新的酶、酶組合物及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了編碼來(lái)自金黃色破囊壺菌和Sphaeroforma arctica的新的脂肪酸去飽和酶、KCS、KCR和/或LACS的核酸分子。本發(fā)明還提供了含有所述核酸分子的重組表達(dá)載體、已經(jīng)向其中引入表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，和用于大規(guī)模產(chǎn)生長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)，例如ARA、EPA和DHA和用于篩選δ-4去飽和酶的方法。
【專利說(shuō)明】新的酶、酶組合物及其用途
[0001] 本申請(qǐng)要求保護(hù)申請(qǐng)?zhí)枮閁S 61/679100和EP 12179241.0的優(yōu)先權(quán)，其全部并入 作為參考。
[0002] 本發(fā)明原則上涉及重組制造脂肪酸的領(lǐng)域。其提供編碼溶血磷脂-輔酶A合酶 (LACS)、去飽和酶、延伸酶和延伸酶組分的核酸分子。本發(fā)明還提供含有去飽和酶、KCS、KCR 和/或LACS核酸分子的重組表達(dá)載體、已經(jīng)向其中引入了表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，和用于大 規(guī)模產(chǎn)生長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（LCPUFA)，例如花生四烯酸（ARA，《-6不飽和脂肪酸）、二十 碳五烯酸（EPA，《 -3不飽和脂肪酸）和/或二十二碳五烯酸（DHA，《 -3不飽和脂肪酸）的 方法。
[0003] 脂肪酸是具有長(zhǎng)鏈烴側(cè)基的羧酸，其在許多生物過(guò)程中起主要作用。很少發(fā)現(xiàn)脂 肪酸在自然中是游離的，而是作為脂類的主要成分以酯化形式存在。因此，脂類/脂肪酸是 能量的來(lái)源（例如，b_氧化）。此外，脂類/脂肪酸是細(xì)胞膜的組成部分，并因而是處理生 物學(xué)或生物化學(xué)信息所不可缺少的。
[0004] 脂肪酸可以分為兩類：?jiǎn)蝹€(gè)碳鍵形成的飽和脂肪酸和含有一個(gè)或多個(gè)順式構(gòu)型的 碳雙鍵的不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸由屬于非血紅素-鐵酶種類的末端去飽和酶產(chǎn)生。 每種這樣的酶都是電子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的一部分，所述電子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)含有兩種其他蛋白，即細(xì)胞 色素匕和NADH-細(xì)胞色素b 5還原酶。尤其是，此類酶例如通過(guò)催化脂肪酸的氧依賴性脫氫 來(lái)催化脂肪酸分子的碳原子之間雙鍵的形成（Sperling等，2003)。人和其他哺乳動(dòng)物具有 有限范圍的為形成不飽和脂肪酸中特定雙鍵所需要的去飽和酶并且因此具有合成必需脂 肪酸，例如，長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（LCPUFA)的有限能力。因此，人們不得不通過(guò)其膳食攝取 某些脂肪酸。此類必需脂肪酸包括例如亞油酸（C18:2)和亞麻酸（C18:3)。相反，昆蟲、微 生物和植物能夠合成種類多得多的不飽和脂肪酸及它們的衍生物。的確，脂肪酸的生物合 成是植物和微生物的一項(xiàng)主要活動(dòng)。
[0005] 長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（LCPUFA)，如二十二碳六烯酸（DHA， 22:6(4, 7, 10, 13, 16, 19))是哺乳動(dòng)物中多種組織和器官（神經(jīng)、視網(wǎng)膜、腦和免疫細(xì)胞） 的細(xì)胞膜的必需組分。例如，腦磷脂中超過(guò)30%的脂肪酸是22:6(11-3)和20 :4(11-6) (Crawford，M.A.，等，（1997)Am.J.Clin.Nutr.66:1032S-1041S)。在視網(wǎng)膜中，DHA 占據(jù)視 桿外區(qū)（光受體細(xì)胞的光敏部分）多于60%的總脂肪酸（Giusto，N.M?，等（2000)Prog. Lipid Res. 39:315-391)。臨床研究已經(jīng)顯示，DHA對(duì)嬰兒中腦的生長(zhǎng)和發(fā)育和成人中正 常腦功能的維持是至關(guān)重要的（Martinetz，M. (1992)J.Pediatr.l20:S129-S138)。DHA 還對(duì)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的光受體功能、視紫紅質(zhì)激活和視桿與視錐發(fā)育具有顯著的影響 (Giusto，N.M?，等（2000)Prog.Lipid Res.39:315-391)。此外，還發(fā)現(xiàn) DHA 對(duì)疾病如高 血壓、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、抑郁、血栓形成和癌癥的一些積極影響（Horrocks，L. A.和 Yeo, Y. K. (1999) Pharmacol. Res. 40:211-215)。因而，脂肪酸的適當(dāng)膳食供給對(duì)人健康是重 要的。因?yàn)榇祟愔舅岵荒芡ㄟ^(guò)嬰兒、幼兒和老年人有效合成，所以從膳食中充分?jǐn)z取這些 脂肪酸對(duì)于這些個(gè)體是特別重要的（Spector，A.A. (1999)Lipids 34:S1-S3)。
[0006]目前，DHA的主要來(lái)源是來(lái)自魚類和藻類的油。魚油是這種脂肪酸的主要和傳統(tǒng) 來(lái)源，然而，它到銷售時(shí)一般已被氧化。此外，魚油的供給是高度不定的，特別鑒于魚群正在 縮減。此外，油的藻類來(lái)源因低產(chǎn)量和高提取成本而昂貴。
[0007] LCPUFA的生物合成和LCPUFA摻入到膜脂或甘油三酯通過(guò)多條代謝途徑進(jìn)行 (Abbadi 2001, European Journal of Lipid Science&Technology 103:106-113)。 在 細(xì)菌如弧菌（Vibrio),和微藻類，如裂殖壺菌（Schizochytrium)中，丙二酰-CoA通過(guò) LCPUFA 產(chǎn)生聚酮合酶轉(zhuǎn)化成 LCPUFA(Metz 2001，Science 293:290-293 ;W0 00/42195; TO 98/27203 ;W0 98/55625)。在微藻類，如褐指藻（Phaeodactylum)，和苔蘚，如劍葉蘚 (Physcomitrella)中，不飽和脂肪酸如亞油酸或亞麻酸在多個(gè)去飽和以及延伸步驟中轉(zhuǎn) 化以產(chǎn)生 LCPUFA(Zank 2000，Biochemical Society Transactions 28:654-658)。去飽 和發(fā)生在結(jié)合輔酶A(?；?CoA)的?；鶊F(tuán)或膜脂的?；鶊F(tuán)上，而延伸在生物化學(xué)上 受限于結(jié)合CoA的?；?。在哺乳動(dòng)物中，除去飽和以及延伸步驟外，DHA的生物合成包 括通過(guò)氧化的鏈縮短。在微生物和低等植物中，LCPUFA僅僅以膜脂的形式存在（如 在劍葉蘚和褐指藻的情況下），或以膜脂和甘油三酯的形式存在（如在裂殖壺菌和被孢 霉（Mortierella)的情況下）。LCPUFA向脂類和油中的摻入，以及脂肪酸部分（?；?團(tuán)）在脂類和其他分子種類如?；?CoA之間的轉(zhuǎn)移由多種轉(zhuǎn)移酶，如酰基轉(zhuǎn)移酶和轉(zhuǎn)酰 基酶催化。已知這些酶進(jìn)行飽和與不飽和脂肪酸的摻入或交換（Slabas 2001，J. Plant Physiology 158:505-513, Frentzen 1998,Fett/Lipid 100:161-166, Casesl998, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:13018-13023, Lu 等 2009, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 第 106 卷：44 號(hào)：18837-18842)。具有三種不同酶活性的一組?；D(zhuǎn)移酶是"Kennedy途徑"的酶，其定 位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER)的膜系統(tǒng)的胞質(zhì)面。微粒體部分中的ER結(jié)合的酰基轉(zhuǎn)移酶使用?；?CoA 作為脂肪酸的活性形式。甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（GPAT)催化在甘油-3-磷酸的sn-1 位置上摻入酰基基團(tuán)。1-?；视?3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（也稱為溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶 (LPAAT))催化在溶血磷脂酸（LPA)的sn-2位置上摻入?；鶊F(tuán)。通過(guò)磷脂酸磷酸酶（PAP) 對(duì)磷脂酸去磷酸化后，二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT)催化在二?；视偷膕n-3位置上摻 入酰基基團(tuán)。除了所述Kennedy途徑的酶，直接參與TAG生物合成的其他酶是磷脂二酰甘 油?；D(zhuǎn)移酶（PDAT)，其是將?；鶊F(tuán)從膜脂的sn-2位置上轉(zhuǎn)移到二酰甘油的sn-3位置 上的酶；二酰甘油二酰甘油轉(zhuǎn)移酶（DDAT)，其是將酰基基團(tuán)從一個(gè)二酰甘油-分子的sn-2 位置上轉(zhuǎn)移到另一個(gè)二酰甘油-分子的sn-3位置上的酶，和磷脂酰膽堿：二?；视湍憠A 磷酸轉(zhuǎn)移酶（PDCT)，其是將極性phosphatodyclcholine頭部基團(tuán)從多不飽和磷脂（例如含 有18:2n-6或18:3n-3)的sn-3位置上轉(zhuǎn)移到飽和（例如含有18:0)或單不飽和（例如， 含有18: ln-9)二酰基甘油溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶（LPLAT)的sn-3位置上的酶，代表能夠?qū)?活化的?；鶊F(tuán)從酰基-CoA摻入到膜脂中，并還可能催化反向反應(yīng)的一類?；D(zhuǎn)移酶。更 尤其是，LPLATs可以具有如溶血磷脂酰乙醇胺?；D(zhuǎn)移酶（LPEAT)和溶血磷脂酰膽堿?；?轉(zhuǎn)移酶（LPCAT)的活性。其他酶，如卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT)也可以參與?；鶊F(tuán) 從膜脂轉(zhuǎn)移到甘油三酯。一般地，細(xì)胞中的脂肪酸結(jié)合為硫酯。這些硫酯從游離脂肪酸的 形成通過(guò)溶血磷脂輔酶A合酶（LACS)的作用發(fā)生。
[0008] EPA和ARA二者均是S (d) 5必需脂肪酸。它們形成人和動(dòng)物的獨(dú)特種類的食物和 飼料成分。EPA屬于?；溨芯哂?個(gè)雙鍵的n-3系列。EPA發(fā)現(xiàn)于海產(chǎn)品中并且在來(lái)自北 大西洋的多油魚類中豐富。ARA屬于具有4個(gè)雙鍵的n-6系列。與EPA中存在的那些性能 相比，在《-3位置上缺少雙鍵賦予ARA不同的性能。從AA產(chǎn)生的類花生酸類具有強(qiáng)大的 炎癥和血小板聚集性能，而來(lái)自EPA的那些類花生酸類具有抗炎和抗血小板聚集性能。ARA 可以從一些食物如肉、魚和蛋類獲得，但是濃度低。
[0009] 亞麻酸（GLA)是發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物中的另一種必需脂肪酸。GLA是極長(zhǎng)鏈n-6脂 肪酸和多種活性分子的代謝中間體。在哺乳動(dòng)物中，長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的形成受A6去 飽和作用限速。已經(jīng)顯示許多生理學(xué)和病理學(xué)狀況如老化、應(yīng)激、糖尿病、濕疹和一些感染 抑制A 6去飽和步驟。此外，GLA因氧化和與某些病癥（例如，癌癥或炎癥）相關(guān)的快速細(xì) 胞分裂而易于分解代謝。因而，膳食補(bǔ)充GLA可以降低這些病癥的風(fēng)險(xiǎn)。臨床研究已經(jīng)顯 示，膳食補(bǔ)充GLA在治療一些病理學(xué)狀況如特應(yīng)性濕疹、經(jīng)前期綜合征、糖尿病、高膽固醇 血癥、炎性疾病和心血管疾病中有效。
[0010] 雖然生物技術(shù)為產(chǎn)生特定的脂肪酸提供了有吸引力的途徑，但是現(xiàn)有技術(shù)不能提 供用于大規(guī)模產(chǎn)生不飽和脂肪酸的有效手段。因此，需要產(chǎn)生不飽和脂肪酸，如DHA、EPA和 ARA的改進(jìn)和有效方法。
[0011] 由于DHA是特別重要的多不飽和脂肪酸，高度需要這種脂肪酸的有效產(chǎn)生。在DHA 產(chǎn)生中特別重要的步驟是S-4去飽和步驟。該步驟通過(guò)S-4去飽和酶進(jìn)行。這些酶利用 結(jié)合ACP、CoA或在磷脂中的二十二碳五烯酸（DPA，22:5 S 7, 10, 13, 16, 19)作為底物，產(chǎn)生 結(jié)合ACP、C〇A或在磷脂中的各DHA。DPA又由S-5延伸酶產(chǎn)生。一般地，這些延伸酶延長(zhǎng)酰 基-CoA脂肪酸。已經(jīng)觀察到，如果使用與延伸過(guò)程中使用的那些結(jié)合相同骨架的脂肪酸作 為底物的去飽和酶，那么可以極大地增加去飽和效率。尤其是，已經(jīng)顯示通過(guò)提供?；?c〇A 去飽和酶增加去飽和效率Oomergue等，Biochem. J. 2005, 483-490)。
[0012] 因此需要當(dāng)與S-5延伸酶配對(duì)時(shí)具有高去飽和效率的S-4去飽和酶。迄今 為止，已知此類去飽和酶僅來(lái)自Pavlova/Rebecca物種（Uniprot標(biāo)識(shí)Q6VPV2_PAVLU和 A0PJ29_9EUKA，推測(cè)也是D6NST0_9EUKA)。這使得其難以篩選當(dāng)與S-5延伸酶配對(duì)時(shí)具有 高去飽和效率的其他去飽和酶，由于Pavlova/Rebecca的3 -4去飽和酶的相似性，不可能 確定這些去飽和酶中保守的氨基酸是否為其功能所需，或它們被保留是否僅因?yàn)闆](méi)有經(jīng)歷 足夠的時(shí)間來(lái)產(chǎn)生其他突變。
