專利名稱：一種多倍體楊樹的篩選方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多倍體楊樹的篩選方法，具體涉及一種基于微衛(wèi)星標(biāo)記的多倍體楊樹的篩選方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
多倍體育種是植物新品種培育的重要手段，多倍體育種起源于20世紀(jì)初，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于植物新品種的培育中。多倍體由于基因組倍性的增加，往往表現(xiàn)出形態(tài)上的巨大性和抗性增強(qiáng)等特點(diǎn)。其中三倍體還具有不育特點(diǎn)，可以作為轉(zhuǎn)基因育種的良好材料。多倍體的上述特點(diǎn)在林木育種中也具有十分重要的利用價值。如南京林業(yè)大學(xué)培育的三倍體歐洲山楊，其葉和其它器官都比二倍體大，樹高和胸徑生長也更為迅速。據(jù)調(diào)查，在相同立地條件下，這種三倍體歐洲山楊與同齡的二倍體相比，樹高超出11%，胸徑超出10%，材積超出36%。再如北京林業(yè)大學(xué)朱之悌等利用天然2η花粉雜交成功選育出一批速生、質(zhì)優(yōu)的三倍體毛白楊新品種，表現(xiàn)出優(yōu)異的材積生長和木材纖維性狀(李云、馮大領(lǐng)，200幻。國外，Einspahr采用四倍體歐洲山楊與二倍體美洲山楊雜交獲得了遺傳增益顯著的人工異源三倍體山楊，為美國楊樹紙漿材新品種培育做出了重要貢獻(xiàn)。Weisgerber等用四倍體歐洲山楊與二倍體美洲山楊雜交，選育出雜種三倍體“Astria”，這一人工三倍體樹冠狹窄，適應(yīng)性強(qiáng)，對光不敏感，比直接從山楊天然群體中選擇出來的優(yōu)樹生長快，且抗銹病，在生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。
研究表明多倍體楊樹的巨大性一般會伴隨木材纖維細(xì)胞增大，導(dǎo)致單位材積的纖維細(xì)胞數(shù)減少以及細(xì)胞表面積減小，從而使分布于細(xì)胞壁的木質(zhì)素等含量降低，而纖維素含量相應(yīng)增加。在造紙過程中，纖維柔軟易于打漿且交織力強(qiáng)，紙張的抗張力、撕裂度均顯示了較高的水平。同時在制漿中易于蒸煮、軟化及打漿，能耗亦相對較低。在相同制漿條件下，北京林業(yè)大學(xué)報道的三倍體毛白楊磨漿能耗比普通毛白楊約低13% (康向陽，2010)。 楊柳科植物多為二倍體，但在嚴(yán)酷的生境條件下，多倍體楊樹發(fā)生頻率會增加。有研究表明，多倍體能使植物更易適應(yīng)嚴(yán)酷的生長條件，在生活力、環(huán)境適應(yīng)性、抗逆性等方面往往具有明顯優(yōu)勢。如三倍體歐洲山楊更耐干旱瘠薄，更適宜于條件較差的山地栽植，而且還表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病能力(康向陽，2010)。隨著一系列多倍體楊樹的培育成功和在生產(chǎn)中的應(yīng)用，多倍體楊樹育種的價值逐漸顯現(xiàn)。諸多多倍體楊樹實(shí)例表明，可以通過一輪次的育種過程實(shí)現(xiàn)楊樹多目標(biāo)性狀綜合改良，培育出生長快、纖維長、木質(zhì)素低、纖維含量高以及抗逆性強(qiáng)的短周期纖維工業(yè)用材品種，提高工業(yè)利用價值(康向陽，2010)。因此多倍體育種是楊樹良種培育的一個有效途徑。
在多倍體培育方法上，一是對天然多倍體進(jìn)行選擇。雖然楊柳科植物多為二倍體， 但天然群體中多倍體楊樹也時有發(fā)生，特別的白楊派樹種多倍體發(fā)生頻率相對較高，天然多倍體是多倍體育種材料的重要來源。多倍體還可以利用不同倍性的材料通過人工雜交的方法獲得。另外物理或化學(xué)誘導(dǎo)也是獲得多倍體的重要方法。但不管采用何種方法，如何從大量的材料中對多倍體進(jìn)行篩選是多倍體育種中的關(guān)鍵技術(shù)。目前鑒別多倍體的方法有直接鑒別法和間接鑒別法兩種(陳大成，2001)。直接鑒別法包括檢查花粉母細(xì)胞、根尖細(xì)胞或幼葉細(xì)胞的染色體數(shù)目，直接加以判斷。直接鑒別方法雖然可靠，但需對待檢測材料一一進(jìn)行顯微鏡觀察，采用這一方法從大量的材料中篩選多倍體，工作量很大，效率較低。