一種以幼花為外植體組培繁殖多倍體毛泡桐的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提出了一種以幼花為外植體組培繁殖多倍體毛泡桐的方法，它包括：a.幼花的選擇；b.幼花的前處理和消毒；c.幼花愈傷組織誘導(dǎo)；d.愈傷組織分化培養(yǎng)；e.芽苗分化出根；f.組培苗的移栽；g.組培植株的觀察鑒定。本發(fā)明突出幼花為外植體具有再生能力強(qiáng)、可在冬季至早春進(jìn)行多倍體組培繁殖的優(yōu)勢(shì)，解決了多倍體毛泡桐根段繁殖率低和葉片組培繁殖分化苗頻率不高的問(wèn)題，能夠較大規(guī)模繁殖多倍體毛泡桐，并利用形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)技術(shù)確定組培后代的多倍體真實(shí)性和一致性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種以幼花為外植體組培繁殖多倍體毛泡桐的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以幼花為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)繁殖多倍體毛泡桐的方法，屬于現(xiàn)代林業(yè)的林木新品種選育【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]泡桐是優(yōu)良速生樹(shù)種，花大早開(kāi)，觀賞價(jià)值高。但長(zhǎng)期以來(lái)泡桐靠根段繁殖，這種長(zhǎng)期根繁容易感染“叢枝病”，影響林材質(zhì)量，失去觀賞價(jià)值。特別是 申請(qǐng)人:利用專(zhuān)利技術(shù)200810048497.9 (離體培養(yǎng)和秋水仙素處理結(jié)合選育多倍體毛泡桐的方法)選育出多倍體毛泡桐新品系，具有葉片變厚，葉形變圓，花變大的優(yōu)良特性(湖北省科技成果“克隆和多倍體技術(shù)結(jié)合選育泡桐新品種”，2011年湖北省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng))。但是多倍體毛泡桐原原種植株少，且植株已長(zhǎng)到開(kāi)花年齡，用根段繁殖不僅嚴(yán)重?fù)p傷原原種植株，而且繁殖效率低。本發(fā)明涉及的是一種以幼花為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)而擴(kuò)大繁殖多倍體毛泡桐的技術(shù)，可以克服根段繁殖的困難和大量繁殖多倍體毛泡桐。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是建立以幼花為外植體，通過(guò)組織培養(yǎng)大量繁殖多倍體毛泡桐的技術(shù)。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案為:a.幼花的選擇；b.幼花的前處理和消毒；c.幼花愈傷組織誘導(dǎo)；d.愈傷組織分化培養(yǎng)；e.芽苗分化出根；f.組培苗的移栽；g.組培植株的觀察鑒定。
[0005]本發(fā)明的具 體過(guò)程:
a.幼花的選擇
該發(fā)明采用的組織培養(yǎng)材料是新近選育的多倍體毛泡桐品系，它與一般二倍體毛泡桐品系在形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色體組成上是不同的。它在第一年的11月上旬至次年的4月初進(jìn)行花芽發(fā)育生長(zhǎng)。本發(fā)明應(yīng)用的組織培養(yǎng)外植體是毛泡桐的幼花。采摘時(shí)間為12月上旬至次年的3月下旬。選擇的多倍體毛泡桐的幼花需飽滿、呈黃褐色小紡錘形、無(wú)病蟲(chóng)害。
[0006]b.幼花的前處理和消毒
將著生幼花的多倍體毛泡桐花枝采回，插入裝有35°C~40°C熱水的水瓶中，外罩塑料袋，并放在25°C~28°C的組培室內(nèi)處理3天~4天，以促動(dòng)幼花的發(fā)育；熱水處理完后，采摘下幼花放置在超凈工作臺(tái)上，用解剖刀沿著幼花表面切割去除幼花的黃褐色花萼；然后將幼花進(jìn)行一般消毒處理，無(wú)菌水沖洗3次后，將幼花縱橫切開(kāi)，切成0.5 cm長(zhǎng)的小塊。