[0013]本發(fā)明人現(xiàn)在提供了當(dāng)與異源s -5延伸酶配對(duì)時(shí)具有高去飽和效率的S -4去飽 和酶。該S-4去飽和酶與上文提及的Pavlova/Rebecca去飽和酶具有非常低的序列同一 性。本發(fā)明因此也提供了 S-4去飽和酶的可允許突變列表，從而僅很少這些突變會(huì)消除 S-4去飽和酶本身活性或當(dāng)與S-5延伸酶配對(duì)時(shí)的高去飽和效率。因此，本發(fā)明提供用于 篩選當(dāng)與異源S-5延伸酶配對(duì)時(shí)具有高去飽和效率的其他S-4去飽和酶的方法。
[0014] 發(fā)明詳沭
[0015] 尤其是，本發(fā)明提供與SEQ ID N0. 79、86或85任一個(gè)的氨基酸序列具有至少 60 %，優(yōu)選至少69 %，甚至更優(yōu)選至少74 %并甚至更優(yōu)選至少81 %的序列同一'丨生的S -4去 飽和酶，其中所述序列優(yōu)選還包含
[0016]-選自 " KHPGG "、" QHPGG " 或 " RHPGG " 的基序，優(yōu)選選自 " KHPGGD "、" QHPGGD " 或 "RHPGGD"的基序，和
[0017]-選自 "GLNIQHDANHG" 或 "HVVGHH" 的基序，優(yōu)選選自 "AAIGLNIQHDANHG" 或 "QHVVGHH" 的基序。
[0018] 特別令人驚奇的是，可以提供當(dāng)與異源s -5去飽和酶配對(duì)時(shí)具有高去飽和效率 的s -4去飽和酶，其與上文提及的Pavlova/Rebecca的S -4去飽和酶具有如此低的序列 同一性。還特別令人驚奇的是，在Pavlova/Rebecca中保守的基序"EHPGG"中，第一個(gè)氨基 酸G(其是酸性氨基酸）可以被K(其是堿性氨基酸）替換，而不消除高去飽和效率。因此 可以推斷，令人驚奇的還有" QHPGG"和" RHPGG"是替代"EHPGG"的有效基序。同樣，令人驚 奇的是，在Pavlova/Rebecca中保守的基序"HVVMHH"中，S -4去飽和酶可以被"HVVGHH"替 換，疏水性甲硫氨酸M被不起眼的甘氨酸G替換。并且令人驚：奇的是，保守Pavlova/Rebecca 基序"EHVVMHH"的第一個(gè)氨基酸E可以被Q替換，再次將酸性氨基酸交換成非酸性氨基酸。 沒(méi)有預(yù)料到的是，當(dāng)與異源S -5延伸酶比較時(shí)，保守基序中氨基酸性質(zhì)的這種顯著改變是 可能的而不消除去飽和效率。
[0019] 本發(fā)明的S -4去飽和酶至少包含以下保守序列基序，其中"X"表示任何氨基酸： "冊(cè)66"、"〇腿166"、"如61^"、"〇1￡冊(cè)1^卩1?"和"161^1〇冊(cè)父順6"。如圖2的比對(duì)中所示，這些 序列為S-4去飽和酶活性所需。
[0020] 優(yōu)選地，本發(fā)明的S-4去飽和酶包含至少5個(gè)，更優(yōu)選至少6個(gè)，甚至更優(yōu)選至 少7個(gè)并且最優(yōu)選所有以下保守序列基序，其中"X"表示任何氨基酸："DH)XK"、"HPGG"、 " NGGLNXQIEHHLFPR"、" GYXQDWIGG "、" IGLNIQHDANHG "、" YLXFFF "、" HVVXHHXH" 和 " FXGXDAT "。 這些較長(zhǎng)的保守序列基序也發(fā)現(xiàn)于如圖2中所示的Sphaeroforma、Pavlova或Rebecca屬 的S-4去飽和酶中。
[0021] 更優(yōu)選地，本發(fā)明的S-4去飽和酶包含至少5個(gè)，更優(yōu)選至少6個(gè)，甚至更優(yōu)選 至少7個(gè)，甚至更優(yōu)選至少8個(gè)，甚至更優(yōu)選至少9個(gè)，甚至更優(yōu)選至少10個(gè)，甚至更優(yōu)選 至少11個(gè)，甚至更優(yōu)選至少12個(gè)，甚至更優(yōu)選至少13個(gè)，甚至更優(yōu)選至少14個(gè)并最優(yōu)選 所有以下保守序列基序："DPD [VILMATQ] K"、"HPGG"、"NGGLN [FWY] QIEHHLFPR"、"GY [ASGM] QDWIGG"、" Y [FI] LP"、" IGLNIQHDANHG"、" YL [AG] FFF"、"HW [GNASKDWM] HH [LIFT] H"、"AP [PA] S"、"F[WF] [AVCGSPI]R"、"F[GP]G[RQ]DAT"、"T[LIMVFCA] [LIVCA]C"、"P[LF] [WA]L"、 "KA[CA]A"和"I[VL] [GADE]D[GA]"。在該列表中，"X"再次表示任何氨基酸。括號(hào)中的氨基 酸列表表明，從列表成員中選擇的一個(gè)成員存在于基序的相應(yīng)位置上，其中每個(gè)單獨(dú)的列 表以降低優(yōu)選性排序。例如，基序"PLWL"優(yōu)于基序"PLAL"或"PFWL"或"PFAL"，并且這4個(gè) 基序之一必須存在于本發(fā)明更優(yōu)選的S -4去飽和酶中。在如圖2中所示的Sphaeroforma、 Pavlova或Rebecca屬的3-4去飽和酶中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)列表中的一些氨基酸。然而，根據(jù)本發(fā) 明，這些新的氨基酸與Sphaeroforma、Pavlova或Rebecca屬的5 -4去飽和酶中相應(yīng)位置 上發(fā)現(xiàn)的那些氨基酸充分地相似，從而所述新的氨基酸一般不消除或嚴(yán)重降低S -4去飽 和酶效率，特別是當(dāng)與用于從所述S-5延伸酶的底物產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的S-5延伸酶 組合時(shí)降低其去飽和的高效率。
[0022] 最優(yōu)選地，本發(fā)明的S-4去飽和酶包含至少5個(gè)，更優(yōu)選至少6個(gè)，甚至更優(yōu)選至 少7個(gè)，甚至更優(yōu)選至少8個(gè)，甚至更優(yōu)選至少9個(gè)，甚至更優(yōu)選至少10個(gè)，甚至更優(yōu)選至 少11個(gè)，甚至更優(yōu)選至少12個(gè)，甚至更優(yōu)選至少13個(gè)，甚至更優(yōu)選至少14個(gè)，并且最優(yōu)選 所有以下保守序列基序："DPD [VQ] K"、"HPGG "、"NGGLN [YF] QIEHHLFPR"、"GY [SAM] QDWIGG"、 "Y[FI] LP"、" IGLNIQHDANHG"、"YL[AG]FFF"、"HW[GM]HH[LT]H"、"AP [PA] S"、"F[FW] [AI] R"、 "F[GP]G[RQ]DAT"、"T[LA] [LA]C"、"P[LF] [AW]L"、"KA[AC]A"和"I[VL] [GE]D[GA] "。如上 所述，括號(hào)中的氨基酸列表表明，從列表成員中選擇的一個(gè)成員存在于基序的相應(yīng)位置上， 其中每個(gè)單獨(dú)的列表以降低優(yōu)選性排序。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，進(jìn)一步提供了具有氨基酸序列SEQ ID N0. 85和任選地一個(gè)或多個(gè)以 下突變的 S -4 去飽和酶：H4S、H4Y、H4Q、H4E、H4N、A5S、A5G、A5C、A5P、A5T、A5V、A6R、A6G、 A6K、A6S、A6N、T7K、T7S、T7R、T7N、T7A、T7G、K8E、K8D、K8R、K8Q、V9-、V9I、V9L、V9A、G10V、 G10I、G10A、G10M、G10C、G11S、G11N、G11D、G11A、G11K、D12-、S13-、D14A、D14V、D14I、D14E、 D14G、D14P、P15A、P15G、P15S、P15V、P15T、R18K、R18S、R18T、R18A、R18Q、D19A、D19G、D19P、 D19S、L20-、K21-、M22A、M22L、M22I、M22V、E23K、E23R、E23Q、H24Y、H24F、H24I、H24M、H24L、 H24Q、H24R、H24V、F25Y、F25W、F25I、F25A、S26T、S26A、S26C、S26G、S26N、Y27R、Y27F、E28T、 E28D、E28N、E28S、R29K、R29E、R29Q、R29D、I30K、I30L、I30V、L31A、L31I、N32D、N32G、N32H、 N32S、N32T、N32R、N32K、N32E、N32Q、N32A、N32V、D33H、D33N、D33T、E34T、E34N、E34D、E34Q、 E34R、R35N、R35K、R35H、D36P、D36E、D36N、D36S、D37E、D37K、L38I、L38V、L38M、L38F、L38Y、 C39T、C39A、C39S、C39V、V41L、V411、V41M、V41T、G42A、G42D、G42E、G44A、A48S、A48C、A48L、 A48R、A48K、T49S、T49V、T49N、T49P、T49K、T49A、A50C、A50N、A50G、D53E、D53N、K54Q、K54R、 A59-、D60E、D60N、D60H、F61Y、F61W、F61V、F61I、V62L、V62I、V62M、V62A、V62T、D63S、D63N、 D63E、L64I、L64F、L64M、G66P、R68Q、R68H、R68D、R68N、P72E、P72D、P72Q、H73G、H73A、H73N、 H73S、F75W、F75M、F75Y、E76Q、E76M、E76H、Y77F、Y77W、Y77H、Y77L、R79K、R79Q、R79H、R80H、 R80K、R80Q、R80Y、R80N、E81A、E81V、E81Q、E81L、E81P、W82G、W82S、P83D、P83V、P83K、P83A、 P83T、P83E、P83Q、P83M、P83L、P84K、P84R、A85S、A85G、A85C、A85T、A85P、A85V、V86I、V86L、 V86M、V86R、V86A、V86T、L87M、L87I、L87V、L87F、A88S、A88C、A88G、K89R、K89E、K89Q、K89P、 K89N、Y90F、Y90W、K91F、K91G、K91Y、K91L、K91W、L95I、L95V、L95M、D96A、D96E、D96G、D96P、 R97K、R97P、R97Q、R97H、R97E、R97A、D98E、D98N、D98S、D99E、D99Q、S100K、S100G、S100N、 S100P、Y101F、Y101W、Y101H、Y101P、V102T、V102I、V102L、Q103H、Q103E、Q103R、Q103N、 Q103K、Q103D、Q103Y、H104A、H104Y、H104V、H104I、H104F、H104R、D105E、D105P、D105T、 S106P、S106E、S106A、S106D、S106N、S106T、G107L、G107I、G107M、G107A、Y108H、Y108Q、 Y108W、Y108M、Y108V、L109K、L109M、L109I、L109V、R110Q、R110K、R110H、R110E、Lilli、 L111F、C112G、C112A、C112N、C112S、C112K、A113C、A113S、A113G、E114D、E114Q、E114P、 E114S、E114K、E114A、N116R、N116D、N116H、G117A、G117K、G117R、G117S、I118L、I118V、 L119I、L119M、K121R、K121M、K121Q、K121L、G122W、G122Q、G122N、S123E、S123D、S123N、 S123G、G124W、G124A、G124N、G125-、W126F、P129A、P129G、W131Y、W132Y、I133L、I133V、 C136A、C136G、C136S、L138I、L138V、L138M、L139I、L139V、L139M、V140A、V140I、V140L、 V140C、V140M、A142T、A142P、A142S、A142G、L143I、L143V、Y144F、Y144H、Y144W、Y144S、 Y144T、L145I、L145V、L145M、L145F、L145T、D146E、D146N、D146Q、Y147W、Y147F、Y147H、 Y147G、Y148F、Y148H、Y148L、M149W、M149L、M149I、M149F、L150I、L150V、A151L、A151C、 A151G、A151S、R152K、R152S、R152N、R152Q、R152D、P154K、P154E、P154R、I156L、I156V、 L157F、L157I、L157M、L157Y、L157W、L157P、A159S、A159G、A159C、A159T、A159P、A159V、 I160V、I160L、I161V、I161L、I161F、L162I、L162V、L162M、L162F、L162C、L162A、L162T、 L162S、L165I、L165V、F166Y、W168G、W168A、W168C、A181S、A181G、A181C、A181T、A181P、 A181V、L182I、L182V、L182M、N185H、N185Y、P186S、V187M、V187A、V187I、V187P、V188I、 V188L、V188A、V188T、Y190R、Y190H、Y190W、L191C、L191I、F192L、F192I、A195S、A195G、 A195M、A195Q、A195K、S202N、S202G、S202D、S202T、S202A、S202K、M203R、M203L、M203Q、 M203I、M204L、M204V、M204I、M204Q、M204C、L207I、L207V、Q208R、Q208E、Q208K、Q209E、 Q209K、Q209R、Q209D、Q209H、G213N、G213A、G213S、G213K、G213D、G213W、G213M、L216I、 L216F、L216T、T218C、T218S、T218V、T218A、T218N、T218P、D220E、D220N、D220R、D220G、 I221V、I221F、I221Y、I221H、D222N、D222Q、D222P、H223Y、H223F、H223Q、H223W、H223R、 H223E、H223N、H223M、H223V、H223P、H223I、H223L、H223D、H223A、V227I、V227L、V227M、 V227A、V227T、V227Q、G229A、G230H、G230N、G230D、G231S、G231N、G231A、A232V、A232T、 A232I、A232G、L233I、L233V、R234K、R234Q、R234N、R234E、R234H、R234T、K236S、K236G、 K236A、K236T、P237K、P237D、P237E、P237R、T238V、T238S、T238P、T238N、T238A、T238I、 T238Y、D239S、D239G、D239E、G240I、G240L、G240F、G240C、G240M、G240S、W241F、W241Y、 W241P、L242M、L242I、L242V、L242F、L242K、P243E、P243D、W244F、H246A、H246S、H246Y、 H246G、H246N、L247I、L247V、L250I、L250V、L250M、L250F、L250Y、F252I、F252Y、L255G、 L255M、L255A、L255K、L255C、L255F、E256D、E256Q、E256K、E256P、E256R、E256N、E256S、 