而間接鑒別主要是根據(jù)植株和花粉粒的形態(tài)特征、氣孔大小、保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目以及生理特征等，這種方法主要依賴于經(jīng)驗(yàn)，鑒別準(zhǔn)確率較低。因此發(fā)展簡便、高效的多倍體楊樹篩選技術(shù)對加速多倍體楊樹育種進(jìn)程具有十分重要的意義。發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種簡便、快速的多倍體楊樹的篩選方法，為加速多倍體楊樹育種進(jìn)程，提供關(guān)鍵技術(shù)支撐。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述多倍體楊樹的篩選方法的專用引物。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種多倍體楊樹的篩選方法，其特征在于以待篩選樣品的DNA為模板，在特異性微衛(wèi)星引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物，對產(chǎn)物進(jìn)行電泳，進(jìn)行基因型分析，若擴(kuò)增出的等位基因數(shù)目大于或等于3個，則對應(yīng)樣品為多倍體楊樹，否則不為多倍體楊樹；其中， 特異性微衛(wèi)星引物為以下12對引物中的全部引物
引物對 1 :GACACCGTTTCTTTTCTGAG，ACCAGATCTTCATCTTCCAA ；
引物對 2 TCGAATAGCTGGGATACTTC, TATCACCCGAACAAAAACTC ；
引物對 3 TTACGATCGCCATTATGAA, TCTTTAACCTCCCCTAAACC ；
弓丨物對 4 :AACCTCCAATACCAAGATCA, TGAGAATAAATATTTCGGCAA ；
引物對 5 CCTTAGCCTTCTCACACAAC, GGTCTCCATTTTAGCTGTCA ；
弓丨物對 6 GCCCAAACTCTTATTTGATG, TGGTGGAGGCTAGGATAGTA ；
弓丨物對 7 ATTGCTCTTGCAGAAATCAT，GGATACCAAGTCATCGGTAG ；
引物對 8 :ATCAATTAGACCGGGTTTTT, TGTTCCAGTTCATGCTGATA ；
弓丨物對 9 :ATTGGTCTCGTACCCAAAA, ATTTCCAATGCATATGTTCC ；
弓丨物對 10 :AGAACTTGTGAGGCAGGTAA，AAGCTCTCCCCTAACAAAG ；
引物對 11 :TTATTTGGATCCTGAAATGG，GATGGTTCGGTATGTGAGTT ；
引物對 12 :ACAAAATTTTCGCAAGAAAG, TCTGTTCATGAGAGTGGAA。
其中，PCR反應(yīng)體系為模板DNA 25ng,未標(biāo)記的上游引物和FAM標(biāo)記下游引物各 20ng，200uM dNTP，0. 5U Taq 聚合酶，1. 5uL 含 IOOuM pH 8.3 的 Tris-HCl、500mM KCl、20mM MgCl2和10. Og/L BSA的10 Xbuffer，加滅菌去離子水補(bǔ)充反應(yīng)積到15uL。
其中，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性anin ；94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸 lmin，進(jìn)行30個循環(huán)；72°C延伸5min。
其中，基因型分析在ABI3130測序儀上按如下步驟進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物用滅菌去離子水1 :20稀釋；取IuL稀釋后的反應(yīng)產(chǎn)物，加9uL上樣緩沖液(含91%去離子甲酰胺，9% 450R0X內(nèi)標(biāo))；配制好的上樣產(chǎn)物95°C變性5min后，置于冰上迅速冷卻，然后上機(jī)運(yùn)行；其中，上樣緩沖液含91%體積去離子甲酰胺，含9%體積450R0X內(nèi)標(biāo)。
當(dāng)檢測為多倍體楊樹時，即為三倍體楊樹，三倍體中若在某一位點(diǎn)檢測到3個等位基因，說明該位點(diǎn)等位基因均為雜合；若檢測2個等位基因，說明該位點(diǎn)有兩個等位基因5純合，另一個為雜合；若只檢測1個等位基因，說明該位點(diǎn)3個等位基因均純合。