[0007]d.幼花愈傷組織誘導(dǎo)
將切開(kāi)的多倍體毛泡桐幼花小塊接種到幼花愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于黑暗，25 °C~26 °C條件下培養(yǎng)，25天~30天幼花小塊切口處產(chǎn)生談黃色愈傷組織，其后逐漸長(zhǎng)大長(zhǎng)多。所述愈傷組織誘導(dǎo) 培養(yǎng)基配方為:MS+8.0 mg/L~16.0 mg/L 6BA+0.3 mg/L~0.9mg/L NAA+3% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ~6.0。
[0008]d.愈傷組織分化培養(yǎng)挑出直徑達(dá)I Cm以上生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織，將它們接種到多倍體毛泡桐愈傷組織分化培養(yǎng)基中置于25°C~26°C，2000 Lx~2500 Lx，光照10-11 h/d。30天~45天后愈傷組織由淡黃變?nèi)辄S色，松緊中等，后逐漸顯現(xiàn)綠點(diǎn)而分化出小芽，并逐漸長(zhǎng)高長(zhǎng)粗壯。愈傷組織分化培養(yǎng)基配方為:MS+6_BA 3.0mg/L ~5.0 mg/L + IBA 1.0mg/L ~2.0 mg/L +2% 鹿糖 +0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ~6.0。
[0009]e.芽苗分化出根
當(dāng)芽苗生長(zhǎng)粗壯，達(dá)到2.5cm~5.0cm高時(shí)，將它們連帶小塊愈傷組織一起或從基部切斷轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，大約15~25天，芽苗基部分化出根。生根培養(yǎng)基配方:1/2MS+IBA 2.5mg/L ~3.0mg/L + 0.01% 活性炭 +2% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ~6.0。
[0010]f.組培苗的移栽
當(dāng)組培苗生長(zhǎng)旺盛、健壯，苗高達(dá)到8.0 cm~15.0 cm時(shí)，將它們連同培養(yǎng)瓶一起轉(zhuǎn)入18°C~20°C室內(nèi)，光照2000 Lx，煉苗3天，然后打開(kāi)瓶蓋，加入無(wú)菌水5 mL，再放置2天，將組培苗移出瓶，用自來(lái)水徹底洗滌，最后在加有1.0%~1.5%高錳酸鉀液中浸5 min，最后移栽到由細(xì)砂土、蛭石和泥炭土 (按3:4:3)比例組成，并滅菌的基質(zhì)中，用1/10MS培養(yǎng)基澆足定根水后，上罩塑料膜，保持相對(duì)濕度80%~90%，溫23°C~25°C，光照1000 Lx~1500Lx, 24 h,此后按一般試管苗方法管理。
[0011]g.組培植株的觀察鑒定
隨著組培苗在移植基質(zhì)中生長(zhǎng)，多倍體毛泡桐將不斷變粗壯并長(zhǎng)高。此時(shí)，觀察組培苗是否表現(xiàn)一致，是否表現(xiàn)出多倍體毛泡桐的葉片形狀(多倍體毛泡桐葉片厚實(shí)，為近圓形)和邊緣缺刻(比二倍體變小)；并觀察葉片的下表皮氣孔密度和氣孔大小，以確定組培苗為多倍體毛泡桐的真實(shí)克隆品系。
[0012]本發(fā)明通過(guò)采用幼花為外植體進(jìn)行多倍體毛泡桐新品系的組織培養(yǎng)繁殖。建立起成熟的組織培養(yǎng)克隆技術(shù)和多倍體形態(tài)、細(xì)胞觀察的鑒定技術(shù)，為大量繁殖多倍體毛泡桐提供了技術(shù)支持。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1多倍體毛泡桐愈傷組織分化出組培苗。
[0014]圖2多倍體毛泡桐植株。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面以實(shí)施例多倍體大花毛泡桐I號(hào)的組培繁殖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0016]a.幼花的選擇