E256V、E256A、E256T、E256G、E256H、E256I、A257V、A257Q、A257L、A257C、A257P、A257E、 L258M、L258I、Y259F、Y259W、Y259H、Y259L、G260A、G260C、K262Q、K262R、W263L、W263F、 V264I、V264L、V264M、V264F、F265Y、F265W、F265H、F265S、D267G、L268A、L268I、L268V、 H269N、H269Q、H269R、H269L、E270D、E270Q、E270K、L272I、L272F、E273D、E273A、E273G、 E273P、W274F、W274Y、W274M、K275R、K275E、K275Q、W276Y、E277K、E277D、E277R、P280K、 P280R、I281L、I281V、P282S、P282D、P282N、P282G、P283E、P283D、P283Q、L284I、L284M、 L284V、L284C、L284A、L284T、L284S、A285Y、A285C、A285F、A285V、A285S、A285L、R286K、 R286Q、R286H、R286E、R286L、R286M、R286V、R286A、P287K、P287D、P287E、P287G、P287Q、 P287S、P287R、P287A、E288D、E288L、E288K、E288V、E288Q、F289Y、F289R、F289H、A290G、 A290S、A290N、A290C、P291I、V293I、V293L、G294A、G294S、G294P、G294N、G294K、G294R、 G294E、G294D、G294Q、G294T、G294H、G294C、G294W、G294M、G294Y、G294V、C295L、C295I、 K296R、K296E、K296Q、K296N、K296P、L297I、L297V、G298F、G298A、G298W、G298S、W300F、 A301V、A301C、A301G、A301S、A301P、A301I、F303Y、F303W、F303K、V304I、V304F、V304L、 V304Y、A305V、A305I、A305L、A305T、A305C、L306I、L306V、L306M、L308F、L308I、W309A、 W309G、H311Q、H311E、H311R、H311Y、H311N、P312F、P312Y、S313T、S313N、S313G、S313A、 W314F、W314L、W314Y、W314I、W314M、W314V、H315Y、L317I、L317M、L317V、L317F、L317C、 L317A、L318I、L318V、L318C、L318A、V320I、V320T、V320P、V320L、C321Y、A322L、A322C、 A322S、A322G、W323T、V324I、V324L、V324M、C325A、C325G、C325S、T326S、T326V、T326N、 T326I、T326P、T326L、G327A、G327N、G327K、S328A、S328T、S328L、S328C、S328V、F329L、 F329Y、A332G、A332C、A332S、A332V、A332P、A332T、I336V、I336F、I336L、L337I、L337F、 L337M、 I340N、 I340L、 I340V、 I340M、 I340F、 I340T、 I342V、 I342D、 I342L、 I342C、 V344I、 V344L、V344A、V344M、K345G、K345R、K345A、I347V、I347L、G348P、P349D、P349E、D350E、 D350N、D350Q、D350G、D350R、D350K、G351A、G351C、G351S、G351P、G351V、K352-、S353-、 L354-、P355-、P355D、P355S、R356-、N357S、N357D、N357G、N357E、I358V、I358A、I358L、 D359E、D359N、D359P、D359T、W360F、A361G、A361V、A361C、A361S、A361T、R362Q、R362K、 R362H、R363H、R363K、R363N、I365V、I365L、T367S、T367N、T367P、T367V、T367A、T367D、 G372C、G372A、G372N、G372S、E374D、E374K、E374R、E374N、E374Q、E374H、E374S、E374P、 E374A、E374T、E374V、E374G、E374M、E374Y、W375K、W375G、G377A、G377W、H378Y、H378N、 H378F、H378Q、H378R、H378M、H378I、H378E、H378W、H378D、H378V、L379I、L379M、L379S、 L379V、L379A、L379T、F385W、F385Y、L395M、L395I、L395F、H396S、H396N、H396Y、H396Q、 H396E、A398S、A398C、A398G、H399Y、A401S、A401G、A401N、K402T、K402P、K402S、K402R、 K402E、K402Q、Q404E、Q404A、Q404R、Q404K、Q404H、Q404P、V406I、V406L、V406M、V406A、 V406T、Q408R、Q408H、Q408E、Q408N、Q408M、K409R、K409Q、K409T、K409M、V410I、V410H、 V410R、C411I、C411A、C411V、E413D、E413K、E413Q、E413R、E413P、E413N、E413S、E413H、 E413A、N414M、N414D、N414L、N414G、N414S、V416I、V416F、V416L、V416Y、N417K、N417R、 N417G、K419R、K419G、K419S、H420Y、H420Q、H420R、H420N、H420E、H420K、P422G、P422D、 I424V、I424C、G425A、G425L、G425N、G425P、G425D、G429D、G429N、G429S、S430A、S430T、 S430C、S430N、M431L、M431I、M431V、M431T、M431F、M431C、L432F、L432I、L432M、S433R、 S433K、S433Q、S433A、S433T、S433N、H434Y、H434Q、H434N、H434R、L435I、L435M、L435V、 L435F、G436K、G436S、G436P、A437G、A437K、A437P、A437S、L438I、L438M、L438V、G439A、 G439N、G439S、G439D、A440S、A440C、A440T、A440V、R441V、R441I、R441L、P442A、P442V、 T443V、T443I、T443A、T443G、T443L、W444-、W444Y、W444F、W444S、N445-、A446-、E447D、 E447Q、E447K、F448Y、F448W、F448K、M449L、M449I、M449G、A450G、A450E、A450S、A450P、 A450D、A450C、G451K、G451R、G451N、G451D、L452P、L452I、L452V、L452A、L452M、E453-、 E453D、E453S、E454-、K455-、S456-、S457-、V458-、E459-、C460-、R461-、L462-、R463-、 L464-、G465-、A466-、A467-、C468-、A469-、R470-、G471-、C472-、C472S、W473-、W473Q、 C474-、C474A、S475-、D476-、A477-、A478-、S479-、L480-、1481-、S482-、W483-、L484-、 G485-。優(yōu)選地，所述氨基酸序列還包含
[0024]-選自 " KHPGG "、" QHPGG"或 " RHPGG " 的基序，優(yōu)選選自 " KHPGGD "、" QHPG⑶"或 "RHPGGD"的基序，和
[0025]-選自 "GLNIQHDANHG" 或 "HVVGHH" 的基序，優(yōu)選選自 "AAIGLNIQHDANHG" 或 "QHVVGHH" 的基序。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，還提供了具有氨基酸序列SEQ ID N0. 86(即，在比對(duì)中匹配序列并且 不考慮由于下文中提及的突變的錯(cuò)配）和任選地一個(gè)或多個(gè)以下突變的S-4去飽和酶： H4S、H4Y、H4Q、H4E、H4N、A5S、A5G、A5C、A5P、A5T、A5V、A6R、A6G、A6K、A6S、A6N、T7K、T7S、 T7R、T7N、T7A、T7G、K8E、K8D、K8R、K8Q、G9V、G9I、G9A、G9M、G9C、G10S、G10N、G10D、G10A、 G10K、D11A、D11V、D11I、D11E、D11G、D11P、P12A、P12G、P12S、P12V、P12T、R15K、R15S、R15T、 R15A、R15Q、D16A、D16G、D16P、D16S、M17A、M17L、M17I、M17V、E18K、E18R、E18Q、H19Y、H19F、 H19I、H19M、H19L、H19Q、H19R、H19V、F20Y、F20W、F20I、F20A、S21T、S21A、S21C、S21G、S21N、 Y22R、Y22F、E23T、E23D、E23N、E23S、R24K、R24E、R24Q、R24D、I25K、I25L、I25V、L26A、L26I、 N27D、N27G、N27H、N27S、N27T、N27R、N27K、N27E、N27Q、N27A、N27V、D28H、D28N、D28T、E29T、 E29N、E29D、E29Q、E29R、R30N、R30K、R30H、D31P、D31E、D31N、D31S、D32E、D32K、L33I、L33V、 L33M、L33F、L33Y、C34T、C34A、C34S、C34V、V36L、V36I、V36M、V36T、G37A、G37D、G37E、G39A、 A43S、A43C、A43L、A43R、A43K、T44S、T44V、T44N、T44P、T44K、T44A、A45C、A45N、A45G、D48E、 D48N、K49Q、K49R、D54E、D54N、D54H、F55Y、F55W、F55V、F55I、V56L、V56I、V56M、V56A、V56T、 D57S、D57N、D57E、L58I、L58F、L58M、G60P、R62Q、R62H、R62D、R62N、P66E、P66D、P66Q、H67G、 H67A、H67N、H67S、F69W、F69M、F69Y、E70Q、E70M、E70H、Y71F、Y71W、Y71H、Y71L、R73K、R73Q、 R73H、R74H、R74K、R74Q、R74Y、R74N、E75A、E75V、E75Q、E75L、E75P、W76G、W76S、P77D、P77V、 P77K、P77A、P77T、P77E、P77Q、P77M、P77L、P78K、P78R、A79S、A79G、A79C、A79T、A79P、A79V、 V80I、V80L、V80M、V80R、V80A、V80T、L81M、L811、L81V、L81F、A82S、A82C、A82G、K83R、K83E、 K83Q、K83P、K83N、Y84F、Y84W、K85F、K85G、K85Y、K85L、K85W、L89I、L89V、L89M、D90A、D90E、 D90G、D90P、R91K、R91P、R91Q、R91H、R91E、R91A、D92E、D92N、D92S、D93E、D93Q、S94K、S94G、 S94N、S94P、Y95F、Y95W、Y95H、Y95P、V96T、V96I、V96L、Q97H、Q97E、Q97R、Q97N、Q97K、Q97D、 Q97Y、H98A、H98Y、H98V、H98I、H98F、H98R、D99E、D99P、D99T、S100P、S100E、S100A、S100D、 SIOON、SIOOT、G101L、G101I、G101M、G101A、Y102H、Y102Q、Y102W、Y102M、Y102V、L103K、 L103M、L103I、L103V、R104Q、R104K、R104H、R104E、L105I、L105F、C106G、C106A、C106N、 C106S、C106K、A107C、A107S、A107G、E108D、E108Q、E108P、E108S、E108K、E108A、NllOR、 NllOD、NllOH、G111A、G111K、G111R、G111S、I112L、I112V、L113I、L113M、K115R、K115M、 K115Q、K115L、G116W、G116Q、G116N、S117E、S117D、S117N、S117G、G118W、G118A、G118N、 W119F、P122A、P122G、W124Y、W125Y、I126L、I126V、C129A、C129G、C129S、L131I、L131V、 L131M、L132I、L132V、L132M、V133A、V133I、V133L、V133C、V133M、A135T、A135P、A135S、 A135G、L136I、L136V、Y137F、Y137H、Y137W、Y137S、Y137T、L138I、L138V、L138M、L138F、 L138T、D139E、D139N、D139Q、Y140W、Y140F、Y140H、Y140G、Y141F、Y141H、Y141L、M142W、 M142L、M142I、M142F、L143I、L143V、A144L、A144C、A144G、A144S、R145K、R145S、R145N、 R145Q、R145D、P147K、P147E、P147R、I149L、I149V、L150F、L150I、L150M、L150Y、L150W、 L150P、A152S、A152G、A152C、A152T、A152P、A152V、I153V、I153L、I154V、I154L、I154F、 L155I、L155V、L155M、L155F、L155C、L155A、L155T、L155S、L158I、L158V、F159Y、W161G、 W161A、W161C、A174S、A174G、A174C、A174T、A174P、A174V、L175I、L175V、L175M、N178H、 N178Y、P179S、V180M、V180A、V180I、V180P、V181I、V181L、V181A、V181T、Y183R、Y183H、 Y183W、L184C、L184I、F185L、F185I、A188S、A188G、A188M、A188Q、A188K、S195N、S195G、 S195D、S195T、S195A、S195K、M196R、M196L、M196Q、M196I、M197L、M197V、M197I、M197Q、 M197C、L200I、L200V、Q201R、Q201E、Q201K、Q202E、Q202K、Q202R、Q202D、Q202H、G206N、 G206A、G206S、G206K、G206D、G206W、G206M、L209I、L209F、L209T、T211C、T211S、T211V、 T211A、T211N、T211P、D213E、D213N、D213R、D213G、I214V、I214F、I214Y、I214H、D215N、 D215Q、D215P、H216Y、H216F、H216Q、H216W、H216R、H216E、H216N、H216M、H216V、H216P、 