當(dāng)檢測不為多倍體楊樹時，即為二倍體楊樹，二倍體中若在某一位點(diǎn)檢測到2個等位基因，說明該位點(diǎn)等位基因雜合；若只檢測到1個等位基因，說明該位點(diǎn)2個等位基因純合。
一種多倍體楊樹的篩選方法的專用引物，所述的專用引物是微衛(wèi)星引物，為以下 12對引物中的全部引物
引物對 1 :GACACCGTTTCTTTTCTGAG，ACCAGATCTTCATCTTCCAA ；
引物對 2 TCGAATAGCTGGGATACTTC, TATCACCCGAACAAAAACTC ；
引物對 3 TTACGATCGCCATTATGAA, TCTTTAACCTCCCCTAAACC ；
引物對 4 :AACCTCCAATACCAAGATCA, TGAGAATAAATATTTCGGCAA ；
引物對 5 CCTTAGCCTTCTCACACAAC, GGTCTCCATTTTAGCTGTCA ；
引物對 6 GCCCAAACTCTTATTTGATG, TGGTGGAGGCTAGGATAGTA ；
弓丨物對 7 ATTGCTCTTGCAGAAATCAT，GGATACCAAGTCATCGGTAG ；
引物對 8 :ATCAATTAGACCGGGTTTTT, TGTTCCAGTTCATGCTGATA ；
弓丨物對 9 :ATTGGTCTCGTACCCAAAA, ATTTCCAATGCATATGTTCC ；
引物對 10 :AGAACTTGTGAGGCAGGTAA，AAGCTCTCCCCTAACAAAG ；
引物對 11 :TTATTTGGATCCTGAAATGG，GATGGTTCGGTATGTGAGTT ；
引物對 12 :ACAAAATTTTCGCAAGAAAG, TCTGTTCATGAGAGTGGAA。
在多倍體中，基因組倍性增加會導(dǎo)致不同基因位點(diǎn)等位基因數(shù)目增加。如二位體中，每一位點(diǎn)可檢測到的等位基因數(shù)目最多為二個，而三倍體中，每一位點(diǎn)可檢測到的等位基因數(shù)目最多則為三個。通過對不同基因位點(diǎn)的等位基因數(shù)目進(jìn)行檢測，就可以根據(jù)檢測到的等位基因數(shù)，對待檢樣品進(jìn)行多倍體篩選。通過PCR的方法對不同基因位點(diǎn)的等位基因進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，可以快速完成大量樣本的檢測。該方法的要素主要有二個，一是所用引物在相應(yīng)擴(kuò)增位點(diǎn)上要有高度的保守性，可以擴(kuò)增出不同染色體上的同一位點(diǎn)的各個等位基因，即所采用的標(biāo)記應(yīng)呈共顯性遺傳。二是檢測的基因位點(diǎn)要有高度的變異性，同一位點(diǎn)的不同等位基因存在可檢測的變異?？紤]上述要求，微衛(wèi)星標(biāo)記是目前不同標(biāo)記類型中，用于植物多倍體篩選的最高效的分子標(biāo)記。微衛(wèi)星DNA也稱簡單重復(fù)序列，是由長度為l_6bp 串聯(lián)重復(fù)序列組成，微衛(wèi)星是基因組中變異最為迅速的序列，存在豐富的等位基因變異。同時微衛(wèi)星標(biāo)記的引物序列保守性高，一般在種的分類水平上可以通用，有些微衛(wèi)星引物甚至屬的分類水平上也可以通用，因此微衛(wèi)星標(biāo)記多呈共顯性遺傳。微衛(wèi)星標(biāo)記是基于PCR 擴(kuò)增為基礎(chǔ)的標(biāo)記，微衛(wèi)星標(biāo)記檢測還具有簡便、快速的特點(diǎn)。
通過上面的論述，本發(fā)明開發(fā)的用于多倍體楊樹篩選的微衛(wèi)星引物，要求同時滿足以下條件1.采用的微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)為單拷貝；2.采用的微衛(wèi)星位點(diǎn)應(yīng)為變異迅速的序列；3.采用的微衛(wèi)星引物序列要有高度的保守性。4.微衛(wèi)星標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物要求譜帶清晰，每一譜帶與一個等位基因?qū)?yīng)，不能有明顯的“影子”譜帶。如果篩選出具有上述特點(diǎn)的微衛(wèi)星位點(diǎn)，就可以根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測到的等位基因數(shù)，對多倍體進(jìn)行識別。
