題。該應(yīng)用為采用DNA甲基化抑制劑處理玉米父本單倍體誘導(dǎo)系。本發(fā)明利用DNA甲基化抑制劑處理玉米誘導(dǎo)系，經(jīng)過(guò)處理后玉米誘導(dǎo)系的單倍體誘導(dǎo)效率顯著提高；只需要一步藥劑處理工作就能提高玉米誘導(dǎo)系的單倍體誘導(dǎo)效率，不需要復(fù)雜的篩選和純化過(guò)程，操作簡(jiǎn)便，具有短時(shí)高效的明顯優(yōu)勢(shì)。
【專利說(shuō)明】DNA甲基化抑制劑在提高玉米父本單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及玉米育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種DNA甲基化抑制劑在提高玉米父本單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米育種過(guò)程的核心是優(yōu)良自交系的選育。傳統(tǒng)的方法是利用多代自交選育自交系，利用該方法獲得相對(duì)純合的自交系至少需要6至8代，所需時(shí)間較長(zhǎng)。
[0003]當(dāng)某些遺傳材料通過(guò)有性雜交能誘導(dǎo)對(duì)方產(chǎn)生較高頻率的單倍體時(shí)，將該遺傳材料稱之為單倍體誘導(dǎo)系。玉米父本單倍體誘導(dǎo)系(簡(jiǎn)稱誘導(dǎo)系)是一種特殊的玉米材料，利用其做父本對(duì)其他品系雜交授粉時(shí)可以產(chǎn)生一定比例的單倍體，后經(jīng)過(guò)染色體加倍即可以獲得純系。
[0004]基于誘導(dǎo)系的單倍體誘導(dǎo)技術(shù)可以在兩個(gè)世代內(nèi)得到一個(gè)純合的自交系，能夠大大提高玉米育種的效率，是加速良種繁育的有效途徑。為了對(duì)誘導(dǎo)系進(jìn)一步優(yōu)化，國(guó)內(nèi)外研究人員開展了大量相關(guān)研究:“Stock6”是在玉米中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)誘導(dǎo)系；1978年，Aman等發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)選擇大幅度提高Stock6誘導(dǎo)單倍體的頻率(Aman MA, Sarkar KR.Selectionfor haploidy inducing potential in maize.1ndian J Genet, 1978, 38:452-457.);宋同明等用高油玉米改良群 體BHO和Stock6雜交，經(jīng)多代自交和測(cè)交選育出“農(nóng)大高誘I號(hào)”誘導(dǎo)系(劉志增，宋同明，騰文濤，薛國(guó)賓，劉麗娟.玉米孤雌生殖誘導(dǎo)系的選育方法研究.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，5:56-57.) ;Chalyk等用KMS和ZMS雜交作為基礎(chǔ)材料，后自交選育出誘導(dǎo)率達(dá)6.5%、籽粒標(biāo)記明顯的誘導(dǎo)系MHI (KMS和ZMS都是Stock6的衍生系)(Chalyk ST.Creating new hap1id-1nducing lines of maize.Maize Genet CoopNewslett.1999，73:53-54.);德國(guó)育種家利用俄羅斯的誘導(dǎo)綜合種KEMS與法國(guó)的WS14雜交，育成了誘導(dǎo)系 RWS (Rober FK, Gordillo GA, Geiger HH.1n vivo haploid inductionin maize-performance ofnew inducers and significance of doubled haploid linesin hybrid breeding.Maydica.2005, 50:275-283.);陳紹江等在“農(nóng)大高誘 I 號(hào)”的基礎(chǔ)上選育出二代誘導(dǎo)系(陳紹江，黎亮，李浩川，玉米單倍體育種技術(shù).北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2009.);才卓等用田間可自發(fā)產(chǎn)生單倍體植株、籽粒帶有紫斑的M278與Stock6雜交選育的“吉高誘系3號(hào)”(才卓，徐國(guó)良，劉向輝，董亞琳，代玉仙，李淑華.玉米高頻率單倍體生殖誘導(dǎo)系吉高誘系3號(hào)的選育.玉米科學(xué)，2007，15:1-4.)。