H216I、H216L、H216D、H216A、V220I、V220L、V220M、V220A、V220T、V220Q、G222A、G223H、 G223N、G223D、G224S、G224N、G224A、A225V、A225T、A225I、A225G、L226I、L226V、R227K、 R227Q、R227N、R227E、R227H、R227T、K229S、K229G、K229A、K229T、P230K、P230D、P230E、 P230R、T231V、T231S、T231P、T231N、T231A、T231I、T231Y、D232S、D232G、D232E、G233I、 G233L、G233F、G233C、G233M、G233S、W234F、W234Y、W234P、L235M、L235I、L235V、L235F、 L235K、P236E、P236D、W237F、H239A、H239S、H239Y、H239G、H239N、L240I、L240V、L243I、 L243V、L243M、L243F、L243Y、F245I、F245Y、L248G、L248M、L248A、L248K、L248C、L248F、 E249D、E249Q、E249K、E249P、E249R、E249N、E249S、E249V、E249A、E249T、E249G、E249H、 E249I、A250V、A250Q、A250L、A250C、A250P、A250E、L251M、L251I、Y252F、Y252W、Y252H、 Y252L、G253A、G253C、K255Q、K255R、W256L、W256F、V257I、V257L、V257M、V257F、F258Y、 F258W、F258H、F258S、D260G、L261A、L261I、L261V、H262N、H262Q、H262R、H262L、E263D、 E263Q、E263K、L265I、L265F、E266D、E266A、E266G、E266P、W267F、W267Y、W267M、K268R、 K268E、K268Q、W269Y、E270K、E270D、E270R、P273K、P273R、I274L、I274V、P275S、P275D、 P275N、P275G、P276E、P276D、P276Q、L277I、L277M、L277V、L277C、L277A、L277T、L277S、 A278Y、A278C、A278F、A278V、A278S、A278L、R279K、R279Q、R279H、R279E、R279L、R279M、 R279V、R279A、P280K、P280D、P280E、P280G、P280Q、P280S、P280R、P280A、E281D、E281L、 E281K、E281V、E281Q、F282Y、F282R、F282H、A283G、A283S、A283N、A283C、P284I、V286I、 V286L、G287A、G287S、G287P、G287N、G287K、G287R、G287E、G287D、G287Q、G287T、G287H、 G287C、G287W、G287M、G287Y、G287V、C288L、C288I、K289R、K289E、K289Q、K289N、K289P、 L290I、L290V、G291F、G291A、G291W、G291S、W293F、A294V、A294C、A294G、A294S、A294P、 A294I、F296Y、F296W、F296K、V297I、V297F、V297L、V297Y、A298V、A298I、A298L、A298T、 A298C、L299I、L299V、L299M、L301F、L301I、W302A、W302G、H304Q、H304E、H304R、H304Y、 H304N、P305F、P305Y、S306T、S306N、S306G、S306A、W307F、W307L、W307Y、W307I、W307M、 W307V、H308Y、L310I、L310M、L310V、L310F、L310C、L310A、L311I、L311V、L311C、L311A、 V313I、V313T、V313P、V313L、C314Y、A315L、A315C、A315S、A315G、W316T、V317I、V317L、 V317M、C318A、C318G、C318S、T319S、T319V、T319N、T319I、T319P、T319L、G320A、G320N、 G320K、S321A、S321T、S321L、S321C、S321V、F322L、F322Y、A325G、A325C、A325S、A325V、 A325P、A325T、I329V、I329F、I329L、L330I、L330F、L330M、I333N、I333L、I333V、I333M、 I333F、I333T、I335V、I335D、I335L、I335C、V337I、V337L、V337A、V337M、K338G、K338R、 K338A、I340V、I340L、G341P、P342D、P342E、D343E、D343N、D343Q、D343G、D343R、D343K、 G344A、G344C、G344S、G344P、G344V、N345S、N345D、N345G、N345E、I346V、I346A、I346L、 D347E、D347N、D347P、D347T、W348F、A349G、A349V、A349C、A349S、A349T、R350Q、R350K、 R350H、R351H、R351K、R351N、I353V、I353L、T355S、T355N、T355P、T355V、T355A、T355D、 G360C、G360A、G360N、G360S、E362D、E362K、E362R、E362N、E362Q、E362H、E362S、E362P、 E362A、E362T、E362V、E362G、E362M、E362Y、W363K、W363G、G365A、G365W、H366Y、H366N、 H366F、H366Q、H366R、H366M、H366I、H366E、H366W、H366D、H366V、L367I、L367M、L367S、 L367V、L367A、L367T、F373W、F373Y、L383M、L383I、L383F、H384S、H384N、H384Y、H384Q、 H384E、A386S、A386C、A386G、H387Y、A389S、A389G、A389N、K390T、K390P、K390S、K390R、 K390E、K390Q、Q392E、Q392A、Q392R、Q392K、Q392H、Q392P、V394I、V394L、V394M、V394A、 V394T、Q396R、Q396H、Q396E、Q396N、Q396M、K397R、K397Q、K397T、K397M、V398I、V398H、 V398R、C399I、C399A、C399V、E401D、E401K、E401Q、E401R、E401P、E401N、E401S、E401H、 E401A、N402M、N402D、N402L、N402G、N402S、V404I、V404F、V404L、V404Y、N405K、N405R、 N405G、K407R、K407G、K407S、H408Y、H408Q、H408R、H408N、H408E、H408K、P410G、P410D、 I412V、I412C、G413A、G413L、G413N、G413P、G413D、G417D、G417N、G417S、S418A、S418T、 S418C、S418N、M419L、M419I、M419V、M419T、M419F、M419C、L420F、L420I、L420M、S421R、 S421K、S421Q、S421A、S421T、S421N、H422Y、H422Q、H422N、H422R、L423I、L423M、L423V、 L423F、G424K、G424S、G424P、A425G、A425K、A425P、A425S、L426I、L426M、L426V、G427A、 G427N、G427S、G427D、A428S、A428C、A428T、A428V、R429V、R429I、R429L、P430A、P430V、 T431V、T431I、T431A、T431G、T431L、E432D、E432Q、E432K、F433Y、F433W、F433K、M434L、 M434I、M434G、A435G、A435E、A435S、A435P、A435D、A435C、G436K、G436R、G436N、G436D、 L437P、L437I、L437V、L437A、L437M。優(yōu)選地，所述氨基酸序列還包含
[0027] -選自 " KHPGG "、" QHPGG " 或 " RHPGG " 的基序，優(yōu)選選自 " KHPGGD "、" QHPG⑶"或 "RHPGGD"的基序，和
[0028] -選自 "GLNIQHDANHG" 或 "HVVGHH" 的基序，優(yōu)選選自 "AAIGLNIQHDANHG" 或 "QHVVGHH" 的基序。
[0029] 特別優(yōu)選的是具有SEQ ID N0. 86的骨架和任選地一個(gè)或多個(gè)以下突變的S-4 去飽和酶：H4S、H4Y、H4Q、H4E、H4N、A5S、A5G、A5C、A5P、A5T、A5V、A6R、A6G、A6K、A6S、A6N、 T7K、T7S、T7R、T7N、T7A、T7G、K8E、K8D、K8R、K8Q、G9V、G9I、G9A、G9M、G9C、G10S、G10N、G10D、 G10A、G10K、D11A、D11V、D11I、D11E、D11G、D11P、P12A、P12G、P12S、P12V、P12T、R15K、R15S、 R15T、R15A、R15Q、D16A、D16G、D16P、D16S、M17A、M17L、M17I、M17V、E18K、E18R、E18Q、H19Y、 H19F、H19I、F20Y、F20W、S21T、S21A、S21C、S21G、S21N、Y22R、Y22F、E23T、E23D、E23N、E23S、 R24K、R24E、R24Q、R24D、I25K、I25L、I25V、L26A、L26I、N27D、N27G、N27H、N27S、N27T、N27R、 D28H、D28N、D28T、E29T、E29N、E29D、E29Q、E29R、R30N、R30K、R30H、D31P、D31E、D31N、D31S、 D32E、D32K、L33I、L33V、L33M、L33F、C34T、C34A、C34S、C34V、V36L、V36I、V36M、V36T、G37A、 G37D、G37E、G39A、A43S、A43C、A43L、A43R、A43K、T44S、T44V、T44N、T44P、T44K、T44A、A45C、 A45N、A45G、D48E、D48N、K49Q、K49R、D54E、D54N、D54H、F55Y、F55W、F55V、F55I、V56L、V56I、 V56M、V56A、V56T、D57S、D57N、D57E、L58I、L58F、L58M、G60P、R62Q、R62H、R62D、R62N、P66E、 P66D、P66Q、H67G、H67A、H67N、H67S、F69W、F69M、F69Y、E70Q、E70M、E70H、Y71F、Y71W、Y71H、 Y71L、R73K、R73Q、R73H、R74H、R74K、R74Q、R74Y、R74N、E75A、E75V、E75Q、E75L、E75P、W76G、 P77D、P77V、P77K、P78K、P78R、A79S、A79G、A79C、A79T、A79P、A79V、V80I、V80L、V80M、V80R、 V80A、V80T、L81M、L81I、L81V、L81F、A82S、A82C、A82G、K83R、K83E、K83Q、K83P、K83N、Y84F、 Y84W、K85F、K85G、K85Y、K85L、K85W、L89I、L89V、L89M、D90A、D90E、D90G、D90P、R91K、R91P、 D92E、D92N、D92S、D93E、D93Q、S94K、S94G、S94N、S94P、Y95F、Y95W、Y95H、V96T、V96I、V96L、 Q97H、Q97E、Q97R、Q97N、H98A、H98Y、H98V、H98I、H98F、H98R、D99E、D99P、D99T、S100P、S100E、 S100A、S100D、S100N、S100T、G101L、G101I、G101M、G101A、Y102H、Y102Q、Y102W、Y102M、 Y102V、L103K、L103M、L103I、L103V、R104Q、R104K、R104H、R104E、L105I、L105F、C106G、 C106A、A107C、A107S、A107G、E108D、E108Q、E108P、E108S、N110R、N110D、N110H、G111A、 G111K、G111R、G111S、I112L、I112V、L113I、L113M、K115R、K115M、K115Q、K115L、G116W、 G116Q、G116N、S117E、S117D、S117N、S117G、G118W、G118A、G118N、W119F、P122A、P122G、 W124Y、W125Y、I126L、I126V、C129A、C129G、C129S、L131I、L131V、L131M、L132I、L132V、 L132M、V133A、V133I、V133L、V133C、V133M、A135T、A135P、A135S、A135G、L136I、L136V、 Y137F、Y137H、Y137W、Y137S、Y137T、L138I、L138V、D139E、D139N、D139Q、Y140W、Y140F、 Y140H、Y141F、Y141H、M142W、M142L、M142I、M142F、L143I、L143V、A144L、A144C、A144G、 A144S、R145K、R145S、R145N、R145Q、R145D、P147K、P147E、P147R、I149L、I149V、L150F、 L150I、L150M、L150Y、A152S、A152G、A152C、A152T、A152P、A152V、I153V、I153L、I154V、 I154L、L155I、L155V、L155M、L155F、L158I、L158V、F159Y、W161G、W161A、W161C、A174S、 A174G、A174C、A174T、A174P、A174V、L175I、L175V、L175M、N178H、N178Y、V180M、V180A、 V180I、V180P、V181I、V181L、V181A、V181T、Y183R、Y183H、Y183W、L184C、L184I、F185L、 F185I、A188S、A188G、A188M、A188Q、A188K、S195N、S195G、S195D、S195T、S195A、S195K、 M196R、M196L、M196Q、M196I、M197L、M197V、M197I、M197Q、M197C、L200I、L200V、Q201R、 Q201E、Q201K、Q202E、Q202K、Q202R、Q202D、Q202H、G206N、G206A、G206S、G206K、L209I、 L209F、L209T、T211C、T211S、T211V、T211A、T211N、T211P、D213E、D213N、D213R、D213G、 I214V、I214F、I214Y、D215N、D215Q、D215P、H216Y、V220I、V220L、V220M、V220A、V220T、 G223H、G223N、G223D、G224S、G224N、G224A、A225V、A225T、A225I、A225G、L226I、L226V、 R227K、R227Q、R227N、R227E、R227H、K229S、K229G、K229A、K229T、P230K、P230D、P230E、 