多倍體培育方法中，通過物理或化學(xué)的方法人工誘導(dǎo)產(chǎn)生的多倍體，由于不會產(chǎn)生等位基因數(shù)目的增加，因此這種方法獲得的人工多倍體不能通過分子標(biāo)記的方法進(jìn)行篩選。而天然多倍體或雜交育種產(chǎn)生的多倍體，都會有等位基因數(shù)目的增加，因此本發(fā)明適用于從楊樹天然群體或雜交育種過程中產(chǎn)生的大量材料中進(jìn)行多倍體篩選。
有益效果與現(xiàn)有的多倍體楊樹篩選方法相比，本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)包括利用12 對楊樹專用微衛(wèi)星引物，進(jìn)行多倍體楊樹篩選，檢測方法操作簡單、快捷，可在短時間內(nèi)完成大量樣品的檢測，為多倍體楊樹篩選提供了高效可靠技術(shù)手段。本發(fā)明為多倍體楊樹育種提供了重要的技術(shù)支撐，應(yīng)用前景廣闊，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價值，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。


圖1是楊樹微衛(wèi)星引物對NJFUP-polyOl在9種不同楊樹中的擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖2是楊樹微衛(wèi)星引物對NJFUP-poly04在楊樹全同胞家系子代中的擴(kuò)增產(chǎn)物用 ABI-3730電泳產(chǎn)生的指紋圖3是楊樹微衛(wèi)星弓I物對NJFUP-poly06對毛白楊進(jìn)行多倍體檢測產(chǎn)生的指紋圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
下述實(shí)例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所用微衛(wèi)星引物合成工作由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司完成。
實(shí)施例1
微衛(wèi)星引物是楊樹基因DNA序列開發(fā)而來，楊樹基因DNA序列由網(wǎng)頁:http:// shake. iRi-psf. orR/cRi-in/searchGM ？ db = Poptrl 1 下載。楊樹基因的 DNA 序列由 3’-UTR區(qū)，外顯子區(qū)，內(nèi)含子區(qū)和5’-UTR區(qū)構(gòu)成。基因內(nèi)含子區(qū)序列比外顯子區(qū)序列具有更高的變異頻率，而外顯子序列一般具有很高的保守性?；诙啾扼w檢測分子標(biāo)記應(yīng)具有的特性，在標(biāo)記開發(fā)過程中，首先對利用SPUTNIK微衛(wèi)星序列查找程序，采用默認(rèn)參數(shù)，查找出了所有基因內(nèi)含子序列中含有的重復(fù)單元長度為2 5堿基的微衛(wèi)星重復(fù)序列，由于這些微衛(wèi)星序列位于內(nèi)含子區(qū)，可確保微衛(wèi)星具有較高的變異性。引物采用PRIMER5. O設(shè)計，引物設(shè)計要求引物結(jié)合序列位于外顯子區(qū)，外顯子序列保性很高，這樣可確保引物的保守性，使開發(fā)的引物能夠在楊樹不同樹種中成功擴(kuò)增。因此采用這一策略，可同時兼顧開發(fā)出的微衛(wèi)星標(biāo)記即具有較高的變異性，又具有較高的通用性。通過分析，共開發(fā)了 1219個外顯子-內(nèi)含子復(fù)合微衛(wèi)星標(biāo)記。
楊樹分為黑楊派(Aigeiros)、白楊派(Leuce)、青楊派(Turanga)、大葉楊派 (Leucoides)和胡楊派(Tacamahaca)。為驗(yàn)證引物的通用性，采集了分屬其中4個派的9 種不同楊樹，包括美洲黑楊(Populus deltoides,黑楊派)、歐洲黑楊(P. nigra,黑楊派)、 青楊(P. cathayana，青楊派)、小葉楊(P. simonii，青楊派)、大葉楊(P. lasiocarpa，大葉楊派)、毛白楊(P. tomentosa,白楊派)、銀白楊(P. alba,白楊派)、山楊(P. davidiana,白楊派)、響葉楊(P. adenopoda,白楊派)。對采集的不同種楊樹的插條在溫室內(nèi)扦插發(fā)葉，采集幼嫩的葉片，用Qiagen DNeasy Plant Mini Kit提取DNA。