[0005]基于誘導(dǎo)系的單倍體誘導(dǎo)技術(shù)在美國(guó)先鋒公司、孟山都公司、法國(guó)利馬格蘭公司、瑞士先正達(dá)公司和德國(guó)KWS公司等都已大規(guī)模應(yīng)用，單倍體誘導(dǎo)選系正逐步替代傳統(tǒng)選系方法。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2010年美國(guó)先鋒公司通過(guò)單倍體誘導(dǎo)技術(shù)培育的玉米核心自交系是過(guò)去80年的總和，德國(guó)KWS公司每年利用單倍體誘導(dǎo)技系可產(chǎn)生1500~2000個(gè)純系，目前國(guó)外大約60%的馬齒型自交系和30%的硬粒型自交系均由單倍體誘導(dǎo)技術(shù)而選育?；谟衩渍T導(dǎo)系的單倍體誘導(dǎo)技術(shù)的一個(gè)難點(diǎn)為單倍體誘導(dǎo)效率低，而單倍體誘導(dǎo)效率又直接影響了育種的進(jìn)程和成本。因此，如何提高單倍體誘導(dǎo)效率是利用單倍體誘導(dǎo)技術(shù)研究的首要問(wèn)題。
[0006]目前，提高誘導(dǎo)系單倍體誘導(dǎo)效率的方法是通過(guò)單倍體誘導(dǎo)系之間雜交或者誘導(dǎo)系與普通系雜交后從雜交后代中選育優(yōu)良誘導(dǎo)系，該方法雖然在一定程度上提高了單倍體誘導(dǎo)效率，但是利用上述方法選育誘導(dǎo)系操作復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，且見效慢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決現(xiàn)有通過(guò)單倍體誘導(dǎo)系之間雜交或者誘導(dǎo)系與普通系雜交后從雜交后代中選育優(yōu)良誘導(dǎo)系提高單倍體誘導(dǎo)效率的方法存在的操作復(fù)雜、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、見效慢的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種DNA甲基化抑制劑在提高玉米父本單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率中的應(yīng)用及方法。
[0008]本發(fā)明為解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案如下:
[0009]DNA甲基化抑制劑在提高玉米父本單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率中的應(yīng)用，采用DNA甲基化抑制劑處理玉米父本單倍體誘導(dǎo)系。
[0010]所述DNA甲基化抑制劑為5-氮雜胞嘧啶核苷或5-氮雜_2，-脫氧胞嘧啶核苷。
[0011]當(dāng)所述DNA甲基化抑制劑為5-氮雜胞嘧啶核苷時(shí)，其使用濃度為10~500 μ Μ。
[0012]本發(fā)明還提供一種提高玉米父本單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率的方法，該方法包括采用DNA甲基化抑制劑處理玉米父本單倍體誘導(dǎo)系的雄穗以提高玉米父本單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率的步驟。
[0013]所述DNA甲基化抑制劑為5-氮雜胞嘧啶核苷或5-氮雜_2’ -脫氧胞嘧啶核苷。
[0014]當(dāng)所述DNA甲基化抑制劑為5-氮雜胞嘧啶核苷時(shí)，其使用濃度為10~500 μ Μ。
[0015]當(dāng)采用DNA甲基化抑制劑處理玉米父本單倍體誘導(dǎo)系的雄穗時(shí)，需要連續(xù)處理5~10天。
[0016]當(dāng)采用DNA甲基化抑制劑處理玉米父本單倍體誘導(dǎo)系的雄穗時(shí)，需要連續(xù)處理7天。
[0017]處理的時(shí)期為玉米父本單倍體誘導(dǎo)系的雄穗分化期，采用DNA甲基化抑制劑處理沒(méi)有散粉的雄穗。