P230R、T231V、T231S、T231P、T231N、T231A、D232S、D232G、D232E、G233I、G233L、G233F、 W234F、L235M、L235I、P236E、P236D、H239A、H239S、H239Y、H239G、H239N、L240I、L240V、 L243I、L243V、L243M、L243F、F245I、F245Y、L248G、L248M、L248A、L248K、L248C、L248F、 E249D、E249Q、E249K、A250V、A250Q、A250L、A250C、A250P、A250E、L251M、L251I、Y252F、 G253A、G253C、K255Q、K255R、W256L、W256F、V257I、V257L、V257M、V257F、F258Y、D260G、 L261A、L261I、L261V、H262N、H262Q、H262R、E263D、E263Q、E263K、L265I、L265F、E266D、 E266A、E266G、E266P、W267F、W267Y、K268R、K268E、K268Q、W269Y、E270K、E270D、E270R、 P273K、P273R、I274L、I274V、P275S、P275D、P275N、P275G、P276E、P276D、L277I、L277M、 L277V、L277C、A278Y、A278C、A278F、A278V、A278S、A278L、R279K、R279Q、P280K、P280D、 P280E、E281D、E281L、E281K、E281V、E281Q、F282Y、F282R、F282H、A283G、A283S、A283N、 A283C、P284I、V286I、V286L、G287A、G287S、G287P、C288L、C288I、K289R、K289E、K289Q、 K289N、K289P、L290I、L290V、G291F、G291A、G291W、G291S、A294V、A294C、A294G、A294S、 F296Y、F296W、F296K、V297I、V297F、V297L、V297Y、A298V、A298I、A298L、A298T、A298C、 L299I、L299V、L299M、L301F、L301I、W302A、W302G、H304Q、H304E、H304R、H304Y、H304N、 P305F、P305Y、S306T、S306N、S306G、S306A、W307F、W307L、H308Y、L310I、L310M、L310V、 L310F、L311I、L311V、L311C、V313I、V313T、V313P、V313L、C314Y、A315L、A315C、A315S、 A315G、W316T、V317I、V317L、C318A、C318G、C318S、T319S、T319V、T319N、T319I、T319P、 T319L、G320A、G320N、G320K、S321A、S321T、S321L、S321C、S321V、F322L、F322Y、A325G、 A325C、A325S、A325V、A325P、A325T、I329V、I329F、I329L、L330I、L330F、L330M、I333N、 I333L、I333V、I333M、I333F、I333T、I335V、I335D、I335L、I335C、V337I、V337L、V337A、 V337M、K338G、K338R、K338A、I340V、I340L、P342D、D343E、D343N、D343Q、D343G、G344A、 G344C、G344S、G344P、G344V、N345S、N345D、N345G、N345E、I346V、I346A、I346L、D347E、 D347N、D347P、D347T、W348F、A349G、A349V、A349C、A349S、A349T、R350Q、R350K、R350H、 R351H、R351K、R351N、I353V、I353L、T355S、T355N、T355P、T355V、T355A、T355D、G360C、 G360A、G360N、G360S、E362D、E362K、E362R、W363K、W363G、G365A、G365W、H366Y、H366N、 H366F、H366Q、H366R、L367I、L367M、L367S、L367V、L367A、L367T、F373W、F373Y、L383M、 L383I、L383F、H384S、H384N、H384Y、H384Q、H384E、A386S、A386C、A386G、H387Y、A389S、 A389G、A389N、K390T、K390P、K390S、K390R、K390E、Q392E、Q392A、Q392R、Q392K、Q392H、 Q392P、V394I、V394L、V394M、V394A、V394T、Q396R、Q396H、Q396E、Q396N、Q396M、K397R、 K397Q、K397T、K397M、V398I、V398H、V398R、C399I、C399A、C399V、E401D、E401K、E401Q、 E401R、E401P、N402M、N402D、N402L、N402G、N402S、V404I、V404F、V404L、V404Y、N405K、 N405R、N405G、K407R、K407G、K407S、H408Y、H408Q、H408R、P410G、P410D、I412V、I412C、 G413A、G413L、G413N、G413P、G413D、G417D、G417N、G417S、S418A、S418T、S418C、S418N、 M419L、M419I、M419V、M419T、M419F、M419C、L420F、L420I、L420M、S421R、S421K、S421Q、 S421A、S421T、S421N、H422Y、H422Q、H422N、H422R、L423I、L423M、L423V、L423F、G424K、 G424S、G424P、A425G、A425K、A425P、A425S、L426I、L426M、L426V、G427A、G427N、G427S、 G427D、A428S、A428C、A428T、A428V、R429V、R429I、R429L、P430A、P430V、T431V、T431I、 T431A、T431G、T431L、E432D、E432Q、E432K、F433Y、F433W、F433K、M434L、M434I、M434G、 A435G、A435E、A435S、A435P、A435D、A435C、G436K、G436R、G436N、G436D、L437P、L437I、 L437V、L437A、L437M。優(yōu)選地，所述氨基酸序列還包含
[0030] -選自 " KHPGG "、" QHPGG " 或 " RHPGG " 的基序，優(yōu)選選自 " KHPGGD "、" QHPG⑶"或 "RHPGGD"的基序，和
[0031] -選自 "GLNIQHDANHG" 或 "HVVGHH" 的基序，優(yōu)選選自 "AAIGLNIQHDANHG" 或 "QHVVGHH" 的基序。
[0032] 本發(fā)明還優(yōu)選的是具有SEQ ID N0. 86的骨架和任選地一個(gè)或多個(gè)以下突變的 S -4 去飽和酶：H4S、H4Y、A5S、A5G、A6R、A6G、I7K、I7S、I7R、K8E、G9V、G10S、D11A、D11V、 P12A、R15K、R15S、D16A、M17A、E18K、S21T、S21A、E23T、R24K、I25K、L26A、N27D、N27G、D28H、 E29T、E29N、R30N、D31P、L33I、V36L、A43S、A43C、T44S、T44V、T44N、T44P、A45C、D54E、F55Y、 V56L、V56I、D57S、L58I、R62Q、H67G、F69W、E70Q、Y71F、R73K、R74H、R74K、E75A、E75V、A79S、 A79G、V80I、V80L、L81M、A82S、K83R、K83E、Y84F、K85F、K85G、L89I、D90A、D90E、S94K、Y95F、 V96T、Q97H、H98A、H98Y、D99E、S100P、S100E、S100A、G101L、Y102H、Y102Q、L103K、R104Q、 A107C、E108D、N110R、G111A、L113I、K115R、S117E、L131I、L132I、V133A、V133I、A135T、 Y137F、Y137H、Y140W、M142W、A144L、R145K、R145S、L150F、A152S、A152G、L155I、A174S、 A174G、L175I、V180M、V180A、Y183R、A188S、A188G、S195N、S195G、M196R、M197L、M197V、 Q201R、Q202E、Q202K、G206N、L209I、T211C、T211S、D213E、I214V、V220I、V220L、A225V、 R227K、R227Q、K229S、K229G、T231V、T231S、G233I、L235M、H239A、L243I、L248G、L248M、 E249D、A250V、A250Q、K255Q、V257I、L261A、H262N、E266D、K268R、E270K、P275S、L277I、 A278Y、A278C、E281D、E281L、F282Y、A283G、K289R、L290I、G291F、A294V、V297I、A298V、 A298I、L299I、H304Q、H304E、S306T、L310I、L311I、V313I、A315L、T319S、T319V、S321A、 S321T、A325G、A325C、I329V、I333N、I333L、I335V、V337I、K338G、D343E、G344A、N345S、 I346V、D347E、A349G、A349V、T355S、T355N、G360C、E362D、H366Y、L367I、L367M、H384S、 H384N、A386S、A389S、K390T、K390P、Q392E、Q392A、V394I、Q396R、K397R、V398I、E401D、 E401K、N402M、N402D、V404I、N405K、G413A、S418A、M419L、M419I、L420F、S421R、S421K、 S421Q、H422Y、L423I、A425G、L426I、G427A、A428S、R429V、T431V、T431I、F433Y、M434L、 A435G、A435E、G436K、L437P、L437I。優(yōu)選地，所述氨基酸序列還包含
[0033] -選自 " KHPGG "、" QHPGG " 或 " RHPGG " 的基序，優(yōu)選選自 " KHPGGD "、" QHPG⑶"或 "RHPGGD"的基序，和
[0034] -選自 "GLNIQHDANHG" 或 "HVVGHH" 的基序，優(yōu)選選自 "AAIGLNIQHDANHG" 或 "QHVVGHH" 的基序。
[0035] 甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的S-4去飽和酶具有SEQ ID NO. 86的骨架和任選地一個(gè) 或多個(gè)以下突變：H4S、A5S、A6R、I7K、I7S、K8E、K8D、G9V、G10S、D11A、D11V、P12A、R15S、D16A、 M17A、E18K、S21T、Y22R、E23T、R24E、I25K、L26A、D28H、D28T、E29T、R30N、D31P、D31S、D32K、 C34T、V36L、G37E、G39A、A43L、T44K、A45N、D48E、D54H、F55V、V56L、D57S、L58F、G60P、R62Q、 P66E、H67A、E70M、Y71L、R73Q、R74Y、E75A、P78K、A79S、V80R、L81M、A82S、K83E、Y84F、K85F、 L89V、D90A、R91P、D92S、D93E、S94K、V96T、H98A、H98V、D99T、S100P、S100E、G101L、G101A、 Y102M、L103K、R104Q、L105I、A107S、N110R、G111A、G111K、L113M、K115M、G116Q、S117E、 G118W、W119F、P122A、W124Y、W125Y、I126L、C129A、L131I、L132I、L132V、V133A、A135T、 L136V、Y137S、Y137T、L138I、D139E、M142W、L143I、A144L、R145S、P147K、I149L、L150F、 A152S、I153V、L158V、F159Y、W161A、A174S、L175V、N178H、N178Y、V180M、V180A、V181I、 Y183R、L184C、F185L、A188S、A188M、S195N、M196R、M197V、L200I、Q201R、Q202E、L209T、 T211C、D213R、D215Q、G223H、G224S、A225V、L226I、K229S、P230R、D232S、G233L、L235M、 P236E、H239A、H239S、L240I、L243V、F245I、L248G、A250Q、L251M、G253A、K255Q、W256L、 V257L、D260G、L261A、E263D、L265I、E266A、K268R、W269Y、E270K、P273K、I274L、P275S、 P276E、A278Y、P280K、E281L、F282Y、F282R、A283N、P284I、V286I、G287A、C288L、K289R、 L290V、G291F、G291A、F296K、V297F、A298V、L299V、L301F、W302A、H304Q、P305F、S306T、 W307L、H308Y、C314Y、A315L、W316T、C318A、T319I、G320A、S321A、F322L、A325G、I329F、 L330I、I333N、V337A、K338G、K338A、D343Q、G344A、N345S、I346A、D347T、W348F、A349V、 A349T、R350Q、R351H、I353V、T355S、G360C、E362K、W363K、G365A、L367S、F373Y、L383M、 H384S、A386S、H387Y、A389S、K390T、Q392A、V394L、Q396R、K397Q、K397T、V398H、V398R、 C399I、E401K、N402M、N402L、V404F、V404Y、N405K、K407R、K407S、P410G、I412V、G413L、 G417D、G417S、S418A、M419T、L420F、L420M、S421R、S421Q、H422Q、L423M、L423V、G424K、 A425K、L426M、G427A、A428S、A428T、R429V、P430A、T431V、T431G、E432D、F433K、M434L、 M434G、A435G、A435E、G436K、G436R、L437P、L437A。優(yōu)選地，所述氨基酸序列還包含
[0036]-選自 " KHPGG "、" QHPGG " 或 " RHPGG " 的基序，優(yōu)選選自 " KHPGGD "、" QHPG⑶"或 "RHPGGD"的基序，和
[0037]-選自 "GLNIQHDANHG" 或 "HVVGHH" 的基序，優(yōu)選選自 "AAIGLNIQHDANHG" 或 "QHVVGHH" 的基序。