提取的DNA通過微量核酸蛋白檢測儀檢測濃度，按50ng/ul稀釋，_80°C保存?zhèn)溆?。從開發(fā)的1219個外顯子-內(nèi)含子復(fù)合微衛(wèi)星標(biāo)記中隨機(jī)選300對引物，由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行了合成。利用合成的引物對上述楊樹不同種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定不同引物在上述不同楊樹中是否能夠擴(kuò)增成功。圖1為楊樹微衛(wèi)星引物對NJFUP-polyOl 在9種不同楊樹中的擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，圖中的泳道從左至右依次為青楊、小葉楊、大葉楊、毛白楊、美洲黑楊、歐洲黑楊、山楊、響葉楊、銀白楊和分子量標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，合成的引物在所測的9種不同楊樹樹種中的擴(kuò)增成功率均大于90%。
要篩選出可用于多倍體楊樹檢測的微衛(wèi)星引物，還必須通過實(shí)驗(yàn)確定微衛(wèi)星在楊樹基因組中的拷貝數(shù)。同時由于許多微衛(wèi)星引物的PCR產(chǎn)物往往存在一些“影子”譜帶， 有時一個等位基因會對應(yīng)多條電泳譜帶，這樣在進(jìn)行自然群體材料分析時，很難根據(jù)擴(kuò)增出的譜帶數(shù)對等位基因數(shù)目進(jìn)行準(zhǔn)確判定。要解決這兩個關(guān)鍵問題，需要利用全同胞家系材料來進(jìn)行引物對的測試。由于楊樹全同胞家系組合中，一個共顯性的位點(diǎn)，在任一子代中親本的兩個等位基因只能出現(xiàn)其一，且在不同子代中兩個等位基因只能交替出現(xiàn)。這樣利用全同胞家系就能對上述信息做出準(zhǔn)確判斷，篩選出擴(kuò)增譜帶數(shù)與等位基因數(shù)相對應(yīng)， 且為單拷貝的微衛(wèi)星標(biāo)記。利用這種微衛(wèi)星對自然群體材料進(jìn)行檢測，就可以根據(jù)擴(kuò)增的譜帶數(shù)對檢測樣本的倍性做出推斷。然而不同位點(diǎn)的雜合情況是不同的，如果所用微衛(wèi)星標(biāo)記在檢測樣本中擴(kuò)增位點(diǎn)有兩個等位基因是純合的，則兩個等位基因只能顯示一條譜帶，這樣即使是多倍體，僅根據(jù)一對引物的擴(kuò)增結(jié)果是難以檢測到樣本真實(shí)的倍性信息的。所以在進(jìn)行樣本倍性檢測時要同時進(jìn)行多個不同位點(diǎn)的檢測，才能做出較為準(zhǔn)確的判斷?；谝陨纤?，接下來本發(fā)明采用了一個美洲黑楊和青楊的全同胞雜交組合，根據(jù)對合成引物對擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果，從中選取了 180對瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物帶型清晰，且在所有測試楊樹不同樹種中均能成功擴(kuò)增的引物對，對該家系的兩個親本和 6個子代進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為模板DNA25ng，上、下游引物各20ng，0.01uL Fluorescein-12-dUTP (ImM, Roche Diagnostics)，200uM dNTP，0.5U Taq 聚合酶，1. 5uL 含 IOOuM pH8. 3 的 Tris-HCl、500mM KCl、20mM MgCl2 禾口 10. Og/L BSA 的 10 Xbuffer，加滅菌去離子水補(bǔ)充反應(yīng)積到15uL ；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性^iin ；94°C變性30s，50°C退火 30s，72°C延伸lmin，進(jìn)行30個循環(huán)；72°C延伸5min?；蛐头治鲈贏BI3130或ABI3730測序儀上按如下步驟進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物用滅菌去離子水1 20稀釋；取IuL稀釋后的反應(yīng)產(chǎn)物， 加9uL上樣緩沖液(含91%去離子甲酰胺，9% 450R0X內(nèi)標(biāo))；配制好的上樣產(chǎn)物95°C變性 5min后，置于冰上迅速冷卻，然后上機(jī)運(yùn)行。