采用新近選育的多倍體大花毛泡桐I號(hào)品系為材料，在2012年12月上旬采摘花枝，花枝上著生飽滿黃褐色紡錘形的幼花。
[0017]b.幼花的前處理和消毒
將采回的花枝插入裝有35°C~40°C熱水的花瓶中，外罩塑料袋，放在26°C~27°C的組培室內(nèi)處理4天。采摘下幼花，在超凈工作臺(tái)上用解剖刀切割去除幼花的黃褐色花萼；然后將幼花放入0.1%升汞處理18 min,無(wú)菌水沖洗3次后，將幼花縱橫切開(kāi)，切成0.5 cm見(jiàn)方的小塊。[0018]c.幼花愈傷組織誘導(dǎo)
將處理好的幼花小塊接種到MS+6-BA 12.0 mg/L + NAA0.6mg/L +3%蔗糖+0.75%瓊脂，PH6.0的幼花愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于黑暗，25°C~26°C條件下培養(yǎng)；25天~30天幼花小塊切口處產(chǎn)生黃色愈傷組織，隨后逐漸長(zhǎng)大長(zhǎng)多。
[0019]d.愈傷組織分化培養(yǎng)
當(dāng)愈傷組織旺盛生長(zhǎng)達(dá)直徑I Cm以上時(shí)，挑出愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS+6-BA3.0mg/L +IBA2.0mg/L +2%蔗糖+0.75%瓊脂，pH6.0的愈傷組織分化培養(yǎng)基中，在25°C~26°C，2000Lx光照10 h/d，黑暗14 h/d條件下培養(yǎng)；30天~45天后愈傷組織由淡黃變成乳黃色，松緊中等，隨后呈現(xiàn)綠點(diǎn)而分化出芽。
[0020]e.芽苗分化出根
當(dāng)芽苗生長(zhǎng)粗壯，達(dá)到3.5cm左右高時(shí)，將它們連同小塊愈傷組織轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，20天左右，芽苗基部分化出根。生根培養(yǎng)基配方為:1/2MS+ IBA 2.5mg/L +0.01%活性炭 +2% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，pH6.0。
[0021]f.組培苗的移栽
當(dāng)組培苗旺盛生長(zhǎng)，苗高到達(dá)10 Cm左右時(shí)，將它們連同培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入18°C~20°C室內(nèi)，光照2000 LX，煉苗3天，然后打開(kāi)瓶蓋加入無(wú)菌水5 mL，再放置2天后，將組培苗移出瓶，用自來(lái)水徹底洗滌，最后再加有1.0%~1.5%高錳酸鉀溶液中浸5 min，最后移栽到由細(xì)砂土、蛭石和泥炭土(3:4:3)組成并滅菌的基質(zhì)中，用1/10MS培養(yǎng)基澆足定根水后，上罩塑料膜，保持相對(duì)濕度80%~90%，溫度23 °C~25 °C，光照1000 LX~1500 LX，24h，此后按一般試管苗方法管理，直至長(zhǎng)成一年生種苗。
[0022]g.組培植株的的觀察鑒定 組培苗經(jīng)過(guò)在移植基質(zhì)中的生長(zhǎng)，多倍體大花毛泡桐I號(hào)將不斷變粗壯并長(zhǎng)高，按I個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月、8個(gè)月，每隔2個(gè)月觀察一次，看組培苗是否表現(xiàn)一致，看它們的葉片形狀是否為近圓形厚葉的多倍體特征，并采葉片下表皮進(jìn)行顯微觀察，看氣孔是否變大、氣孔密度是否變小，確定這些組培苗確實(shí)為多倍體大花毛泡桐I號(hào)的真實(shí)克隆品系。
【權(quán)利要求】