[0038] 并且甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的S-4去飽和酶具有SEQ ID N0. 86的骨架和一個(gè)或 多個(gè)以下突變：H4S、A5S、A6R、I7K、I7S、K8E、G9V、G10S、D11A、D11V、P12A、R15S、D16A、M17A、 E18K、S21T、E23T、I25K、L26A、D28H、E29T、R30N、D31P、V36L、V56L、D57S、R62Q、E75A、A79S、 L81M、A82S、K83E、Y84F、K85F、D90A、S94K、V96T、H98A、S100P、S100E、G101L、L103K、R104Q、 N110R、G111A、S117E、L131I、L132I、V133A、A135T、M142W、A144L、R145S、L150F、A152S、 A174S、V180M、V180A、Y183R、A188S、S195N、M196R、M197V、Q201R、Q202E、T211C、A225V、 K229S、L235M、H239A、L248G、A250Q、K255Q、L261A、K268R、E270K、P275S、A278Y、E281L、 F282Y、K289R、G291F、A298V、H304Q、S306T、A315L、S321A、A325G、I333N、K338G、G344A、 N345S、A349V、T355S、G360C、H384S、A386S、A389S、K390T、Q392A、Q396R、E401K、N402M、 N405K、S418A、L420F、S421R、S421Q、G427A、A428S、R429V、T431V、M434L、A435G、A435E、 G436K、L437P。優(yōu)選地，所述氨基酸序列還包含
[0039]-選自 " KHPGG "、" QHPGG " 或 " RHPGG " 的基序，優(yōu)選選自 " KHPGGD "、" QHPG⑶"或 "RHPGGD"的基序，和
[0040]-選自 "GLNIQHDANHG" 或"HVVGHH"，優(yōu)選選自 "AAIGLNIQHDANHG" 或"QHVVGHH" 的 基序。
[0041] 應(yīng)理解，優(yōu)選選擇突變以增加突變序列與SEQ ID N0. 79序列之間的序列同一性。 照這樣，特別制備非功能性突變體的危險(xiǎn)降低。
[0042] 因此，還優(yōu)選的是本發(fā)明的S -4去飽和酶具有SEQ ID N0. 79的骨架，優(yōu)選具有一 個(gè)或多個(gè)以下突變：V9-、V10G、S11G、D12-、S13-、L20-、K21-、E29R、K37D、E42G、F63L、F63I、 L76Y、L76F、L76W、Q78R、Y79R、S81W、L82P、S84A、E88K、Y89F、V94L、V94I、T104D、Q109R、 K111C、A113E、R115N、W123G、W124F、W129Y、Y130W、I136L、L137I、D144E、Y145W、Y145F、 W147M、I158V、S160L、Y164F、S179A、I205L、C216T、R218D、S229G、T232R、R235P、P239W、 E241P、F242W、V262I、V262L、D268E、M272W、Y274W、K278P、L279I、K285P、I289P、I291V、 R294K、V295L、V295I、F298W、V304L、V304I、H309Q、F310P、Y313H、A323C、A325G、L327F、 G330A、A342V、A342I、P346G、E347P、A349G、K350-、W354F、S361T、C366G、K369W、I372H、 Y379F、K414H、G416P、D423G、T425M、F426L、Q428H、V429L、V429I、A436P、Y438-、N439-、 E440D。在這些突變中，更優(yōu)選以下：V9-、V10G、S11G、D12-、S13-、L20-、K21-、E29R、F63L、 L76Y、L76f、S81W、L82P、Y89F、V94L、T104D、K111C、W123G、W124F、Y130W、I136L、Y164F、 R218D、S229G、T232R、R235P、P239W、E241P、F242W、V262i、M272W、Y274W、K285P、F298W、 V304L、A325G、L327F、E347P、K350-、C366G、K369W、I372H、K414H、G416P、Q428H、V429L、 A436P、Y438-、N439-。甚至更優(yōu)選的是以下突變：V9-、D12-、S13-、L20-、K21-、L82P、W123G、 Y130W、R235P、P239W、E241P、M272W、Y274W、K285P、F298W、K350-、C366G、G416P、Y438-、 N439-。當(dāng)與S-5延伸酶組合時(shí)仍然產(chǎn)生高效S-4去飽和酶的SEQ ID NO. 79單獨(dú)或組合 的 10 個(gè)最優(yōu)選突變是：V9-、D12-、S13-、L20-、K21-、Y130W、R235P、K350-、Y438-、N439-。 在這些列表中，表不缺失。
[0043] 本發(fā)明還提供篩選S -4去飽和酶基因的方法，其包括步驟
[0044] a)從屬于Ichthyosporea或定鞭藻綱（Haptophyceae)的分類等級(jí)，優(yōu)選魚孢霉目 (1〇111：117(^110111(1&)或？&￥1〇￥&168目，更優(yōu)選八11111'〇1^0&、〇6〇1；[1]1&叉、1(3111：117(^11011118、帕金 蟲（Pseudoperkinsus)、膠抱子蟲抱子（Psorospermium)或Sphaeroforma屬的生物提取遺 傳物質(zhì)，
[0045] b)將所述遺傳物質(zhì)與編碼如上文或下文定義的本發(fā)明的S -4去飽和酶的至少10 個(gè)，優(yōu)選至少20個(gè)連續(xù)氨基酸的核酸在嚴(yán)格條件下雜交，和
[0046] c)檢測(cè)雜交或雜交的缺失。
[0047] 雜交表明在步驟a)中提供遺傳的生物確實(shí)包含S-4去飽和酶的基因。
[0048] 特別優(yōu)選的是通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)雜交或雜交的缺失。如果探針與充當(dāng)擴(kuò)增反 應(yīng)模板的遺傳物質(zhì)雜交，那么該反應(yīng)將僅提供明顯的產(chǎn)物。因此，本發(fā)明還提供篩選S-4 去飽和酶基因的方法，其包括步驟
[0049] a)從屬于Ichthyosporea或定鞭藻綱的分類等級(jí)，優(yōu)選魚孢霉目或Pavlovales 目，更優(yōu)選 Anurofeca、Creolimax、Ichthyophonus、帕金蟲、膠抱子蟲抱子或 Sphaeroforma 屬的生物提取遺傳物質(zhì)，
[0050] b)提供用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)物，用于在嚴(yán)格條件下擴(kuò)增編碼如上文或下文定 義的本發(fā)明的S -4去飽和酶的至少10個(gè)，優(yōu)選至少20個(gè)連續(xù)氨基酸的核酸，和
[0051] C)檢測(cè)擴(kuò)增或擴(kuò)增的缺失。
[0052] 擴(kuò)增表明在步驟a)中提供遺傳物質(zhì)的生物確實(shí)包含S -4去飽和酶的基因。
[0053] 用于雜交的核酸或用于核酸擴(kuò)增，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)物優(yōu)選針對(duì)編碼 保守氨基酸基序的核酸區(qū)段，其中所述基序優(yōu)選包含
[0054]-選自 " KHPGG "、" QHPGG " 或 " RHPGG " 的基序，優(yōu)選選自 " KHPGGD "、" QHPG⑶"或 "RHPGGD"的基序，和
[0055]-選自 "GLNIQHDXNHG" 或 "HVVGHH" 的基序，優(yōu)選選自 "AAIGLNIQHDANHG" 或 "QHVVGHH" 的基序。
[0056] 下文描述了用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的合適引物。
[0057] 因此，本發(fā)明還涉及包含選自以下的核酸序列的多核苷酸：
[0058] &)具有如5￡01〇勵(lì)8:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、78或83中所示核苷酸 序列的核酸序列，
[0059] b)編碼具有如 SEQIDN0s:2、5、8、ll、14、17、20、23、26、29、32、79、84、85 或 86 中 所示氨基酸序列的多肽，或上述S -4去飽和酶的核酸序列，
[0060] C)與a)或b)的核酸序列具有至少70%同一性的核酸序列，其中所述核酸序列編 碼具有去飽和酶、酮酰基-CoA合酶（KCS)或酮?；?CoA還原酶（KCR)或溶血磷脂-輔酶 A合酶（LACS)活性的多肽，
[0061]d)編碼具有去飽和酶、酮?；?CoA合酶（KCS)、酮?；?CoA還原酶（KCR)或溶血 磷脂-輔酶A合酶（LACS)活性并具有與a) -c)任一項(xiàng)的氨基酸序列具有至少60%同一性 的氨基酸序列的多肽的核酸序列；和
[0062]e)能夠在嚴(yán)格條件下與a)_d)任一項(xiàng)雜交的核酸序列，其中所述核酸序列編碼具 有去飽和酶、酮?；?CoA合酶（KCS)、酮?；?CoA還原酶（KCR)或溶血磷脂-輔酶A合酶 (LACS)活性的多肽。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"指這樣的多核苷酸，其包含編碼具有去飽和 酶、酮?；?CoA合酶（KCS)、酮?；?CoA還原酶（KCR)或溶血磷脂-輔酶A合酶（LACS)活 性的多肽的核酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明多核苷酸編碼的分別具有去飽和酶、KCS、KCR或LACS 活性的多肽在植物中表達(dá)時(shí)應(yīng)該能夠增加例如種子油或完整植物或其部分中PUFA的量， 特別是LCPUFA的量。與產(chǎn)生LCPUFA的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锵啾葧r(shí)，這種增加優(yōu)選地是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯 著的，所述轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锉磉_(dá)為L(zhǎng)CPUFA合成所需的最小集合的去飽和酶和延伸酶，但是 不表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)法（包括例如斯氏t-檢驗(yàn)） 確定增加是否是顯著的。更優(yōu)選地，增加是與所述對(duì)照相比，含有LCPUFA的甘油三酯的量 增加至少5 %、至少10 %、至少15 %、至少20 %或至少30 %。優(yōu)選地，之前所指的LCPUFA是 具有C-20、C-22或C-24脂肪酸主體（body)的多不飽和脂肪酸，更優(yōu)選是ARA、EPA或DHA。 在所附實(shí)施例中描述用于測(cè)定之前所提及的活性的合適測(cè)定法。
[0064] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"?；D(zhuǎn)移酶活性"或"酰基轉(zhuǎn)移酶"包括所有的酶活性和酶， 其通過(guò)轉(zhuǎn)酯過(guò)程能夠轉(zhuǎn)移或參與將PUFA，特別是LCPUFA從?；?CoA池或膜脂轉(zhuǎn)移到甘油 三酯中，從酰基-CoA池轉(zhuǎn)移到膜脂和從膜脂轉(zhuǎn)移到?；?CoA池。將理解的是，該?；D(zhuǎn)移 酶活性將導(dǎo)致例如種子油中酯化成甘油三酯的LCPUFA增加。特別地，設(shè)想這些?；D(zhuǎn)移 酶能夠產(chǎn)生具有酯化的EPA或甚至DHA的甘油三酯，或設(shè)想這些?；D(zhuǎn)移酶能夠通過(guò)在酰 基-CoA池（延伸位點(diǎn)）和膜脂（去飽和的主要位點(diǎn)）之間增加所需PUFA的特定中間物 的流量而增加所需PUFA的合成。尤其是，如本文所用的酰基轉(zhuǎn)移酶活性涉及溶血磷脂?；?轉(zhuǎn)移酶（LPLAT)活性，優(yōu)選地溶血磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶（LPCAT)或溶血磷脂酰乙醇胺酰 基轉(zhuǎn)移酶（LPEAT)活性、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（LPAAT)活性、甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶 (GPAT)活性或二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT)，并且更優(yōu)選地涉及PLAT、LPAAT、DGAT或GPAT 活性。
[0065]術(shù)語(yǔ)"去飽和酶"包括所有的酶活性和酶，其催化具有不同長(zhǎng)度和不飽和碳原子 雙鍵數(shù)量的脂肪酸的去飽和作用。尤其是，這包括S-4 (d4)去飽和酶，其催化第4個(gè)和第 5個(gè)碳原子的脫氫作用。S-5(d5)去飽和酶，其催化第5個(gè)和第6個(gè)碳原子的脫氫作用。 S -6 (d6)去飽和酶，其催化第6個(gè)和第7個(gè)碳原子的脫氫作用。S -8 (d8)去飽和酶，其催化 第8個(gè)和第9個(gè)碳原子的脫氫作用。S-9 (d9)去飽和酶，其催化第9個(gè)和第10個(gè)碳原子的 脫氫作用。S-12 (dl2)去飽和酶，其催化第12個(gè)和第13個(gè)碳原子的脫氫作用。S-15 (dl5) 去飽和酶，其催化第15個(gè)和第16個(gè)碳原子的脫氫作用。應(yīng)理解，脂肪酸可以結(jié)合?；d體 蛋白質(zhì)（ACP)、輔酶A(C 〇A)或磷脂中，由此形成不同的池。去飽和酶一般展示對(duì)這些池之一 的優(yōu)選性。
[0066]術(shù)語(yǔ)"延伸酶"和"d5Elo、d6Elo或d9Elo"與KCS同義并且指酮?；?CoA合酶酶 活性，其允許在脂肪酸中引入兩個(gè)碳原子，由此延長(zhǎng)脂肪酸。尤其是，d5Elo、d6Elo或d9Elo 催化將兩個(gè)碳原子引入到在位置5、6或9上分別具有18個(gè)或20個(gè)碳原子和雙鍵的脂肪酸 中。
[0067] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"KCR"指酮?；?CoA還原酶活性，其在脂肪酸延伸過(guò)程中將酮 ?；?CoA的酮基基團(tuán)還原成羥基基團(tuán)。
[0068] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"DH"指脫水酶活性，其去除羥基基團(tuán)，導(dǎo)致酰基-2-烯-CoA酯 (S -2-烯酰-CoA)和H20在脂肪酸延伸過(guò)程中的形成。
[0069]如本文所用的術(shù)語(yǔ)"ECR"指烯酰-CoA還原酶活性，其在脂肪酸延伸過(guò)程中還原 S -2-烯酰-CoA的雙鍵，產(chǎn)生延長(zhǎng)的?；?CoA酯。