圖2所示為楊樹微衛(wèi)星引物對NJFUP-poly04在楊樹全同胞家系子代中的擴(kuò)增產(chǎn)物用ABI-3730電泳產(chǎn)生的指紋圖，圖中樣品1和2分別為雜交組合的母本和父本，樣品3-8為雜交子代；圖中不同位置的峰對應(yīng)不同的等位基因，上圖橫坐標(biāo)指示等位基因按分子量大小的電泳位置，縱坐標(biāo)指示擴(kuò)增位點(diǎn)的螢光信號強(qiáng)度。 根據(jù)ABI3130電泳檢測到的不同引物對擴(kuò)增位點(diǎn)等位基因的分離情況，共選取了 12對擴(kuò)增產(chǎn)物電泳指紋清晰、呈共顯性遺傳且在楊樹基因組中為單拷貝的微衛(wèi)星引物對，對應(yīng)引物對的編號和具體序列信息見序列表或表1所示。
表1微衛(wèi)星引物序列詳情表
權(quán)利要求
1.一種多倍體楊樹的篩選方法及其專用引物，其特征在于以待篩選樣品的DNA為模板，在特異性微衛(wèi)星引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物，通過電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因型分析，檢測擴(kuò)增位點(diǎn)所含等位基因數(shù)目，若擴(kuò)增出的等位基因數(shù)目大于或等于3個，則對應(yīng)樣品為多倍體楊樹，否則不為多倍體楊樹；其中，特異性微衛(wèi)星引物為以下12對引物中的全部引物引物對 1 :GACACCGTTTCTTTTCTGAG，ACCAGATCTTCATCTTCCAA ； 引物對 2 TCGAATAGCTGGGATACTTC, TATCACCCGAACAAAAACTC ； 引物對 3 TTACGATCGCCATTATGAA, TCTTTAACCTCCCCTAAACC ； 引物對 4 :AACCTCCAATACCAAGATCA, TGAGAATAAATATTTCGGCAA ； 引物對 5 CCTTAGCCTTCTCACACAAC, GGTCTCCATTTTAGCTGTCA ； 引物對 6 GCCCAAACTCTTATTTGATG, TGGTGGAGGCTAGGATAGTA ； 引物對 7 :ATTGCTCTTGCAGAAATCAT, GGATACCAAGTCATCGGTAG ； 引物對 8 :ATCAATTAGACCGGGTTTTT, TGTTCCAGTTCATGCTGATA ； 引物對 9 :ATTGGTCTCGTACCCAAAA, ATTTCCAATGCATATGTTCC ； 引物對 10 :AGAACTTGTGAGGCAGGTAA，AAAGCTCTCCCCTAACAAAG ； 引物對 11 :TTATTTGGATCCTGAAATGG，GATGGTTCGGTATGTGAGTT ； 引物對 12 :ACAAAATTTTCGCAAGAAAG, TTCTGTTCATGAGAGTGGAA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多倍體楊樹的篩選方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系為模板 DNA 25ng，未標(biāo)記的上游引物和FAM標(biāo)記下游引物各20ng，200uM dNTP，0. 5 U Taq聚合酶， 1.5uL含 100 uM pH 8. 3 的 Tris_HCl、500 mM KCl,20 mM MgCl2 和 10. 0 g /L BSA 的 IOX buffer,加滅菌去離子水補(bǔ)充反應(yīng)積到15uL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多倍體楊樹的篩選方法，其特征在于PCR反應(yīng)條件為94°C 預(yù)變性anin; 94°C變性30s，50°C退火30 s，72°C延伸lmin，進(jìn)行30個循環(huán)；72°C延伸 5min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多倍體楊樹的篩選方法，其特征在于基因型分析在ABI3130 測序儀上按如下步驟進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物用滅菌去離子水1 :20稀釋；取IuL稀釋后的反應(yīng)產(chǎn)物，加9uL上樣緩沖液(含91%去離子甲酰胺，9% 450R0X內(nèi)標(biāo))；配制好的上樣產(chǎn)物95°C變性5min后，置于冰上迅速冷卻，然后上機(jī)運(yùn)行；其中，上樣緩沖液含91%體積去離子甲酰胺， 含9%體積450R0X內(nèi)標(biāo)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多倍體楊樹的篩選方法，其特征在于所述的多倍體楊樹為天然多倍體楊樹或雜交育種產(chǎn)生的多倍體楊樹。