[0018]發(fā)明原理:甲基化是指向底物引入甲基的過(guò)程，一般是以甲基取代氫原子。生物系統(tǒng)中的甲基化是表觀遺傳學(xué)的修飾形式，包括DNA甲基化和蛋白質(zhì)甲基化。DNA甲基化是指在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DNA的CG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，蛋白質(zhì)甲基化一般是指精氨酸或賴氨酸在蛋白質(zhì)序列中的甲基化。
[0019]DNA甲基化抑制劑是指一類能使基因組甲基化水平降低的堿類化合物，包括5-氮雜胞嘧啶核苷和5-氮雜-2’ -脫氧胞嘧啶核苷等，利用DNA甲基化抑制劑處理植株，可以使植株整體甲基化水平降低，出現(xiàn)一些新表型，如亞麻的矮化和早熟，水稻白葉枯抗性，菊花早開花等，深入研究發(fā)現(xiàn)這些植物性狀的改變可能與DNA甲基化抑制劑處理后導(dǎo)致的染色體結(jié)構(gòu)改變、基因表達(dá)及形態(tài)變化和細(xì)胞程序性死亡有關(guān)。
[0020]本發(fā)明的有益效果是:
[0021]1、本發(fā)明利用DNA甲基化抑制劑處理玉米誘導(dǎo)系，對(duì)原有誘導(dǎo)系材料進(jìn)行了改良，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)過(guò)處理后玉米誘導(dǎo)系的單倍體誘導(dǎo)效率顯著提高。[0022]2、本發(fā)明的方法只需要一步藥劑處理工作就能提高玉米誘導(dǎo)系的單倍體誘導(dǎo)效率，不需要復(fù)雜的篩選和純化過(guò)程，操作十分簡(jiǎn)便。
[0023]3、本發(fā)明的方法具有短時(shí)高效的明顯優(yōu)勢(shì)，主要應(yīng)用于玉米育種過(guò)程中。
[0024]4、本發(fā)明中，經(jīng)過(guò)植物DNA甲基化抑制劑處理后的植株在單倍體誘導(dǎo)效率這一性狀上具有一定的遺傳性。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為實(shí)施例1中以“先玉335”作母本檢測(cè)50 μ M的5_氮雜胞嘧啶核苷對(duì)誘導(dǎo)系“單綠”單倍體誘導(dǎo)效率的影響結(jié)果圖；
[0026]圖中:a、b的柱高表示在P=0.05水平上差異顯著。
[0027]圖2為實(shí)施例2中以“鄭單958”作母本檢測(cè)500 μ M的5-氮雜胞嘧啶核苷對(duì)誘導(dǎo)系“單綠”單倍體誘導(dǎo)效率的影響結(jié)果圖； [0028]圖中:a、b的柱高表示在P=0.05水平上差異顯著。
[0029]圖3為實(shí)施例3中以“先玉335”作母本檢測(cè)10 μ M的5_氮雜胞嘧啶核苷對(duì)誘導(dǎo)系“單紫”單倍體誘導(dǎo)效率的影響結(jié)果圖；
[0030]圖中:a、b的柱高表示在P=0.05水平上差異顯著。
[0031]圖4為實(shí)施例4中以“先玉335”作母本檢測(cè)100 μ M的5-氮雜胞嘧啶核苷對(duì)誘導(dǎo)系“單紫”單倍體誘導(dǎo)效率的影響結(jié)果圖；
[0032]圖中:a、b的柱高表示在P=0.05水平上差異顯著。
【具體實(shí)施方式】
[0033]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0034]實(shí)驗(yàn)材料:
[0035]父本材料即誘導(dǎo)系采用由中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所玉米遺傳與分子育種學(xué)科組引進(jìn)國(guó)外基礎(chǔ)材料“st0Ck6”經(jīng)雜交改良選育而成的“單綠”和“單紫”，該材料具有散粉量大、結(jié)實(shí)性較好等優(yōu)良性狀，并且含有紫色籽粒標(biāo)記。
[0036]母本材料采用現(xiàn)有玉米品種中的一種，具體可以選擇“鄭單958”或“先玉335”。
[0037]5-氮雜胞嘧唳核苷購(gòu)自于Sigma-Aldrich。
[0038]實(shí)施例1
[0039]步驟一、播種
[0040]父本材料選擇由中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所玉米遺傳與分子育種學(xué)科組引進(jìn)國(guó)外基礎(chǔ)材料“stock6”經(jīng)雜交改良選育而成的“單綠”，母本材料選擇“先玉335”。