[0070] 脂肪酸延伸以4種酶代表的四個(gè)步驟催化：KCR(酮?；?CoA合酶）、KCR(酮酰 基-CoA還原酶）、DH (脫水酶）和ECR (烯酰-CoA還原酶）。在第一步中，脂肪酸-CoA酯 與丙二酰-CoA縮合，產(chǎn)生延長(zhǎng)了兩個(gè)碳原子的酮?；?CoA中間體和C0 2。該中間體的酮 基基團(tuán)然后由KCR還原成羥基基團(tuán)。在下一步中，DH切去羥基基團(tuán)（產(chǎn)生H20)，形成酰 基-2-烯-CoA酯（S -2-烯酰-CoA)。在最后一步中，在第2、3位置上的雙鍵由ECR還 原，形成延長(zhǎng)的醜基-CoA 酯（Buchanan, Gruissem, Jones (2000) Biochemistry&Molecular biology of plants, American Society of Plant Physiologists)。
[0071] 在本發(fā)明的研究中，已經(jīng)提供了對(duì)產(chǎn)生PUFA具有優(yōu)良去飽和酶、KCS、KCR、DH和 ECR催化活性的酶。
[0072] 更優(yōu)選地，具有如在SEQ ID N0 :1中所示的核酸序列的多核苷酸編碼具有如在SEQ ID N0 :2中所示的氨基酸序列的多肽或其變體，所述多肽或其變體優(yōu)選地展示d6-去飽和 酶活性。
[0073] 具有如在SEQ ID NO :4中所示的核酸序列的多核苷酸編碼優(yōu)選地展示d9-去飽和 酶活性的具有如在SEQ ID N0 :5中所示的氨基酸序列的多肽或其變體。
[0074] 具有如在SEQ ID N0 :7和10中所示的核酸序列的多核苷酸編碼優(yōu)選地展示〇3_去 飽和酶活性的具有如在SEQ ID N0 :8和11中所示的氨基酸序列的多肽或其變體。
[0075] 具有如在SEQIDN0 :13中所示的核酸序列的多核苷酸編碼優(yōu)選地展示dl2_去飽 和酶活性的具有如在SEQIDN0:14中所示的氨基酸序列的多肽或其變體。
[0076] 具有如在SEQ ID N0 :78中所示的核酸序列的多核苷酸編碼優(yōu)選地展示d4-去飽 和酶活性的具有如在SEQ ID N0 :79中所示的氨基酸序列的多肽或其變體。已經(jīng)在上文詳 細(xì)描述了其他優(yōu)選的S-4去飽和酶多肽序列。
[0077] 具有如在SEQIDN0. 83中所示的核酸序列的多核苷酸編碼優(yōu)選地展示溶血磷脂 輔酶A合酶活性的具有如在SEQIDN0. 84中所示的氨基酸序列的多肽或其變體。
[0078] 具有如在SEQ ID勵(lì)8:16、19、22、25或28中所示的核酸序列的多核苷酸編碼優(yōu)選 地展示酮?；?CoA合酶活性的具有如在SEQ ID NOs: 17、20、23、26或29中所示的氨基酸 序列的多肽或其變體。尤其是，SEQ ID N0. 16編碼展示d5-延伸酶活性的多肽SEQ ID N0 17 ;SEQ ID NO. 19、22和25分別編碼展示d6-延伸酶活性的多肽SEQ ID NO 20、23和26; SEQ ID NO. 28編碼展示d9-延伸酶活性的多肽SEQ ID NO 29。
[0079] 具有如在SEQ ID NO :31中所示的核酸序列的多核苷酸編碼優(yōu)選地展示酮酰 基-CoA還原酶活性的具有如在SEQ ID N0 :32中所示的氨基酸序列的多肽或其變體。
[0080] 根據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)優(yōu)選地從金黃色破囊壺菌（Thraustochytrium aureum)和 Sphaeroforma arctica獲得如上定義的編碼具有去飽和酶、KCS、KCR和LACS活性的多 肽的多核苷酸。然而，可以從其他物種中鑒定直向同源物、旁系同源物或其他同系物。優(yōu) 選地，它們獲自植物如藻類，例如等鞭金藻屬（Isochrysis)、Mantoniella、Ostreococcus 或Crypthecodinium，藻類/娃藻類，如褐指藻、海鏈藻（Thalassiosira)或破囊壺菌 (Thraustochytrium)，領(lǐng)鞭蟲（choanoflagellates)，如 Monosiga，苔蘚，如劍葉蘚屬或 角齒蘚屬（Ceratodon)或高等植物，如報(bào)春花科（Primulaceae)，如石栗（Aleuritia)、 Calendula stellata、Osteospermum spinescens 或 Osteospermum hyoseroides,微生物， 如真菌，如曲霉屬（Aspergillus)、疫霉屬（Phytophthora)、蟲霉屬（Entomophthora)、毛霉 屬（Mucor)或被孢霉屬，細(xì)菌，如希瓦氏菌（Shewanella)，酵母或動(dòng)物。優(yōu)選的動(dòng)物是線 蟲，如新桿狀線蟲（Caenorhabditis)，昆蟲或脊椎動(dòng)物。在脊椎動(dòng)物中，核酸分子可以優(yōu)選 來(lái)自真骨類（Euteleostomi)、福鰭魚綱（Actinopterygii);新鰭類（Neopterygii);真骨 魚類（Teleostei);真真骨魚（Euteleostei)、原棘鰭總目（Protacanthopterygii)、鮭目 (Salmoniformes);鮭科（Salmonidae)或大麻哈魚屬（Oncorhynchus)，更優(yōu)選來(lái)自鮭目， 最優(yōu)選地，鮭科，如鮭屬（Salmo)，例如來(lái)自裂喉大麻哈魚（Oncorhynchus mykiss)、Trutta trutta或河鮭（Salmo trutta fario)的屬和種。此外，該核酸分子可以獲自娃藻類，如海 鏈藻屬或褐指藻屬。
[0081] 因此，根據(jù)本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"還包括上述特定多核苷酸的變體，其代 表了本發(fā)明多核苷酸的直向同源物、旁系同源物或其他同系物。此外，本發(fā)明多核苷酸的 變體也包括人工改造的突變蛋白。所述突變蛋白包括，例如通過(guò)誘變技術(shù)產(chǎn)生的并且顯示 出改進(jìn)的或改變的底物特異性的酶，或密碼子優(yōu)化的多核苷酸。多核苷酸變體優(yōu)選包含這 樣的核酸序列，所述核酸序列的特征在于，其序列可以通過(guò)編碼具有如在SEQ ID N0s:2、5、 8、11、14、17、20、23、26、29、32、79、84、85或86任一項(xiàng)所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸 的至少一個(gè)核苷酸取代、添加和/或缺失衍生自SEQ ID N0s:l、4、7、10、13、16、19、22、25、 28、31、78或83任一項(xiàng)所示的上述特定核酸序列，由此變體核酸序列應(yīng)當(dāng)仍編碼具有如上 所定義的去飽和酶、KCS、KCR和LACS活性的多肽。變體還包括這樣的多核苷酸，其包含 能夠與上述特定核酸序列優(yōu)選在嚴(yán)格條件下雜交的核酸序列。這些嚴(yán)格條件為本領(lǐng)域技 術(shù)人員所知并可見于 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，N. Y. (1989)，6. 3. 1-6. 3. 6.中。嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選實(shí)例是在約45°C的6X氯化鈉/檸檬 酸鈉（=SSC)中的雜交條件，然后在50-65°C下在0. 2XSSC，0. 1% SDS中進(jìn)行一次或多次 洗滌步驟。技術(shù)人員知道根據(jù)核酸類型和例如當(dāng)存在有機(jī)溶劑時(shí)，在溫度和緩沖液濃度方 面，雜交條件不同。例如，在"標(biāo)準(zhǔn)雜交條件"下，在濃度為0.1至5XSSC(pH 7. 2)的水性 緩沖溶液中，溫度根據(jù)核酸類型而在42°C和58°C之間不同。如果上述緩沖液中存在有機(jī)溶 齊[J，例如50%甲酰胺，則標(biāo)準(zhǔn)條件下的溫度是大約42°C。對(duì)于DNA:DNA雜交體，雜交條件優(yōu) 選是0. 1 X SSC和20°C至45°C，優(yōu)選在30°C至45°C之間。對(duì)于DNA:RNA雜交體，雜交條件 優(yōu)選是0. 1XSSC和30°C至55°C，優(yōu)選在45°C至55°C之間。例如為長(zhǎng)度約100bp(=堿基 對(duì)），G+C含量為50%的核酸，在缺少甲酰胺的情況下確定上述雜交溫度。技術(shù)人員通過(guò)參 考教科書，例如上文提及的教科書或以下教科書知道如何確定所需的雜交條件：Sambrook 等，"Molecular Cloning"，Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 ;Hames 和 Higgins (編 輯）1985，"Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach，'，IRL Press at Oxford University Press, Oxford ;Brown(編輯）1991，"Essential Molecular Biology:A Practical Approach，'，IRL Press at Oxford University Press, Oxford?；蛘撸ㄟ^(guò)基 于PCR的技術(shù)，如基于混合的寡核苷酸引物的DNA擴(kuò)增，S卩，使用針對(duì)本發(fā)明多肽的保守結(jié) 構(gòu)域的簡(jiǎn)并引物，可以獲得多核苷酸變體。可以通過(guò)序列比較本發(fā)明多核苷酸的核酸序列 或多肽的氨基酸序列來(lái)鑒定本發(fā)明多肽的保守結(jié)構(gòu)域。在所附實(shí)施例中描述了適合作為 PCR引物的寡核苷酸以及合適的PCR條件。作為模板，可以使用來(lái)自細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物 的DNA或cDNA。此外，變體包括這樣的多核苷酸，所述多核苷酸包含與SEQ ID N0:l、4、7、 10、13、16、19、22、25、28、31、78或83任一項(xiàng)中所示的核酸序列具有至少50%、至少55%、 至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、 至少98%或至少99%同一性的核酸序列，優(yōu)選地，其編碼保留了如上所指定的去飽和酶、 KCS、KCR和LACS活性的多肽。此外，還包括這樣的多核苷酸，其包含編碼具有與SEQ ID NO :2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、79、84、85或86任一項(xiàng)中所示的氨基酸序列具有至 少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸序列，其中所述 多肽優(yōu)選保留了如上所指定的去飽和酶、KCS、KCR和LACS。優(yōu)選在整個(gè)氨基酸或核酸序列 區(qū)域上計(jì)算百分比同一性值。本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得基于多種算法的一系列程序用于比較 不同的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用已經(jīng)整合到EMBOSS軟件包（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P. , Longden,I.,和 Bleasby, A, Trends in Genetics 16 (6), 276-277, 2000)中的 needle 程序中的 Needleman 和 Wunsch 算法 (Needleman 1970, J. Mol. Biol. (48):444-453)，對(duì)遠(yuǎn)緣相關(guān)的蛋白質(zhì)，使用 BLOSUM 45 或 PAM250評(píng)分矩陣，或?qū)壪嚓P(guān)的蛋白質(zhì)，使用BLOSUM 62或PAM160評(píng)分矩陣，和16、14、 12、10、8、6或4的空位開放罰分和0. 5、1、2、3、4、5或6的空位延伸罰分確定兩條氨基酸 序列之間的百分比同一性?？梢栽趆ttp://emboss, sourceforge. net發(fā)現(xiàn)EMBOSS包的 本地安裝以及與WEB-Services連接的指導(dǎo)。使用needle程序用于比對(duì)兩條氨基酸序列 的參數(shù)的優(yōu)選非限制性實(shí)例是默認(rèn)參數(shù)，包括EBL0SUM62評(píng)分矩陣、10的空位開放罰分 和0. 5的空位延伸罰分。在又一優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用EMBOSS軟件包中的needle程序 (EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P. , Longden, I., 和 Bleasby, A, Trends in Genetics 16 (6), 276-277, 2000)，使用 EDNAFULL 評(píng)分矩陣和 16、 14、12、10、8、6或4的空位開放罰分和0. 5、1、2、3、4、5或6的空位延伸罰分確定兩條核苷 酸序列之間的百分比同一性。使用needle程序用于組合比對(duì)兩條核酸序列的參數(shù)的優(yōu)選 非限制性實(shí)例是默認(rèn)參數(shù)，包括EDNAFULL評(píng)分矩陣、10的空位開放罰分和0. 5的空位延伸 罰分。可以將本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列進(jìn)一步用作為"查詢序列"以對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 檢索，以例如鑒定其他家族成員或相關(guān)序列?？梢允褂肁ltschul等（Altschul 1990，J. Mol. Biol. 215:403-10)的BLAST系列程序（版本2. 2)進(jìn)行此類檢索?？梢岳肂LASTn、 BLASTx或tBLASTx程序使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行使用本發(fā)明的去飽和酶、KCS、KCR和LACS核酸 序列作為查詢序列的BLAST，以獲得與本發(fā)明的去飽和酶、KCS、KCR和LACS序列同源的核 苷酸序列（BLASTn、tBLASTx)或氨基酸序列（BLASTx)?？梢岳肂LASTp或tBLASTn程序 使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行使用本發(fā)明的去飽和酶、KCS、KCR和LACS蛋白質(zhì)序列作為查詢序列的 BLAST，以獲得與本發(fā)明的去飽和酶、KCS、KCR和LACS序列同源的氨基酸序列（BLASTp)或 核酸序列（tBLASTn)。為了獲得用于比較目的的空位比對(duì)，如在Altschul等（Altschul 1997, Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402)中所述，可以利用使用默認(rèn)參數(shù)的空位 BLAST。