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多倍體楊樹的篩選方法，其特征在于當(dāng)檢測對象為多倍體楊樹，如三倍體中若在某一位點(diǎn)檢測到3個等位基因，說明該位點(diǎn)等位基因均為雜合；若檢測2個等位基因，說明該位點(diǎn)有兩個等位基因純合，另一個為雜合；若只檢測1個等位基因， 說明該位點(diǎn)3個等位基因均純合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多倍體楊樹的篩選方法，其特征在于當(dāng)檢測為二倍體楊樹時，二倍體中若在某一位點(diǎn)檢測到2個等位基因，說明該位點(diǎn)等位基因雜合；若只檢測到1 個等位基因，說明該位點(diǎn)2個等位基因純合。
8.—種權(quán)利要求1所述的多倍體楊樹的篩選方法的專用引物，其特征在于所述的專用引物是微衛(wèi)星引物，為以下12對引物中的全部引物引物對 1 :GACACCGTTTCTTTTCTGAG，ACCAGATCTTCATCTTCCAA ； 引物對 2 TCGAATAGCTGGGATACTTC, TATCACCCGAACAAAAACTC ； 引物對 3 TTACGATCGCCATTATGAA, TCTTTAACCTCCCCTAAACC ； 引物對 4 :AACCTCCAATACCAAGATCA, TGAGAATAAATATTTCGGCAA ； 引物對 5 CCTTAGCCTTCTCACACAAC, GGTCTCCATTTTAGCTGTCA ； 引物對 6 GCCCAAACTCTTATTTGATG, TGGTGGAGGCTAGGATAGTA ； 引物對 7 :ATTGCTCTTGCAGAAATCAT, GGATACCAAGTCATCGGTAG ； 引物對 8 :ATCAATTAGACCGGGTTTTT, TGTTCCAGTTCATGCTGATA ； 引物對 9 :ATTGGTCTCGTACCCAAAA, ATTTCCAATGCATATGTTCC ； 引物對 10 :AGAACTTGTGAGGCAGGTAA，AAAGCTCTCCCCTAACAAAG ； 引物對 11 :TTATTTGGATCCTGAAATGG，GATGGTTCGGTATGTGAGTT ； 引物對 12 :ACAAAATTTTCGCAAGAAAG, TTCTGTTCATGAGAGTGGAA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多倍體楊樹的篩選方法及其專用引物，該方法以待篩選樣品的DNA為模板，在特異性微衛(wèi)星引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得產(chǎn)物，對產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并進(jìn)行基因型分析，若擴(kuò)增出的等位基因數(shù)目大于或等于3個，則對應(yīng)樣品為多倍體楊樹，否則不為多倍體楊樹；其中，特異性微衛(wèi)星引物為專用12對引物中全部引物。與現(xiàn)有的多倍體楊樹檢測方法相比，本發(fā)明利用專用微衛(wèi)星引物，進(jìn)行多倍體楊樹篩選，檢測方法操作簡單、快捷，可在短時間內(nèi)完成大量樣品的檢測，為多倍體楊樹篩選提供了高效可靠技術(shù)手段，為多倍體楊樹育種提供了重要的技術(shù)支撐，應(yīng)用前景廣闊，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價值，能夠產(chǎn)生較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
文檔編號C12N15/11GK102533993SQ201110446619
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者馮凱, 尹佟明, 戴曉港, 李淑嫻, 渠紀(jì)騰 申請人:南京林業(yè)大學(xué)