[0041]春季播種，采用常規(guī)大田種植，為了使父母本材料的花期相遇，父本材料和母本材料分別分成兩期播種，即各自種植兩期。
[0042]步驟二、藥物處理
[0043]選取雄穗處于小穗分化期的誘導(dǎo)系“單綠”，將其隨機(jī)分成三組:第一組采用濃度為50 μ M的5-氮雜胞嘧啶核苷水溶液，利用棉浸法處理未散粉的雄穗，連續(xù)處理7天，即為藥物處理組；第二組采用純水，利用棉浸法處理未散粉的雄穗，連續(xù)處理7天，即為水處理對(duì)照組；第三組不做處理，自然生長(zhǎng)至散粉，即為自然生長(zhǎng)對(duì)照組。
[0044]在使用DNA甲基化抑制劑處理玉米誘導(dǎo)系時(shí)藥物濃度和處理時(shí)間也特別重要，如果濃度過(guò)低可能起不到較好的效果，濃度過(guò)高又會(huì)影響植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短也會(huì)帶來(lái)相應(yīng)的影響。
[0045]處理后觀察發(fā)現(xiàn):藥物處理組、水處理對(duì)照組及自然生長(zhǎng)對(duì)照組均能散粉，并且在植株形態(tài)上沒(méi)有顯著差別。
[0046]步驟三、花粉活力的檢測(cè)
[0047]待玉米誘導(dǎo)系雄穗散粉后，采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)對(duì)玉米誘導(dǎo)系的花粉活力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表一。
[0048]表一:50 μ M的5-氮雜胞嘧啶核苷處理對(duì)“單綠”花粉活力的影響
[0049]
【權(quán)利要求】
1.DNA甲基化抑制劑在提高玉米父本單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率中的應(yīng)用，其特征在于，采用DNA甲基化抑制劑處理玉米父本單倍體誘導(dǎo)系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述DNA甲基化抑制劑為5-氮雜胞嘧啶核苷或5-氮雜-2’ -脫氧胞嘧啶核苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，當(dāng)所述DNA甲基化抑制劑為5-氮雜胞嘧啶核苷時(shí)，其使用濃度為10~500 μ M。
4.一種提高玉米父本單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率的方法，其特征在于，該方法包括采用DNA甲基化抑制劑處理玉米父本單倍體誘導(dǎo)系的雄穗以提高玉米父本單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)效率的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述DNA甲基化抑制劑為5-氮雜胞嘧啶核苷或5-氮雜-2’ -脫氧胞嘧啶核苷。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述DNA甲基化抑制劑為5-氮雜胞嘧啶核苷時(shí)，其使用濃度為10~500 μ Μ。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，當(dāng)采用DNA甲基化抑制劑處理玉米父本單倍體誘導(dǎo)系的雄穗時(shí)，需要連續(xù)處理5~10天。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，當(dāng)采用DNA甲基化抑制劑處理玉米父本單倍體誘導(dǎo)系的雄穗時(shí)，需要 連續(xù)處理7天。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，處理的時(shí)期為玉米父本單倍體誘導(dǎo)系的雄穗分化期，采用DNA甲基化抑制劑處理沒(méi)有散粉的雄穗。
【文檔編號(hào)】A01H1/02GK103733979SQ201310717277
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】敖曼, 關(guān)義新, 關(guān)海英, 劉洪禹, 謝琦 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所