[0082] 表1 :序列類型的關(guān)系：用于多種BLAST程序的查詢和命中序列的DNA或PRT (蛋 白質(zhì)）
[0083]
【權(quán)利要求】
1. δ-4去飽和酶多肽，其選自： a) 與SEQ ID NO. 79、86或85任一個(gè)的氨基酸序列具有至少60%的序列同一性的δ-4 去飽和酶多肽，其中所述序列優(yōu)選還包含 -選自"KHPGG"、" QHPGG"或" RHPGG" 的基序，優(yōu)選選自"KHPGGD "、" QHPG⑶"或" RHPG⑶" 的基序，和 -選自 "GLNIQHDXNHG" 或"HVVGHH" 的基序，優(yōu)選選自 "AAIGLNIQHDANHG" 或"QHVVGHH" 的基序，或 b) 具有氨基酸序列SEQ ID NO. 85和任選地一個(gè)或多個(gè)以下突變的δ-4去飽和酶多 肽：H4S、H4Y、H4Q、H4E、H4N、A5S、A5G、A5C、A5P、A5T、A5V、A6R、A6G、A6K、A6S、A6N、T7K、T7S、 T7R、T7N、T7A、T7G、K8E、K8D、K8R、K8Q、V9-、V9I、V9L、V9A、G10V、G10I、G10A、G10M、G10C、 G11S、G11N、G11D、G11A、G11K、D12-、S13-、D14A、D14V、D14I、D14E、D14G、D14P、P15A、P15G、 P15S、P15V、P15T、R18K、R18S、R18T、R18A、R18Q、D19A、D19G、D19P、D19S、L20-、K21-、M22A、 M22L、M22I、M22V、E23K、E23R、E23Q、H24Y、H24F、H24I、H24M、H24L、H24Q、H24R、H24V、F25Y、 F25W、F25I、F25A、S26T、S26A、S26C、S26G、S26N、Y27R、Y27F、E28T、E28D、E28N、E28S、R29K、 R29E、R29Q、R29D、I30K、I30L、I30V、L31A、L31I、N32D、N32G、N32H、N32S、N32T、N32R、N32K、 N32E、N32Q、N32A、N32V、D33H、D33N、D33T、E34T、E34N、E34D、E34Q、E34R、R35N、R35K、R35H、 D36P、D36E、D36N、D36S、D37E、D37K、L38I、L38V、L38M、L38F、L38Y、C39T、C39A、C39S、C39V、 V41L、V411、V41M、V41T、G42A、G42D、G42E、G44A、A48S、A48C、A48L、A48R、A48K、T49S、T49V、 T49N、T49P、T49K、T49A、A50C、A50N、A50G、D53E、D53N、K54Q、K54R、A59-、D60E、D60N、D60H、 F61Y、F61W、F61V、F61I、V62L、V62I、V62M、V62A、V62T、D63S、D63N、D63E、L64I、L64F、L64M、 G66P、R68Q、R68H、R68D、R68N、P72E、P72D、P72Q、H73G、H73A、H73N、H73S、F75W、F75M、F75Y、 E76Q、E76M、E76H、Y77F、Y77W、Y77H、Y77L、R79K、R79Q、R79H、R80H、R80K、R80Q、R80Y、R80N、 E81A、E81V、E81Q、E81L、E81P、W82G、W82S、P83D、P83V、P83K、P83A、P83T、P83E、P83Q、P83M、 P83L、P84K、P84R、A85S、A85G、A85C、A85T、A85P、A85V、V86I、V86L、V86M、V86R、V86A、V86T、 L87M、L87I、L87V、L87F、A88S、A88C、A88G、K89R、K89E、K89Q、K89P、K89N、Y90F、Y90W、K91F、 K91G、K91Y、K91L、K91W、L95I、L95V、L95M、D96A、D96E、D96G、D96P、R97K、R97P、R97Q、R97H、 R97E、R97A、D98E、D98N、D98S、D99E、D99Q、S100K、S100G、S100N、S100P、Y101F、Y101W、Y101H、 Y101P、V102T、V102I、V102L、Q103H、Q103E、Q103R、Q103N、Q103K、Q103D、Q103Y、H104A、 H104Y、H104V、H104I、H104F、H104R、D105E、D105P、D105T、S106P、S106E、S106A、S106D、 S106N、S106T、G107L、G107I、G107M、G107A、Y108H、Y108Q、Y108W、Y108M、Y108V、L109K、 L109M、L109I、L109V、R110Q、R110K、R110H、R110E、Lilli、L111F、C112G、C112A、C112N、 C112S、C112K、A113C、A113S、A113G、E114D、E114Q、E114P、E114S、E114K、E114A、N116R、 N116D、N116H、G117A、G117K、G117R、G117S、I118L、I118V、L119I、L119M、K121R、K121M、 K121Q、K121L、G122W、G122Q、G122N、S123E、S123D、S123N、S123G、G124W、G124A、G124N、 G125-、W126F、P129A、P129G、W131Y、W132Y、I133L、I133V、C136A、C136G、C136S、L138I、 L138V、L138M、L139I、L139V、L139M、V140A、V140I、V140L、V140C、V140M、A142T、A142P、 A142S、A142G、L143I、L143V、Y144F、Y144H、Y144W、Y144S、Y144T、L145I、L145V、L145M、 L145F、L145T、D146E、D146N、D146Q、Y147W、Y147F、Y147H、Y147G、Y148F、Y148H、Y148L、 M149W、M149L、M149I、M149F、L150I、L150V、A151L、A151C、A151G、A151S、R152K、R152S、 R152N、R152Q、R152D、P154K、P154E、P154R、I156L、I156V、L157F、L157I、L157M、L157Y、 L157W、L157P、A159S、A159G、A159C、A159T、A159P、A159V、I160V、I160L、I161V、I161L、 I161F、L162I、L162V、L162M、L162F、L162C、L162A、L162T、L162S、L165I、L165V、F166Y、 W168G、W168A、W168C、A181S、A181G、A181C、A181T、A181P、A181V、L182I、L182V、L182M、 N185H、N185Y、P186S、V187M、V187A、V187I、V187P、V188I、V188L、V188A、V188T、Y190R、 Y190H、Y190W、L191C、L191I、F192L、F192I、A195S、A195G、A195M、A195Q、A195K、S202N、 S202G、S202D、S202T、S202A、S202K、M203R、M203L、M203Q、M203I、M204L、M204V、M204I、 M204Q、M204C、L207I、L207V、Q208R、Q208E、Q208K、Q209E、Q209K、Q209R、Q209D、Q209H、 G213N、G213A、G213S、G213K、G213D、G213W、G213M、L216I、L216F、L216T、T218C、T218S、 T218V、T218A、T218N、T218P、D220E、D220N、D220R、D220G、I221V、I221F、I221Y、I221H、 D222N、D222Q、D222P、H223Y、H223F、H223Q、H223W、H223R、H223E、H223N、H223M、H223V、 H223P、H223I、H223L、H223D、H223A、V227I、V227L、V227M、V227A、V227T、V227Q、G229A、 G230H、G230N、G230D、G231S、G231N、G231A、A232V、A232T、A232I、A232G、L233I、L233V、 R234K、R234Q、R234N、R234E、R234H、R234T、K236S、K236G、K236A、K236T、P237K、P237D、 P237E、P237R、T238V、T238S、T238P、T238N、T238A、T238I、T238Y、D239S、D239G、D239E、 G240I、G240L、G240F、G240C、G240M、G240S、W241F、W241Y、W241P、L242M、L242I、L242V、 L242F、L242K、P243E、P243D、W244F、H246A、H246S、H246Y、H246G、H246N、L247I、L247V、 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R115N、W123G、W124F、W129Y、Y130W、I136L、L137I、D144E、Y145W、Y145F、W147M、I158V、 S160L、Y164F、S179A、I205L、C216T、R218D、S229G、T232R、R235P、P239W、Ε241Ρ、F242W、 V262I、V262L、D268E、M272W、Y274W、Κ278Ρ、L279I、Κ285Ρ、Ι289Ρ、I291V、R294K、V295L、 V295I、F298W、V304L、V304I、H309Q、F310P、Υ313Η、A323C、A325G、L327F、G330A、A342V、 Α342Ι、P346G、Ε347Ρ、A349G、Κ350-、W354F、S361T、C366G、K369W、Ι372Η、Y379F、Κ414Η、 G416P、D423G、Τ425Μ、F426L、Q428H、V429L、V429I、Α436Ρ、Υ438-、Ν439-、E440D。
2. 多核苷酸，其包含選自以下的核酸序列： a) 具有如 SEQ ID 勵(lì)8:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、78或83中所示的核苷酸序 列的核酸序列， b) 編碼具有如 SEQ ID N0s:2、5、8、ll、14、17、20、23、26、29、32、79、84、85 或 86 中所示 的氨基酸序列的多肽或權(quán)利要求1的多肽的核酸序列， c) 與a)或b)的核酸序列具有至少70%同一性的核酸序列，其中所述核酸序列編碼具 有去飽和酶、酮?；?CoA合酶（KCS)或酮?；?CoA還原酶（KCR)或溶血磷脂-輔酶A合 酶（LACS)活性的多肽， d) 核酸序列，其編碼具有去飽和酶、酮?；?CoA合酶（KCS)、酮?；?CoA還原酶（KCR) 或溶血磷脂-輔酶A合酶（LACS)活性并具有與a)-c)任一項(xiàng)的氨基酸序列具有至少60% 同一性的氨基酸序列的多肽；和 e) 能夠在嚴(yán)格條件下與a)_d)任一項(xiàng)雜交的核酸序列，其中所述核酸序列編碼具有去 飽和酶、酮?；?CoA合酶（KCS)、酮?；?CoA還原酶（KCR)或溶血磷脂-輔酶A合酶（LACS) 活性的多肽。
3. 權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述多核苷酸還包含有效連接所述核酸序列的表達(dá)控 制序列。
4. 權(quán)利要求2或3的多核苷酸，其中所述多核苷酸還包含有效連接所述核酸序列的終 止序列。
5. 載體，其包含權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的多核苷酸。
6. 宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的多核苷酸或權(quán)利要求5的載體或表達(dá)權(quán)利 要求1的異源δ -4去飽和酶。
7. 制造權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的多核苷酸編碼的多肽的方法，其包括 a) 在允許產(chǎn)生所述多肽的條件下培育權(quán)利要求5的宿主細(xì)胞；和 b) 從步驟a)的宿主細(xì)胞獲得所述多肽。
8. 多肽，其由權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的多核苷酸編碼或可通過(guò)權(quán)利要求7的方法獲得。
9. 非人轉(zhuǎn)基因生物，其包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的多核苷酸或可通過(guò)權(quán)利要求7的方 法獲得。
10. 權(quán)利要求9的非人轉(zhuǎn)基因生物，其是植物、植物部分或植物種子。
11. 用于制造多不飽和脂肪酸的方法，其包括： a) 在允許在所述宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的條件下培育權(quán)利要求6的宿主細(xì) 胞；和 b) 從所述宿主細(xì)胞獲得所述多不飽和脂肪酸。
12. 用于制造多不飽和脂肪酸的方法，其包括： a) 在允許在所述宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的條件下培育權(quán)利要求9或10的非 人轉(zhuǎn)基因生物；和 b) 從所述非人轉(zhuǎn)基因生物獲得所述多不飽和脂肪酸。
13. 權(quán)利要求11或12的方法，其中所述多不飽和脂肪酸是花生四烯酸（ARA)、二十碳 五烯酸（EPA)或二十二碳六烯酸（DHA)。
14. 用于制造油、脂類或脂肪酸組合物的方法，其包括權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法的 步驟和將多不飽和脂肪酸配制為油、脂類或脂肪酸組合物的其他步驟，其中優(yōu)選地所述油、 脂類或脂肪酸組合物用于飼料、食品、化妝品或藥物。
15. 油，其包含可通過(guò)權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法獲得的多不飽和脂肪酸。
16. 篩選δ-4去飽和酶基因的方法，其包括步驟 a) 從屬于Ichthyosporea或定鞭藻綱的分類等級(jí)，優(yōu)選魚孢霉目或Pavlovales目， 更優(yōu)選 Anurofeca、Creolimax、Ichthyophonus、Pseudoperkinsus、Psorospermium 或 Sphaeroforma屬的生物提取遺傳物質(zhì)， b) 將所述遺傳物質(zhì)與編碼如上文或下文定義的本發(fā)明的δ-4去飽和酶的至少10個(gè)， 優(yōu)選至少20個(gè)連續(xù)氨基酸的核酸在嚴(yán)格條件下雜交，和 c) 檢測(cè)雜交或雜交的缺失。
【文檔編號(hào)】A01H1/00GK104520313SQ201380040953
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年7月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月3日
【發(fā)明者】L·馬蒂, T·森杰 申請(qǐng)人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司