1.一種以幼花為外植體組培繁殖多倍體毛泡桐的方法，其特征在于培育過(guò)程為: a.幼花的選擇 組織培養(yǎng)的材料是新近選育的多倍體毛泡桐品系，其與一般二倍體毛泡桐品系在形態(tài)結(jié)構(gòu)和染色體組成上是不同的，它在11月到次年4月初進(jìn)行花朵發(fā)育，應(yīng)用的外植體是多倍體毛泡桐的幼花，選擇的多倍體毛泡桐的幼花需飽滿、呈黃褐色小紡錘形，無(wú)病蟲(chóng)害； b.幼花的前處理和消毒 將著生幼花的多倍體無(wú)毛泡桐花枝采回，插入裝有35 °C到40 °C熱水的水瓶中，外罩塑料袋并放在25 °C到28 1:的組培室內(nèi)處理3到4天，以促動(dòng)幼花發(fā)育，熱水處理后，采摘下幼花放置在超凈工作臺(tái)上，用解剖刀沿著幼花表面切割去除幼花的黃褐色花萼，然后將幼花進(jìn)行一般消毒處理，無(wú)菌水沖洗3次后，將幼花縱橫切開(kāi)，切成0.5 cm的小塊； c.幼花愈傷組織誘導(dǎo) 將多倍體毛泡桐幼花小塊接種到幼花愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于黑暗、25 V~28V條件下培養(yǎng)，25天~30天幼花小塊切口處產(chǎn)生淡黃色愈傷組織，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+8.0 mg/L~16.0 mg/L 6BA+0.3 mg/L~0.9 mg/L NAA+3%蔗糖+0.75%瓊月旨，pH5.8 ~6.0 ; d.愈傷組織分化培養(yǎng) 挑出直徑達(dá)I cm以上生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織，將它們接種到多倍體毛泡桐愈傷細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，置于25 °C~26 °C, 2000 Lx~2500 Lx，光照10 hr-11 hr，黑暗14 h~13h ；30天~45天后愈傷細(xì)胞由淡黃變 為乳黃色，松緊中等，后逐漸顯現(xiàn)綠色小點(diǎn)而分化出小芽，并逐漸長(zhǎng)高長(zhǎng)粗壯，愈傷組織分化培養(yǎng)基配方為:MS+6-BA 3.0mg/L~5.0 mg/L + IBA1.0mg/L ~2.0 mg/L +2% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ~6.0 ; e.芽苗分化出根 當(dāng)芽苗生長(zhǎng)粗壯，達(dá)2.5 cm~5.0 cm高時(shí)，將它們連帶小塊愈傷組織一起或從基部切斷轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，約15天~25天，芽苗基部分化出根，生根培養(yǎng)基的配方為:1/2MS+IBA 2.5mg/L ~3.0mg/L + 0.01% 活性炭 +2% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ~6.0 ; f.組織苗的移栽 當(dāng)組培苗生長(zhǎng)旺盛健壯，苗高達(dá)到8.0 cm~15.0 cm時(shí)，將它們連同培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入18°C~20 °C室內(nèi)，光照2000 Lx，煉苗3天，然后打開(kāi)瓶蓋加入無(wú)菌水5 mL，再放置2天后，將組培苗移出瓶，用自 來(lái)水徹底洗滌，最后在加有1.0%~1.5%高錳酸鉀液中浸5 min，最后移栽到由細(xì)砂土、蛭石和泥炭土組成并滅菌的基質(zhì)中，用1/10MS培養(yǎng)基澆足定根水后，上罩塑料膜，保持相對(duì)濕度80%~90%，溫度23 °C~25 °C，光照1000 Lx~1500 Lx, 24 h，此后按一般試管苗方法管理； g.組培植株的觀察鑒定 隨著組織苗在移植基質(zhì)中生長(zhǎng)，多倍體毛泡桐將不斷變粗壯長(zhǎng)高，此時(shí)，觀察組培苗是否表現(xiàn)一致，是否表現(xiàn)出多倍體毛泡桐的葉片形狀(多倍體毛泡桐葉片厚實(shí)，為近圓形)和邊緣缺刻(比二倍體變小)，并觀察葉片的下表皮氣孔密度和氣孔大小，以確是組培苗為多倍體毛泡桐的真實(shí)克隆品系。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103704140SQ201310747508
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】蔡得田, 宋兆建, 王維, 張獻(xiàn)華, 何玉池, 劉育華 申請(qǐng)人:湖北大學(xué), 武漢多倍體生物科技有限公司